黃金枝，俞燕芳*，胡桂萍，石旭平，杜賢明，王軍文，鄧真華，曾萍芳

1(江西省蠶桑茶葉研究所，江西 南昌，330202)2(江西省經(jīng)濟(jì)作物研究所，江西 南昌，330202) 3(江西省蠶桑工程技術(shù)研究中心，江西 南昌，330202)

桑葉在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被譽(yù)為“神仙葉”[1]，桑葉中含有生物堿、多酚、黃酮、多糖等多種活性成分[2]，具有降三高、抗病毒、預(yù)防衰老等多種療效，享有“人參熱補(bǔ)，桑葉清補(bǔ)”的美譽(yù)[3-6]。近年來，隨著人們生活水平的提高，人們更加注重飲食健康，桑葉作為藥食同源農(nóng)產(chǎn)品之一，其開發(fā)的產(chǎn)品也深受人們的喜愛。目前關(guān)于桑葉藥食用方面的報(bào)道逐年增加，但是桑葉的成分及含量受桑樹品種、生長環(huán)境、桑葉部位等影響較大[7]。曾衛(wèi)湘等[8]研究了53份桑種質(zhì)桑葉的藥用品質(zhì)，測定了多糖、1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)和總黃酮的含量，結(jié)果表明不同品種間多糖、DNJ和總黃酮含量存在一定的差異。敬成俊等[9]研究了10份不同地理來源桑種質(zhì)資源冬桑葉中的營養(yǎng)與活性成分含量，發(fā)現(xiàn)不同地理來源的桑葉中蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、黃酮、多酚和γ-氨基丁酸含量存在著顯著差異。

江西省蠶桑茶葉研究所多年來收集和保存150多份國內(nèi)外不同品種的桑樹資源，并建立了桑樹種質(zhì)資源圃，其中多數(shù)品種的綜合利用價值尚未進(jìn)行有效成分評估。本次試驗(yàn)共采集30個桑品種的桑葉，測定并分析了多酚、黃酮、多糖、蛋白質(zhì)、1-脫氧野尻霉素、主要酚類物質(zhì)，為建立江西省桑樹種質(zhì)資源生化成分?jǐn)?shù)據(jù)庫奠定基礎(chǔ)，同時為綜合評估桑樹種質(zhì)資源的利用價值以及深入研究和開發(fā)桑資源提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采用的桑品種分別為修水青皮桑、白皮桑、富陽桑、鐵葉魯桑、白皮火桑、紅皮大種、泰和毛桑、白皮大種、伍村2號、一之瀨、修短大早桑、渣蓮2號、育151、全豐2號、烏皮桑、越南桑、睦州青、望海桑、劍持桑、皺皮荷葉白、荷葉大種、豆腐皮、大十、湘7920、九紋龍、修水實(shí)生桑、白皮湖桑、麻皮桑、大墨斗、嘉定204，栽植于江西省蠶桑茶葉研究所桑樹種質(zhì)資源圃，每個品種隨機(jī)采摘3份，采于2019年5月29日，取1年生枝條6～15位的新鮮葉片，將桑葉迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行干燥處理，60 ℃烘干，粉碎，過60目篩，分裝于不同的自封袋。

沒食子酸、蘆丁、DNJ標(biāo)準(zhǔn)品、芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)、綠原酸、異槲皮素、紫云英苷(astragalin,AG),上海阿拉丁生化科技有限公司；乙醇、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、NaNO2、Al(NO4)3、NaOH、Na2CO3、福林酚、HCl、硼酸、硼酸鉀、甘氨酸、醋酸、甲基紅、溴甲酚綠、亞甲基藍(lán)(分析純),西隴化工股份有限公司；乙腈、甲醇、甲酸(色譜純),德國默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260II高效液相色譜,美國安捷倫公司；UV-2600紫外分光光度計(jì),日本島津公司；KQ2200E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；海能K9860全自動凱氏定氮儀、SH220F石墨消解儀,海能儀器股份有限公司；HH恒溫水浴鍋,金壇市中大儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海添時科學(xué)儀器有限公司；水分儀,美國奧豪斯儀器有限公司；ST16R1臺式高速冷凍離心機(jī),北京聯(lián)合科力科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多酚含量測定

