李尚科 董怡青 李 跑，* 單 楊 蔣立文 劉 霞

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點實驗室 長沙410128 2 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 長沙 410125）

我國是大豆盛產(chǎn)國，大豆類食品有著不遜于動物蛋白的營養(yǎng)價值，含有豐富且優(yōu)質(zhì)的植物蛋白、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，以及生物活性物質(zhì)，如大豆異黃酮、大豆甾醇等[1-2]。為有效減少營養(yǎng)物質(zhì)的流失，去除不易消化吸收的物質(zhì)，經(jīng)過科學(xué)加工工序的豆?jié){粉成為更為適應(yīng)“快餐”理念的一類食品?，F(xiàn)階段市場上有以自磨豆?jié){粉替代品牌豆?jié){粉，國內(nèi)品牌代替國外品牌，即摻假、以次充好等食品安全問題。國內(nèi)外不同品牌以及不同批次之間的原料以及生產(chǎn)工藝等存在差異，其豆?jié){粉所含營養(yǎng)物質(zhì)組成和含量會有所不同?，F(xiàn)階段用于豆?jié){粉的分析方法主要是感官評價法[3]和化學(xué)分析法[4]。感官評價法是一種快速、簡單的鑒別方法，然而其準(zhǔn)確度易受到主觀因素和外界環(huán)境的影響?；瘜W(xué)分析法主要通過測定其具體成分來實現(xiàn)對豆?jié){粉的檢測分析，相較于感官評價法結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。李艷艷等[4]利用高效液相色譜法對豆?jié){粉中的4 種大豆黃酮進(jìn)行分析，找到不同豆?jié){粉大豆黃酮之間的差異。然而，該方法操作步驟較為繁瑣，檢測費(fèi)用也相應(yīng)較高，無法實現(xiàn)快速無損分析。研究一種快速、無損鑒別豆?jié){粉的方法，可以有效解決豆?jié){粉產(chǎn)品溯源問題。

近紅外光譜技術(shù)是一種快速、無損的檢測方法。利用近紅外電磁波的波粒二象性使物質(zhì)中的部分活性分子狀態(tài)發(fā)生變化或伴隨能級的躍遷，從而獲得被測物質(zhì)的近紅外吸收光譜[5]。近紅外光譜技術(shù)具有無需樣品預(yù)處理，速度快，效率高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點，同時也存在譜帶較寬，吸收峰重疊嚴(yán)重，信噪比低等局限性[6-7]，因此常通過結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)一步處理和分析[8-9]。

近紅外分析技術(shù)在食品領(lǐng)域主要應(yīng)用于食品溯源[10-11]、品種鑒別[12-13]、組成分檢測[14-16]等方面。然而用在豆?jié){粉的分析并不多。張初等[17]利用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合偏最小二乘、線性判別分析、誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等化學(xué)計量學(xué)法，實現(xiàn)了對于真?zhèn)味節(jié){粉的鑒別，準(zhǔn)確率達(dá)到100%。然而這些方法參數(shù)較多，計算較為繁瑣，且現(xiàn)階段尚無利用近紅外光譜技術(shù)以實現(xiàn)國產(chǎn)與進(jìn)口豆?jié){粉鑒別的研究報道。本研究旨在基于近紅外光譜技術(shù)以及化學(xué)計量學(xué)方法，實現(xiàn)假冒以及國內(nèi)外不同品牌豆?jié){粉的快速、無損鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

參考文獻(xiàn)[17]，從本地超市購買大豆并粉碎，過100 目篩得到自磨豆?jié){粉記為A。此外，購買了1 個國外品牌樣品（阿華田豆?jié){粉）記為E，其所含營養(yǎng)成分為每30 g 中含有蛋白質(zhì)5.6 g、脂肪3.2 g、碳水化合物19.1 g、微量元素31 mg。3 個國內(nèi)品牌樣品（永和豆?jié){粉、維維豆?jié){粉和智仁豆?jié){粉）記為B、C、D。永和豆?jié){粉中營養(yǎng)成分為每100 g中含有蛋白質(zhì)18 g、脂肪10 g、碳水化合物63.3 g、微量元素120 mg；維維豆?jié){粉中營養(yǎng)成分為每100 g 中含有蛋白質(zhì)18.8 g、脂肪10.2 g、碳水化合物65 g、微量元素139 mg；智仁豆?jié){粉中營養(yǎng)成分為每100 g 中含有蛋白質(zhì)12 g、脂肪8 g、碳水化合物75 g、微量元素150 mg。每一個國內(nèi)品牌又分別選取3 個不同生產(chǎn)日期批次樣品，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示不同生產(chǎn)日期批次，如B1。合計132 個豆?jié){粉樣本。

1.2 儀器與設(shè)備

豆?jié){粉全部近紅外光譜的采集：Vertex 70 多波段紅外/近紅外光譜儀、近紅外積分球漫反射附件，德國Bruker 公司。光譜預(yù)處理與聚類分析：MATLAB R2010b（The Math Works，Natick，USA）軟件。

1.3 試驗方法

1.3.1 光譜采集 本試驗近紅外波數(shù)范圍為12 000～4 000 cm-1，最小間隔為4 cm-1，共采集2 098 個數(shù)據(jù)點。同一樣品測量3 次，取3 條光譜的平均值作為該樣本的原始光譜，合計132 條光譜。

