張熙，李國(guó)輝，周勝虎，毛銀，趙運(yùn)英*，鄧禹*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

己二酸是一種具有高附加值的化學(xué)品，主要被應(yīng)用于合成尼龍6,6的前體，后者是一種性能優(yōu)良的紡織材料，可運(yùn)用在防火系統(tǒng)、宇航制品等先進(jìn)領(lǐng)域[1]。盡管全球經(jīng)濟(jì)不景氣，己二酸的市場(chǎng)規(guī)模保持了每年約3.7%～5%的復(fù)合增長(zhǎng)率，預(yù)計(jì)在2019年達(dá)到75億美元[2]。目前，己二酸的生產(chǎn)主要以石油來(lái)源的環(huán)己醇和環(huán)己酮為原料[3-4]。在生產(chǎn)過(guò)程中，反應(yīng)條件十分劇烈，并隨著硝酸的氧化作用釋放出大量的氮氧化物，產(chǎn)生巨大的環(huán)境壓力[5]。另外，面對(duì)日益枯竭的石油資源，己二酸替代生產(chǎn)方案的挖掘勢(shì)在必行[6]。2004年，美國(guó)能源部發(fā)布了一份包含10種“最具價(jià)值的生物基化學(xué)品名單”，己二酸位列其中[7]。

近年來(lái)，微生物代謝工程的發(fā)展使低成本、高效率的生物轉(zhuǎn)化逐漸獲得青睞。在2015年，己二酸首次在重組大腸桿菌中合成，主要使用了內(nèi)源β-ketoadipyl-CoA thiolase(PaaJ)、來(lái)源于Ralstoniaeutropha的 3-hydroxyacyl-CoA reductase(PaaH1)和enoyl-CoA hydratase(Ech)、來(lái)源于Euglenagracilis的trans-enoyl-CoA reductase(Ter)、來(lái)源于Clostridiumacetobutylicum的 butyryl kinase(Buk1)和phosphate butyryltransferase(Ptb)[8]。然而，這條基于“逆向β-氧化”設(shè)計(jì)的途徑，產(chǎn)量只有0.6 mg/L；通過(guò)一系列基因敲除(ΔldhA, ΔpoxB, Δpta, ΔadhE, ΔsucD)，己二酸的產(chǎn)量被提高到了2.5 g/L[9]。另外，基于其他途徑如逆β-then-ω氧化途徑、2氧代庚二酸途徑、2氧代己二酸途徑、賴氨酸途徑等均被嘗試，并沒(méi)有得到良好的效果[10-11]。

鄧禹等[12-13]在T.fuscaB6 突變株中發(fā)現(xiàn)了一條可以天然合成己二酸的合成途徑，被命名為T(mén)fu己二酸逆降解途徑。系統(tǒng)分析結(jié)果表明，己二酸是由乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A縮合，并經(jīng)歷5步反應(yīng)得到——β-ketothiolase(Tfu_0875)、3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase(Tfu_2399)、3-hydroxyadipyl-CoA dehydrogenase(Tfu_0067)、5-carboxy-2-pentenoyl-CoA reductase(Tfu_1647)和adipyl-CoA synthetase(Tfu_2576-7)(圖1)。但考慮到T.fusca遺傳背景不清晰、基因操作工具少，該課題組將Tfu己二酸逆降解途徑導(dǎo)入大腸桿菌，并將乳酸、丁酸和乙酸等途徑進(jìn)行敲除或弱化，以甘油為碳源實(shí)現(xiàn)了68 g/L己二酸的產(chǎn)量，為目前已報(bào)道的最高值[14]。