多酚提取方法參照黃金枝等[10]方法，并稍作修改。測定方法采用Folin-ciocalteu比色法[11-12]，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚的含量(y=0.373 8x+0.048 5，R2=0.999 2)。

1.3.2 黃酮含量測定

提取方法同1.3.1。測定方法采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮含量(y=1.458 6x-0.016 7，R2=0.999)[13]。

1.3.3 多糖含量測定

稱取桑葉粉0.1 g于250 mL錐形瓶中，加入沸水80 mL，沸水浴1 h，過濾，濾液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，定容。測定方法采用苯酚-硫酸法[14]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量(y=0.057 8x+0.001 1，R2=0.997)。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測定

參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》。

1.3.5 DNJ含量測定

DNJ提取、柱前衍生及測定方法參照俞燕芳等[15]方法，稍作修改。以DNJ的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得DNJ的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程(y=3.495x+2.114，R2=0.999 9)。

1.3.6 桑葉酚類化合物含量測定

采用高效液相色譜法，參照俞燕芳等[15]方法，稍作修改。

液相色譜條件為：Agilent Eclipse XBD-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液，流動相B為乙腈，流速為0.8 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)椋?～20 min，5%～15%B；20～50 min，15%～35%B；50～60 min，35%～50%B；60～65 min，50%～100%B；每個程序后運(yùn)行5 min。紫外檢測器，檢測波長360 nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

用Excel、GraphPad Prism 5和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均用重復(fù)試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種間多酚含量的變化

由圖1可知，不同品種間多酚含量的變化存在著顯著性差異，多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)在15.98～150.30 mg/g之間，其中劍持桑中多酚含量最高，為150.30 mg/g；伍村2號中多酚含量最低，為15.98 mg/g；劍持桑中多酚含量是伍村2號的9.41倍。多酚類物質(zhì)具有清除自由基和消除自由基毒性作用，在抗衰老、抗輻射、防治腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面也具有生物學(xué)功效[16]，劍持?？梢宰鳛槎喾宇惖乃幨钞a(chǎn)品開發(fā)原材料。

1-修水青皮桑；2-白皮桑；3-富陽桑；4-鐵葉魯桑；5-白皮火桑；6-紅皮大種；7-泰和毛桑；8-白皮大種；9-伍村2號；10-一之瀨；11-修短大早桑；12-渣蓮2號；13-育151；14-全豐2號；15-烏皮桑；16-越南桑；17-睦州青；18-望海桑；19-劍持桑；20-皺皮荷葉白；21-荷葉大種；22-豆腐皮；23-大十；24-湘7920；25-九紋龍；26-修水實(shí)生桑；27-白皮湖桑；28-麻皮桑；29-大墨斗；30-嘉定204(下同)

2.2 不同品種間黃酮含量的變化

黃酮類物質(zhì)是桑葉發(fā)揮功效的主要活性成分之一，具有多種生物學(xué)功能[17-19]。桑樹是黃酮類物質(zhì)含量較高的樹種之一，其含量受桑樹品種、生長環(huán)境、桑葉部位等影響。由圖2可知，不同品種間黃酮含量的變化存在著顯著性差異，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在9.60～40.17 mg/g之間，其中越南桑中黃酮含量最高，為40.17 mg/g；白皮火桑中黃酮含量最低，為9.60 mg/g；越南桑中黃酮含量是白皮火桑中的4.18倍。越南?？梢宰鳛辄S酮類的藥食產(chǎn)品開發(fā)原材料。

圖2 不同品種間黃酮含量的變化

2.3 不同品種間多糖含量的變化

桑葉多糖是桑葉的主要功能活性成分之一，具有多種生物學(xué)活性，如降血脂血糖和抗氧化，在醫(yī)藥和食品方面應(yīng)用廣泛[20]。由圖3可知，不同品種間多糖含量的變化存在顯著性差異，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在139.21～317.64 mg/g之間，其中嘉定204中多糖含量最高，為317.64 mg/g；大墨斗中多糖含量最低，為139.21 mg/g；嘉定204中多糖含量是大墨斗中的2.28倍。嘉定204可以作為多糖類的藥食產(chǎn)品開發(fā)原材料。

