李 婷，林玉暖，林茂娟，牛曉磊，李春霞，陳銀華，陶 均

(海南大學 海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室/熱帶作物學院，海南 ?？?570228)

雙組分信號傳導系統(tǒng)(Two-component signal transduction systems，TCSTSs)是細菌感應內外界信號最主要的方式[1-2]，通常由感應信號的受體組氨酸激酶(histidine kinase, HK)和執(zhí)行功能的響應調節(jié)因子(response regulator, RR)組成[1-2].幾乎所有的細菌都編碼TCSTSs，只是數(shù)目上有差異，少則幾個，多則上百個，但都調控著細菌絕大多數(shù)的生理過程[3].此外，一個HK可能對應多個RR；同樣一個RR可能被多個HK磷酸化，TCSTSs之間存在著復雜的信號交叉[4-5].調控相同或相似代謝途徑的TCSTSs在進化過程中可能趨向于融合或產生級聯(lián)作用，進而更加精確地調控細胞行為，以適應不同的環(huán)境變化[3].

RavA/RavR是在水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)和野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestrispv.campestris,Xcc)中發(fā)現(xiàn)的，參與細胞第二信使環(huán)雙鳥苷酸Cyclic di-GMP(c-di-GMP)代謝轉換，調控細菌的群體感應、運動能力及胞外多糖，是影響病原菌致病力的重要雙組分信號傳導系統(tǒng)[6-7].RaxH/RaxR是Xoo中調控細菌效應因子AvrXa21加工分泌的主要調節(jié)因子，其可能感應群體信號，調控Ⅰ型分泌系統(tǒng)raxAB及酪氨酸硫化酶raxST的表達，影響病原菌與植物的互作[8-11].在Xcc中，RavA/RavR可以調控Ⅰ型分泌系統(tǒng)raxAB的表達[6]，暗示RaxH/RaxR和RavA/RavR可能共同調控Ⅰ型分泌系統(tǒng)，或處于信號傳導通路的不同位置.但RaxH/RaxR和RavA/RavR是否在進化上有關聯(lián)性以及兩種之間在功能上是否相關還未有報道.本研究首先分析了RaxH與RaxR以及RavA與RavR的共進化關系，然后分析了這兩個雙組分系統(tǒng)在進化上的相關性以及它們在調控上的關聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)了這兩個雙組分系統(tǒng)高度協(xié)同進化，RaxH/RaxR在表達水平調控RavA/RavR，形成一個級聯(lián)的調控通路.

1 材料與方法

1.1 材 料RaxH/RaxR與RavA/RavR蛋白序列下載于NCBI(Http://www.ncbi.nlm.nih.gov).XooPXO99由本實驗室保存.化學試劑購自廣州化學試劑公司(廣州)和Sigma-Aldrich(上海).PCR相關試劑購自全式金生物科技有限公司(北京).引物由華大基因生物科技有限公司(北京)合成，序列見表1.限制性內切酶購自NEB China(北京).

表1 本研究所用的引物

1.2 生物信息學分析序列比對及進化樹分析采用MEGA6[12]，進化分析采用最大似然法.蛋白質二級結構分析采用SMART法(http://smart.embl-heidelberg.de/)[13-14].共進化分析采用Paralog Matching法[15]，采用KEGG數(shù)據(jù)庫[16]和String在線分析法(https://string-db.org/)分析共存在[17].

1.3 基因敲除采用同源重組兩步交換法構建缺失突變體[6,18,19].以菌株PXO99的基因組為模板，擴增待敲除基因的左右兩端各400～500 bp的片段，構建到自殺質粒pK18mobSacB上.將構建正確的質粒載體用電擊轉化方法轉入PXO99中，涂布在含有卡那霉素的PGA(即PGK)平板上，28℃培養(yǎng)2-3天.將PGK平板上生長的菌落，選取4～8個單克隆同時接種到PGK平板和含有15%蔗糖的PSA(即PSSU)平板上.選取在PGK平板上生長但在PSSU平板上不生長的2個單克隆，在PGA液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)3天.取適量菌液涂布在PSSU平板上，28℃培養(yǎng)3天.選取在PSSU平板上生長的20個黃色單菌落，同時接種于PGK和PSSU平板上.選取在PSSU平板上生長但在PGK上不生長的菌體，進行菌落PCR驗證，獲得基因缺失突變體.