圖1 Tfu己二酸逆降解代謝途徑

大腸桿菌等細(xì)菌在生產(chǎn)有機(jī)酸時(shí)需要將pH控制在中性，需要補(bǔ)加大量的堿對(duì)發(fā)酵環(huán)境進(jìn)行中和，極大地增加了發(fā)酵生產(chǎn)成本；另外，在高底物或產(chǎn)物濃度環(huán)境中，大腸桿菌等細(xì)菌由于其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的原因，耐受性較差，因此在二元羧酸的生產(chǎn)中，釀酒酵母成為了一個(gè)更優(yōu)良的選項(xiàng)。釀酒酵母是一種具有高抗逆性、高酸耐受性和高底物耐受性的真核模式菌株，并以其相對(duì)清楚的基因背景，成為有機(jī)酸發(fā)酵生產(chǎn)中常用宿主。以蘋(píng)果酸和丁二酸為代表的二元羧酸均以重組釀酒酵母獲得了較高的產(chǎn)量，分別達(dá)到 59和 43 g/L[15-16]。

近年來(lái)，在葡萄糖二酸、黏糠酸等高附加值六碳二元羧酸的研究中，酵母也體現(xiàn)出了更加明顯的優(yōu)勢(shì)：本課題組在釀酒酵母平臺(tái)中構(gòu)建葡萄糖二酸生物合成途徑，實(shí)現(xiàn)了6 g/L 的目標(biāo)物產(chǎn)量[17]；LEAVITT等[18]在釀酒酵母平臺(tái)中實(shí)現(xiàn)了2.1 g/L 黏糠酸的產(chǎn)量。有關(guān)己二酸在釀酒酵母平臺(tái)的生產(chǎn)報(bào)道較少，僅有一個(gè)課題組報(bào)道：該課題組在LEAVITT等研究的黏糠酸生產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，加入了微生物 enoate reductases(ERs)，并通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化由葡萄糖實(shí)現(xiàn)了2.59 mg/L 己二酸的產(chǎn)量[19]?；谀壳搬劸平湍钙脚_(tái)較低的己二酸產(chǎn)量及細(xì)菌類平臺(tái)的耐酸性問(wèn)題，本研究將Tfu己二酸逆降解途徑首次導(dǎo)入釀酒酵母平臺(tái)，探索該途徑在釀酒酵母體系中的應(yīng)用潛力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究中使用的菌株和質(zhì)粒見(jiàn)表1。

表1 菌株和質(zhì)粒

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母抽提物。若需要固體培養(yǎng)基，添加20 g/L 瓊脂粉。

LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母抽提物, 10 g/L NaCl。若需要固體培養(yǎng)基，添加20 g/L 瓊脂粉。

SD培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，5 g/L(NH4)2SO4，1.7 g/L YNB，加入適量必需氨基酸。若需要固體培養(yǎng)基，添加20 g/L 瓊脂粉。若需要缺陷型培養(yǎng)基，則再去掉某種缺陷標(biāo)記氨基酸的添加。

1.1.3 儀器和試劑

PCR儀，美國(guó)Bio-red；高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫；MALDI SYNAPT Q-TOF MS液相-質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters；5 L發(fā)酵罐，中國(guó)迪必爾；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)賽默飛；電泳儀，中國(guó)六一。

DNA聚合酶Prime Star Max，日本寶生物；DNA連接酶，中國(guó)生工；Gibson 組裝試劑，美國(guó)NEB；限制性內(nèi)切酶，日本寶生物；DNA純化試劑盒及質(zhì)粒小量抽提試劑盒，中國(guó)生工。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 儀器和試劑

Tfu己二酸逆降解途徑共涉及5步反應(yīng)，6個(gè)基因，分別為T(mén)fu_0875、Tfu_2399、Tfu_0067、Tfu_1647、Tfu_2576、Tfu_2577。從上獲取到基因序列，并在http://sg.idtdna.com/CodonOpt網(wǎng)站上進(jìn)行密碼子優(yōu)化，送往蘇州泓訊進(jìn)行基因合成?；蚝铣稍?個(gè)T載體上，得到載體pUCmT-0875-2399、pUCmT-0067-1647和pUCmT-2576-2577，通過(guò)引物0875-F/R、2399-F/R、0067-F/R、1647-F/R、2576-F/R、2577-F/R進(jìn)行擴(kuò)增后得到基因片段T-0875、T-2399、T-0067、T-1647、T-2576和T-2577，純化后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。本研究中使用的引物序列見(jiàn)表2。