圖3 不同品種間多糖含量的變化

2.4 不同品種間蛋白質(zhì)含量變化

蛋白質(zhì)是桑葉化學(xué)成分的主成分之一，占干物質(zhì)含量的25%左右，通常作為判斷葉質(zhì)的指標(biāo)[21]。由圖4可知，不同品種間蛋白質(zhì)含量的變化存在著顯著性差異，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在15.94～22.73 g/100 g之間，其中全豐2號中蛋白質(zhì)含量最高，為22.73 g/100 g；白皮桑中蛋白質(zhì)含量最低，為15.94 g/100 g；全豐2號中蛋白質(zhì)含量是白皮桑中的1.43倍。全豐2號可以作為蛋白質(zhì)類的藥食產(chǎn)品開發(fā)原材料。

圖4 不同品種間蛋白質(zhì)含量的變化

2.5 不同品種間DNJ含量的變化

桑葉中的主要功能活性物質(zhì)之一——DNJ，對小腸中的α-葡糖苷酶活性具有很強(qiáng)的競爭性抑制作用[22]。由圖5可以看出，不同品種間DNJ含量的變化存在著顯著性差異，DNJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5.90～24.58 mg/g之間，其中全豐2號中DNJ含量最高，為24.58 mg/g；九紋龍中DNJ含量最低，為5.90 mg/g；全豐2號中DNJ含量是九紋龍中的4.17倍。全豐2號可以作為DNJ類的藥食產(chǎn)品開發(fā)原材料。

圖5 不同品種間DNJ含量的變化

2.6 不同品種間酚類組成及成分含量的變化

圖6為混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)和越南桑桑葉樣品(B)的酚類物質(zhì)HPLC圖譜。通過標(biāo)準(zhǔn)品對照和參考文獻(xiàn)[23-24]，鑒定出桑葉樣品中6種酚類化合物。綠原酸、蘆丁、異槲皮素和紫云英苷(AG)是以相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，槲皮素-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷(QMG)及山奈酚-3-O-丙二?；?葡萄糖苷(KMG)分別以異槲皮素和紫云英苷為參照計(jì)算含量。酚類組成及含量變化如表1所示。

由表1可以看出，綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.03～1.46 mg/g之間，其中伍村2號綠原酸含量最低，越南桑中綠原酸含量最高；蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.12～1.31 mg/g之間，其中伍村2號中蘆丁含量最低，越南桑中蘆丁含量最高；異槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.15～1.35 mg/g之間，其中伍村2號中異槲皮素含量最低，越南桑中異槲皮素含量最高；槲皮素-3-O-丙二?；?葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.17～1.59 mg/g之間，其中伍村2號中QMG含量最低，荷葉大種中QMG含量最高；紫云英苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.44～0.86 mg/g之間，伍村2號中AG含量最低，劍持桑中AG含量最高；山奈酚-3-O-丙二?；?葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.43～1.25 mg/g之間，其中大十中KMG含量最低，修水青皮桑中KMG含量最高。