1.4 RNA提取及qPCR分析PXO99，ΔravA，ΔravR及ΔraxR接種于PSA培養(yǎng)基(1%牛肉膏，1%酵母提取物，1%蔗糖)中，1天后按1∶100轉接到新鮮的PSA中，待OD600≈0.8時，收集菌體，液氮速凍后進行RNA提取.RNA提取和qPCR分析參照已發(fā)表文獻[18-19].PCR引物見表1.

1.5 數(shù)據(jù)分析及作圖采用GraphPad Prism 5作圖，圖像后期處理采用Adobe Photoshop 8.0軟件.

2 結果與分析

2.1 RavA/RavR的共進化分析以野油菜黃單胞菌(Xcc)ravA在基因組的位置為標準，分析其附近的基因在其它菌株中是否也與ravA共同存在.首先通過同源搜索尋找同源蛋白，并定位每個相應基因在其基因組中的位置.然后將獲得的物種數(shù)目作比較，分析這些基因與ravA共同存在的比率.結果顯示，ravR與ravA共同存在于同一基因組的概率是97%，而Xcc基因組上ravA相鄰的其它基因在其它物種中同時存在的概率都小于70%(圖1A)，表明RavR與RavA在通常情況下組成一對雙組分系統(tǒng).由于RavS也被認為可磷酸化RavR[7]，但其與RavR共同進化率低，因此RavS可能只在某些特定細菌中與RavR組成雙組分系統(tǒng)，不具有廣泛性，可能是RavR在進化過程中獲得的新調控模式.同源性分析發(fā)現(xiàn)RavA和RavR都可以分為兩大類(圖1B和1C)，黃單胞菌中的RavA和RavR都在一大類中，且序列非常相似.但是在大多數(shù)細菌中，RavA和RavR都是相當保守的，預示其調控功能也是保守的.

2.2 RaxH/RaxR的共進化分析按照上述RavA/RavR共進化分析方法，以Xcc中raxH在基因組的位置為標準，分析其附近的基因在其它菌中是否也與raxH共同存在.結果顯示，raxR與raxH共同存在于同一基因組的概率是96%，而Xcc基因組上raxH相鄰的基因在其它物種中同時存在的概率均小于50%(圖2A)，同樣說明RaxH與RaxR在通常情況下組成一對雙組分系統(tǒng).raxR和raxH組成一個操縱子，其基因組上下游基因的共進化概率低，說明raxR/raxH的功能可能與其相鄰的基因沒有多大的關系.同RavA和RavR一樣，RaxH/RaxR在同源性上也可以分為兩大類(圖2B和2C)，黃單胞菌編碼蛋白都在一大類中.RaxH/RaxR的序列在不同菌中也是高度保守的，其調控功能也應該是保守的.

圖1 RavA和RavR共進化(A)和聚類分析(B和C)

圖2 RaxH和RaxR共進化(A)和聚類分析(B和C)