1.2.2 表達(dá)Tfu途徑酶質(zhì)粒的構(gòu)建

按順序分別將6個(gè)途徑酶基因搭配不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、啟動(dòng)子和終止子，得到穿梭質(zhì)粒P1-V1、P2-V1和P3-V1。以釀酒酵母BY4741的gDNA為模板，用引物CN9847-1-AF/R、CN9847-1-BF/R、CN9847-1-DF/R、CN9847-1-EF/R、CN9847-1-GF/R分別擴(kuò)增基因片段Tcyc1-1、Ttef1-1、Ptef1-1、Pgpd1-1、Ttdh2-1，與基因片段T-0875、T-2399按照?qǐng)D2-a順序進(jìn)行Gibson組裝，各個(gè)片段全長(zhǎng)連接至T載體，得到中間構(gòu)建pUCmT-Tfu_0875-Tfu_2399，命名為P1；將中間構(gòu)建體pUCmT-Tfu_0875-Tfu_2399與質(zhì)粒pRS423(His)使用XhoI與SacI雙酶切，再用T4DNA連接酶連接得到重組質(zhì)粒pRS423-Tfu_0875-Tfu_2399，命名為P1-V1(圖2-b)。以釀酒酵母BY4741的gDNA為模板，用引物CN9847-2-AF/R、CN9847-2-BF/R、CN9847-2-DF/R、CN9847-2-EF/R、CN9847-2-GF/R分別擴(kuò)增基因片段Ttdh2-2、Tadh1-2、Padh1-2、Ppgk1-2、Tpgk1-2，與基因片段T-0067、T-1647按照?qǐng)D2-a順序進(jìn)行Gibson組裝，各個(gè)片段全長(zhǎng)連接至T載體，得到中間構(gòu)建體pUCmT-Tfu_0067-Tfu_1647，命名為P2；將中間構(gòu)建體pUCmT-Tfu_0067-Tfu_1647與質(zhì)粒pHAC181(Leu)使用NdeI與EcoR I雙酶切，再用T4DNA連接酶連接得到重組質(zhì)粒pHAC181-Tfu_0067-Tfu_1647，命名為P2-V1(圖2-b)。以獲得的釀酒酵母BY4741的gDNA為模板，用引物CN9847-3-AF/R、CN9847-3-BF/R、CN9847-3-DF/R、CN9847-3-EF/R、CN9847-3-GF/R分別擴(kuò)增基因片段Tpgk1-3、Ttpi1-3、Ptpi1-3、Ptdh3-3、Tfab1-3，與基因片段T-2576、T-2577按照?qǐng)D2-a順序進(jìn)行Gibson組裝，各個(gè)片段全長(zhǎng)連接至T載體，得到中間構(gòu)建體pUCmT-Tfu_2576-Tfu_2577，命名為P3；將中間構(gòu)建體pUCmT-Tfu_2576-Tfu_2577與質(zhì)粒Y42(Ura3)使用BamH I與EcoR I雙酶切，再用T4DNA連接酶連接得到重組質(zhì)粒Y42-Tfu_2576-Tfu_2577，命名為P3-V1(圖2-b)。

表2 引物序列

注：下劃線表示同源臂序列

a-途徑構(gòu)建；b-質(zhì)粒圖譜

1.2.3 釀酒酵母LSC1基因的敲除

以pUG6質(zhì)粒為模板，用引物ΔLSC1-pUG6-F/R擴(kuò)增LoxP-KanMX-LoxP片段；以釀酒酵母gDNA模板，用引物L(fēng)SC1-Upstream-F/R和LSC1-Downstream-F/R分別擴(kuò)增LSC1基因上下游500 bp的片段。以O(shè)E-PCR方法將上述片段融合，得到LSC1基因敲除框。