1-綠原酸；2-蘆??；3-異槲皮素；4-槲皮素-3-O-丙二?；?葡萄糖苷；5-紫云英苷；6-山奈酚-3-O-丙二酰基-葡萄糖苷

表1 不同品種間酚類化合物含量的變化 單位：mg/g

續(xù)表1

序號綠原酸蘆丁異槲皮素QMGAGKMG91.03±0.090.12±0.010.15±0.010.17±0.010.44±0.020.46±0.03101.28±0.120.26±0.020.28±0.010.55±0.030.60±0.040.80±0.07111.15±0.060.32±0.010.48±0.031.01±0.040.60±0.020.73±0.05121.21±0.070.47±0.030.57±0.021.32±0.090.68±0.050.91±0.04131.29±0.050.42±0.020.65±0.041.54±0.110.74±0.031.11±0.09141.09±0.080.16±0.010.21±0.010.29±0.020.47±0.030.49±0.02151.17±0.110.25±0.010.44±0.030.89±0.070.61±0.030.73±0.05161.46±0.121.31±0.101.35±0.070.72±0.030.79±0.040.46±0.02171.22±0.090.38±0.020.33±0.011.06±0.070.70±0.050.98±0.03181.17±0.040.26±0.010.44±0.030.79±0.050.62±0.020.74±0.04191.31±0.020.72±0.31.21±0.080.51±0.030.86±0.020.46±0.02201.25±0.050.26±0.010.30±0.010.62±0.030.60±0.020.78±0.04211.29±0.110.40±0.020.70±0.031.59±0.070.77±0.011.01±0.05221.21±0.050.34±0.020.43±0.010.80±0.050.63±0.020.87±0.03231.23±0.050.50±0.010.68±0.040.31±0.010.67±0.030.43±0.02241.24±0.070.25±0.010.42±0.010.97±0.050.64±0.030.87±0.02251.22±0.030.39±0.010.54±0.051.05±0.030.72±0.020.99±0.03261.22±0.020.28±0.020.41±0.010.73±0.030.62±0.050.77±0.02271.25±0.060.31±0.030.52±0.020.72±0.050.60±0.030.68±0.02281.25±0.020.36±0.010.39±0.021.03±0.030.67±0.050.90±0.07291.21±0.070.42±0.020.56±0.011.01±0.050.69±0.010.94±0.03301.23±0.080.42±0.010.64±0.031.02±0.050.71±0.020.88±0.04

2.7 不同品種間各成分相關(guān)性

為了全面分析各指標(biāo)間是否存在相關(guān)性，對不同品種間多酚、黃酮、多糖、蛋白質(zhì)、DNJ、綠原酸、蘆丁、異槲皮素、QMG、AG、KMG進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表2所示。

表2 不同品種間各成分相關(guān)性

注：**在0.1水平上顯著相關(guān)；*在0.05水平上顯著相關(guān)

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法、凱氏定氮法、紫外分光光度法和相關(guān)性分析法對桑葉的多酚、黃酮、多糖、蛋白質(zhì)、DNJ及主要酚類物質(zhì)進(jìn)行測定分析，結(jié)果表明，不同桑品種桑葉營養(yǎng)及活性成分存在一定的差異。桑葉的品質(zhì)是由多個因素綜合來評價，僅由某一個或者幾個成分很難全面客觀地判斷出桑葉的真實(shí)品質(zhì)，并且各品質(zhì)指標(biāo)間既是相互獨(dú)立的，又有相互作用的。桑葉的營養(yǎng)品質(zhì)主要體現(xiàn)在多酚、多糖、黃酮、蛋白質(zhì)和DNJ等多種營養(yǎng)與生物活性成分的組分和含量上，但不是針對某一特定的用途開展研究，且得出的結(jié)論也不同[25-27]。

通過研究發(fā)現(xiàn)，不同品種間桑葉多酚、黃酮、多糖、蛋白質(zhì)、DNJ及主要酚類物質(zhì)含量相差較大。對多酚、黃酮、蛋白質(zhì)、多糖、DNJ和主要酚類物質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)各指標(biāo)間具有一定的相關(guān)性。經(jīng)評價分析，篩選出劍持桑、越南桑、嘉定204、全豐2號、荷葉大種和修水青皮桑等6份桑葉藥食用優(yōu)勢資源。梁秋貴等[28]測定了廣西蠶區(qū)21個桑樹品種的蛋白質(zhì)、多酚、黃酮、DNJ多糖、綠原酸、蘆丁槲皮素等含量，發(fā)現(xiàn)各指標(biāo)間存在著一定的相關(guān)性。其中蛋白質(zhì)為影響桑葉營養(yǎng)品質(zhì)的主要指標(biāo)，多酚、多糖、黃酮、DNJ主要影響桑葉的保健品質(zhì)。生產(chǎn)上可以根據(jù)桑葉的飼用性、食用性以及藥用性選擇不同品種的桑葉作為原料，使得桑葉功能性成分的利用效果達(dá)到最佳。