2.3 RaxH/RaxR與RavA/RavR之間的共進化分析RaxH/RaxR與RavA/RavR在細菌中都高度保守，各自之間的共進化關系明顯(圖1和圖2)，而且在水稻黃單胞菌中，RaxH/RaxR可能感應和群體感應信號，而RavA/RavR則參與細胞第二信使c-di-GMP的代謝.c-di-GMP是調控細菌群體行為的主要信使[6, 8, 10, 20].因此，RaxH/RaxR與RavA/RavR可能在功能或調控上存在關聯(lián)，在細菌進化過程中共同進化.為此，我們分析了這兩個系統(tǒng)間的共進化關系.如圖3A所示，兩者的共進化系數(shù)接近80%，說明兩者之間關聯(lián)性很強.在選擇的67個菌株中，56個編碼RaxH/RaxR，50個編碼RavA/RavR，編碼RavA/RavR的菌株均編碼RaxH/RaxR(表2)，進一步表明兩者之間關聯(lián)性很強.另外，幾乎所有的黃單胞菌都編碼RaxH/RaxR和RavA/RavR(圖3B)，說明這兩個系統(tǒng)在黃單胞菌的生存過程中起到非常重要的作用.從這些基因在基因組中的位置及其轉錄方向看，它們的保守性也很強：ravA和ravR轉錄方向相對，擁有自身的啟動子，而raxR和raxH組成一個操縱子，一起轉錄(表2，最后行).這些結果說明RaxH/RaxR和RavA/RavR存在著共進化的關系，在功能或調控上有相關性.

表2 部分細菌同時編碼RaxHR和RavAR

2.4 RaxH/RaxR在轉錄水平調控RavA/RavR以上分析表明RaxH/RaxR與RavA/RavR的共進化關系明顯(圖3).有研究表明，在水稻黃單胞菌中RaxH/RaxR可能感應和群體感應信號，在介導細菌與植物互作過程中起到非常重要的作用，RavR可分解c-di-GMP，調控細菌群體行為，且兩者突變都影響細菌的致病能力[6,8,10,20].因此，RaxH/RaxR與RavA/RavR可能在調控上存在相關性.為此，我們首先構建了這些基因的突變體，然后比較了突變體和野生型菌株中這些基因的表達情況.結果顯示，RaxH/RaxR可負調控RavA/RavR的表達(圖4)，表明兩者之間確實存在著相關性.

3 討 論

單細胞特點決定細菌需要對外界環(huán)境做出快速響應.TCSTSs是原核生物最重要的感應響應系統(tǒng)，其數(shù)目的多少是其應變能力的衡量標準[21].不同細菌編碼數(shù)目不同的TCSTSs，如Xanthomonas屬共編碼92-121個TCSTSs蛋白，調控細胞分裂、運動能力、脅迫響應、胞外多糖、生物膜等多個生理生化過程，影響細菌的生存能力[22-23].有些TCSTS共同調控一個代謝過程，而有的HK可能調控多個RR的活性[21].這些TCSTSs可能在進化過程中被一起保留了下來.RaxH同RaxR的高度共進化特性(圖2)表明這對雙組分系統(tǒng)對多數(shù)細菌的生存是必要的.同樣RavA與RavR的共進化特征也很明顯(圖1)，說明它們組成的TCSTS對細菌來說同樣非常重要.在Xoo中，RaxH/RaxR與RavA/RavR調控相似的信號途徑，影響細菌與宿主的互作[20]，暗示它們之間可能在進化上有協(xié)同進化的特性.通過對不同細菌中這兩個TCSTSs共同進化特征分析發(fā)現(xiàn)兩者共同存在于一個細菌基因組的概率很高(圖3和表2)，證實了它們之間的關聯(lián)性.同時raxH/raxR突變會導致ravA/ravR的表達上升(圖4)，說明這兩個雙組分系統(tǒng)確實存在著調控上的關聯(lián)性.RaxH/RaxR可能位于整個信號傳導的上游，而RavA/RavR處于中游，其調控的c-di-GMP作為第二信使再引起下游基因的表達變化，從而影響諸如生物膜、運動性及AvrXa21的加工及分泌等生理過程，調控病原菌的致病能力.我們后面的研究將關注這兩個TCSTSs之間的調控網絡，并進一步分析RaxH/RaxR調控RavA/RavR表達的分子機制，為最終解析兩者之間的關系打下基礎.