以融合得到的敲除框?yàn)槟０?，用引物L(fēng)SC1-Upstream-F和LSC1-Downstream-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到高濃度敲除框，純化后轉(zhuǎn)化釀酒酵母BY4741進(jìn)行基因敲除篩選。具體的轉(zhuǎn)化方法如下：將釀酒酵母BY4741活化后，在1 mL YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(OD600值為0.6～1.0)，5 000 r/min離心得到菌體，用雙蒸水洗2次，并用0.1 mol/L LiAc洗2次，棄上清液，按順序加入240 μL體積分?jǐn)?shù)50% PEG、36 μL 1 mol/L LiAc、20 μL ssDNA(10 mg/mL, 沸水浴5 min)、4 μg 敲除框DNA。在振蕩器混合30 s后置于30 ℃金屬浴1 h，轉(zhuǎn)移至42 ℃熱激40 min，5 000 r/min離心，用雙蒸水洗2次后涂布YPD-G418平板，培養(yǎng)2～3 d。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取基因組，用引物ΔLSC1-verify-F/R進(jìn)行驗(yàn)證。得到的正確菌株命名為BY4741ΔLSC1。

1.2.4 Tfu途徑釀酒酵母菌株的構(gòu)建

將構(gòu)建得到的穿梭質(zhì)粒P1-V1、P2-V1和P3-V1轉(zhuǎn)化至BY4741野生型和BY4741ΔLSC1菌株中。具體轉(zhuǎn)化方法如下：將釀酒酵母BY4741或BY4741ΔLSC1活化后，在1 mL YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，5 000 r/min離心得到菌體，用雙蒸水洗2次，棄上清液，在體系中按順序加入160 μL體積分?jǐn)?shù)50% PEG、50 μL 1 mol/L LiAc、10 μL ssDNA(10 mg/mL, 沸水浴5 min)、20 μL體積分?jǐn)?shù)100% DTT，待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒各2 μg。在振蕩器混合30 s后置于42 ℃熱激45 min，5 000 r/min離心，用雙蒸水洗2次后涂布SD-Leu-His-Ura平板，培養(yǎng)2～3 d。得到的菌株分別命名為AA-1和AA-3。

1.2.5 Tfu途徑釀酒酵母菌株的發(fā)酵和樣品處理

將構(gòu)建得到的菌株AA-1和AA-3在SD-Leu-His-Ura平板上活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接至SD-Leu-His-Ura液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，按照最終OD600=0.5的接種量接種至YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃、250 r/min條件下發(fā)酵。每12 h 取樣0.5 mL，樣品經(jīng)5 000 r/min離心，得到發(fā)酵上清液；菌體用雙蒸水洗2次后補(bǔ)齊至EP管0.5 mL刻度線，加入與菌體量相當(dāng)?shù)牟Ａе椋谡袷幤魃险袷? min，冰浴1 min，循環(huán)6次，12 000 r/min離心10 min，上清液即為菌體破碎液。將發(fā)酵上清液和菌體破碎液進(jìn)入后續(xù)的高效液相色譜儀或液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)。

1.2.6 樣品的分析與檢測(cè)

液相色譜分析方法：將處理后的發(fā)酵樣品，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，上HPX-87H有機(jī)酸柱(Bio-red)，流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速 0.6 mL/min，柱溫30 ℃。

液相質(zhì)譜分析方法：將處理后的發(fā)酵樣品，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾。質(zhì)譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm)，檢測(cè)器為Waters Acquity PDA detector(200～400 nm)。流動(dòng)相A，體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸；流動(dòng)相B，體積分?jǐn)?shù)100% MeOH；流速，0.3 mL/min，梯度洗脫，柱溫，45 ℃。質(zhì)譜檢測(cè)條件：等度洗脫；電噴霧電離正離子源(ESI+)；毛細(xì)管電壓3.5 kV；錐孔電壓30 V；離子源溫度100 ℃；去溶劑氣溫度400 ℃；去溶劑氣流速700 L/h；錐孔氣流速50 L/h；電離能量6 eV；MS質(zhì)量范圍(m/z)20～2 000；檢測(cè)器電壓1 800 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)Tfu途徑的菌株構(gòu)建

通過(guò)外源基因和不同啟動(dòng)子、終止子搭配的方式構(gòu)建得到的3個(gè)重組穿梭質(zhì)粒，使用驗(yàn)證引物pRS423-veri-F/R、pHAC181-veri-F/R和Y42-veri-F/R分別進(jìn)行PCR，得到正確的條帶如圖3所示，PCR產(chǎn)物大小依次為4 936、4 469和4 752 bp。各外源基因均搭配釀酒酵母組常用的成型啟動(dòng)子，如圖2-a所示。P1-V1、P2-V1、P3-V1質(zhì)粒均為中高拷貝質(zhì)粒，可以確保基因的表達(dá)量(圖2-b)。將上述經(jīng)轉(zhuǎn)化釀酒酵母BY4741得到AA-1菌株。

LSC1基因編碼催化琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)化為琥珀酸的酶關(guān)鍵亞基[20]。通過(guò)LSC1基因的敲除，從理論上來(lái)講，可以使Tfu途徑的前體物質(zhì)——琥珀酰輔酶A得以保留；但切斷的TCA循環(huán)可能導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)和代謝的不正常。使用BY4741ΔLSC1菌株基因組為模板進(jìn)行驗(yàn)證PCR得到陽(yáng)性結(jié)果，得到正確的BY4741LSC1基因敲除株(圖4)。該菌株經(jīng)P1-V1、P2-V1、P3-V1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，得到了AA-3菌株(圖2-b)。

M-5 000 bp marker；1-P1-V1驗(yàn)證；2-P2-V1驗(yàn)證；3-P3-V1驗(yàn)證

M-5 000 bp marker；1，2-正確敲除株；3-未正確敲除株；4-空白對(duì)照株

2.2 Tfu途徑菌株的發(fā)酵驗(yàn)證

本研究將Tfu己二酸逆降解途徑完整地表達(dá)在釀酒酵母AA-1及其LSC1基因敲除株AA-3中，以BY4741野生型菌株作為對(duì)照，經(jīng)過(guò)84 h的發(fā)酵，分別檢測(cè)了生物量、己二酸和乙醇的產(chǎn)量變化(圖5)。

圖5 菌株AA-1、AA-3和BY4741在YPD培養(yǎng)基發(fā)酵中生物量的變化趨勢(shì)

在生物量變化方面，48 h以前，野生型菌株生長(zhǎng)最快，在36 h已接近穩(wěn)定期，生物量增長(zhǎng)放緩；AA-1菌株生長(zhǎng)稍顯緩慢，但在48 h生物量達(dá)到了11 g/L左右，與野生型相似；AA-3菌株生長(zhǎng)緩慢，24 h之后才進(jìn)入對(duì)數(shù)期，48 h進(jìn)入穩(wěn)定期。但在48 h以后，各菌株生長(zhǎng)減緩，生物量峰值接近，為10～12 g/L。可能的原因是：1)AA-1菌株含有3個(gè)重組質(zhì)粒，代謝負(fù)擔(dān)較重，因此生長(zhǎng)比野生型稍顯遲緩；2)AA-3為T(mén)CA循環(huán)切斷菌株，減緩了有氧呼吸速率，因此生物量生長(zhǎng)緩慢；3)3株菌最終的生物量達(dá)到一致，說(shuō)明了總碳源氮源相同的情況下，菌體生物量的極值趨于相同。

如圖6所示，在己二酸產(chǎn)量方面，AA-1菌株在24 h 達(dá)到了1.12 mg/L，48 h上升到了最大值3.39 mg/L，但在72 h 時(shí)發(fā)生了下降；令人意外的是AA-3在48 h僅僅檢測(cè)到0.33 mg/L己二酸產(chǎn)量，而24 h 和48 h 均未檢測(cè)到；野生型沒(méi)有檢測(cè)到己二酸的生成。己二酸產(chǎn)量在達(dá)到最大值后發(fā)生下降，可能的原因是己二酸通過(guò)該途徑發(fā)生了部分降解，該現(xiàn)象與大腸桿菌的報(bào)道一致。而AA-3的己二酸產(chǎn)量極少，可能是由于LSC1基因的敲除導(dǎo)致了TCA循環(huán)的流量中斷，沒(méi)有更多的碳源向積累琥珀酰輔酶A的方向流動(dòng)。

圖6 菌株AA-1、AA-3和BY4741在YPD培養(yǎng)基發(fā)酵中己二酸的產(chǎn)量

如圖7所示，在主要副產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)量方面，AA-1和野生型菌株呈現(xiàn)出迅速升高、迅速降低的趨勢(shì)；而AA-3則出現(xiàn)迅速升高、緩慢降低的趨勢(shì)。在釀酒酵母發(fā)酵中，葡萄糖首先通過(guò)EMP途徑代謝，為菌體生長(zhǎng)提供ATP，而乙醇則作為該途徑的終產(chǎn)物被大量分泌到發(fā)酵液中，作為一種未完全氧化的碳源儲(chǔ)備；當(dāng)葡萄糖等碳源耗盡之后，在有氧條件下，乙醇可以作為第二碳源被重新利用[21]。AA-1菌株和野生型菌株在24 h 生產(chǎn)了約7 g/L乙醇，隨后便開(kāi)始降低，AA-1的乙醇產(chǎn)量降低幅度更大；相比之下，AA-1的己二酸產(chǎn)量從24 h的 1.12 mg/L大幅升高到 48 h的3.39 mg/L。由以上現(xiàn)象可以推測(cè)，部分乙醇可能通過(guò)有氧呼吸作用轉(zhuǎn)化為了己二酸。而AA-3由于TCA循環(huán)的中斷，幾乎無(wú)法進(jìn)行乙醇的重新利用，因此在24 h 達(dá)到最大產(chǎn)量7.87 g/L后減少緩慢。

圖7 菌株AA-1、AA-3和BY4741在YPD培養(yǎng)基發(fā)酵中乙醇的變化

為了對(duì)己二酸樣品進(jìn)行定性，將標(biāo)準(zhǔn)樣品、野生型發(fā)酵樣品及AA-1發(fā)酵樣品進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用定性檢測(cè),如圖8所示。

特征離子：83、101、127、145；a-標(biāo)準(zhǔn)品；b-野生型發(fā)酵樣品；c-AA-1發(fā)酵樣品

己二酸在AA-1樣品中檢測(cè)到，特征離子為：83、101、127和145。值得一提的是，本研究?jī)H僅在細(xì)胞破碎液中檢測(cè)到了己二酸，而在發(fā)酵上清液中并未檢測(cè)到?？赡艿脑蚴牵?)釀酒酵母細(xì)胞壁缺乏己二酸的通道蛋白；2)己二酸總產(chǎn)量較低，無(wú)法形成足夠的濃度梯度進(jìn)行被動(dòng)運(yùn)輸。

2.3 Tfu途徑菌株的發(fā)酵碳源濃度控制

釀酒酵母具有高產(chǎn)乙醇的特性，這為釀酒酵母作為底盤(pán)生物合成高附加值代謝產(chǎn)物造成了一定的阻力：由于葡萄糖或其他碳源大量轉(zhuǎn)化為乙醇，本應(yīng)流向異源途徑的代謝流切換到乙醇合成的方向，造成了資源的浪費(fèi)，降低了目標(biāo)產(chǎn)物的合成效率。在高糖濃度的情況下，即使在有氧條件下，釀酒酵母會(huì)將代謝由呼吸途徑切換至發(fā)酵途徑，大量生產(chǎn)乙醇，該現(xiàn)象被稱為“Crabtree效應(yīng)”[22]；而若將釀酒酵母的乙醇合成途徑相關(guān)基因如PDC1、ADH1基因敲除，會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢、代謝異常等現(xiàn)象[23]。從發(fā)酵工藝控制角度來(lái)看，乙醇的產(chǎn)生是Crabtree效應(yīng)的具體表現(xiàn)，而促使酵母由呼吸切換至發(fā)酵途徑的根本原因是碳源初始濃度。研究表明，隨著碳源濃度的增長(zhǎng)，Crabtree效應(yīng)會(huì)愈加明顯[24]。因此適當(dāng)降低初始碳源的濃度是控制乙醇產(chǎn)量的一種方案。同時(shí)，Tfu途徑始于乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，兩者均為有氧呼吸途徑中產(chǎn)生的物質(zhì)，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)降低初始碳源濃度，降低Crabtree 效應(yīng)，使酵母有氧呼吸作用增強(qiáng)，減少丙酮酸轉(zhuǎn)換為乙醇的流量，使更多的碳源通過(guò)Tfu途徑轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物己二酸。

本研究設(shè)置初始碳源質(zhì)量濃度分別為5、10和 20 g/L，將AA-1菌株發(fā)酵48 h測(cè)定己二酸、乙醇、生物量等數(shù)據(jù)，并計(jì)算己二酸產(chǎn)率。隨著初始碳源濃度的減少，乙醇產(chǎn)量顯著下降(圖9-a)，但生物量(圖9-b)和己二酸產(chǎn)量(圖9-c)也隨之下降。但己二酸產(chǎn)率則隨著碳源濃度的降低而提高(圖9-d)。

a-乙醇產(chǎn)量；b-生物量；c-己二酸產(chǎn)量；d-己二酸產(chǎn)率

在5 g/L 初始碳源濃度的條件下，己二酸產(chǎn)率比在20 g/L 初始碳源濃度的條件下提高了近1倍，說(shuō)明初始碳源濃度的降低有助于Crabtree效應(yīng)的減弱。

3 結(jié)論

本研究首次將T.fuscaB6 菌株中己二酸逆降解途徑導(dǎo)入釀酒酵母體系，并實(shí)現(xiàn)了己二酸在釀酒酵母宿主中的異源合成。挑選了釀酒酵母內(nèi)源組成型啟動(dòng)子、終止子，與6個(gè)外源基因進(jìn)行搭配，成功構(gòu)建了3個(gè)重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了己二酸的合成。敲除TCA循環(huán)關(guān)鍵酶基因LSC1并未使己二酸產(chǎn)量獲得提升。通過(guò)初始碳源濃度的控制，初步探究了己二酸產(chǎn)率的變化以及對(duì)副產(chǎn)物乙醇的控制。AA-1菌株在YPD培養(yǎng)基中發(fā)酵，得到了3.39 mg/L己二酸的產(chǎn)量，是同一宿主中報(bào)道的最高值。然而，目前該菌株合成己二酸的效率仍然較低。雖然在大腸桿菌中，利用該途徑可以獲得較高的己二酸產(chǎn)量，但在釀酒酵母宿主體系中，菌株合成己二酸的效率仍然較低。可能的原因如下：1)酵母細(xì)胞中途徑基因的拷貝數(shù)低，導(dǎo)致途徑酶表達(dá)量較低；2)酵母細(xì)胞中啟動(dòng)子強(qiáng)度較大腸桿菌相比偏低，導(dǎo)致途徑酶表達(dá)量較低；3)碳源大量地流入乙醇及其他副產(chǎn)物的合成途徑，造成己二酸的產(chǎn)量偏低；4)酵母特有的Crabtree效應(yīng)導(dǎo)致呼吸向發(fā)酵代謝的切換，造成了碳源利用效率偏低；5)酵母屬于真核生物，存在線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，當(dāng)中進(jìn)行的TCA循環(huán)所產(chǎn)生的己二酸前體代謝物——琥珀酰-CoA可能受到線粒體膜的空間分隔，不容易接觸到胞質(zhì)中的Tfu途徑酶，造成途徑催化效率低。在今后的研究中，我們將采取增加基因拷貝數(shù)、增強(qiáng)關(guān)鍵基因啟動(dòng)子強(qiáng)度、敲除或抑制競(jìng)爭(zhēng)途徑及發(fā)酵工藝優(yōu)化等策略進(jìn)一步提高己二酸的生產(chǎn)能力。