1.3.2 光譜預(yù)處理與聚類分析 由于儀器和環(huán)境的干擾，近紅外光譜信號中易出現(xiàn)噪聲以及基線漂移的干擾。為提高信噪比，篩選出有效數(shù)據(jù)的范圍，需進(jìn)行有效的預(yù)處理。連續(xù)小波變換（Continuous wavelet transform，CWT）方法可以提取光譜中的有效信息，突出特征譜峰。因此本研究利用CWT 方法消除背景和基線漂移的干擾，并選用了范圍為25 的“haar”的小波基。大量冗余的光譜信息變量會對模型的穩(wěn)定性造成影響，波長篩選的手段可以很好地消除這些干擾。在平均值大于1%的波長基礎(chǔ)上，選取標(biāo)準(zhǔn)偏差（Standard deviation，SD）大于5‰與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）較大的波長點作為特征波數(shù)[18]。此外，利用主成分分析（Principal component analysis，PCA）方法對豆?jié){粉樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆?jié){粉的光譜特征

為消除隨機(jī)誤差的影響，對全部豆?jié){粉樣品重復(fù)測量3 次并取其平均值。圖1 為全部樣品的光譜圖。可以看出所有光譜大致趨勢一致，大部分譜線重合，且具有相似的吸收峰，說明其主要成分相似或者相同。在11 000 cm-1附近處明顯的吸收峰可能與C-H 鍵伸縮振動的三級倍頻有關(guān)，8 400 cm-1附近處吸收峰可能與C-H 鍵伸縮振動的二級倍頻有關(guān)，5 250 cm-1附近處吸收峰可能與C=O鍵伸縮振動的二級倍頻吸收有關(guān)，7 000～5 600 cm-1、5 000～4 000 cm-1存在著較明顯差別，且自磨豆?jié){粉光譜吸光度值普遍低于其它品牌豆?jié){粉吸光度，說明自磨豆?jié){粉與品牌豆?jié){粉某些成分含量有差異。然而，由于光譜中存在嚴(yán)重的基線漂移干擾，較難找到組成成分的特征吸收峰。

為實現(xiàn)假冒以及不同品牌豆?jié){粉的鑒別分析，采用PCA 方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。在計算時，使用Kennard-Stone（KS）方法得到數(shù)據(jù)的校正集和預(yù)測集，其中99 個樣品數(shù)據(jù)被選為校正集，33 個樣品數(shù)據(jù)被選為驗證集。此外由于第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）的方差貢獻(xiàn)率之和在90%以上，因此選取PC1 和PC2 進(jìn)行PCA 分析。圖2 為原始數(shù)據(jù)的PCA 結(jié)果，其中驗證集數(shù)據(jù)用空心圖形表示。不同顏色的橢圓形為不同豆?jié){粉數(shù)據(jù)95%置信度的置信橢圓。由圖2 可知，假冒豆?jié){粉（A 類）與品牌豆?jié){粉存在明顯差別，可能原因是品牌豆?jié){粉在生產(chǎn)加工過程中會添加維生素、礦物質(zhì)等其它營養(yǎng)成分，而假冒豆?jié){粉中并未添加。假冒豆?jié){粉與品牌豆?jié){粉的驗證結(jié)果準(zhǔn)確率達(dá)到了100%，表明該方法可以鑒別出用自磨豆?jié){粉以次充好代替品牌豆?jié){粉的現(xiàn)象，然而不同品牌之間樣品的鑒別率為0，因此，僅靠原始光譜PCA 分析是無法實現(xiàn)不同品牌豆?jié){粉的快速鑒別。

圖1 豆?jié){粉原始光譜圖Fig.1 Original spectra of soybean milk powder samples

圖2 原始光譜的PCA 圖Fig.2 PCA result of the original spectra

為了提高鑒別能力，采取CWT 預(yù)處理方法以消除背景或基線漂移干擾。圖3 是通過CWT 處理后的豆?jié){粉光譜，從圖中可以看出背景干擾被有效扣除，且光譜中出現(xiàn)了明顯的特征譜峰，表明CWT 方法是消除背景干擾和基線漂移的良好工具。從圖3 可以觀察到在11 125，10 300，9 475，8 625，8 450，7 400，7 000，6 400，5 910，5 700，5 250，4 900，4 425，4 100 cm-1附近有明顯的吸收峰，其中4 100，4 425，4 900，5 250，5 910，7 000，11 125 cm-1處信號較為強(qiáng)烈。其中4 100，4 425 cm-1處吸收峰可能與淀粉中的C-H 鍵伸縮振動、C-C 鍵伸縮振動以及O-H 鍵伸縮、變形振動的合頻有關(guān)。4 900，5 250 cm-1處吸收峰可能與蛋白質(zhì)中的N-H 鍵對稱伸縮振動和C=O 鍵伸縮振動的二級倍頻有關(guān)。5 700，5 910 cm-1處吸收峰可能與脂肪中C-H 鍵伸縮振動的一級倍頻有關(guān)，然而，國外產(chǎn)品在5 910 cm-1處未有吸收峰而在5 940 cm-1處有吸收峰，可能與大豆異黃酮中CH 鍵伸縮振動的一級倍頻有關(guān)。7 000 cm-1附近假冒、國內(nèi)和國外品牌產(chǎn)品的吸收峰存在差異，其中國內(nèi)和假冒產(chǎn)品分別在7 042 cm-1和7 100 cm-1處的吸收峰可能與大豆甾醇中O-H 鍵伸縮振動的一級倍頻有關(guān)，國外產(chǎn)品的吸收峰在7 000 cm-1，可能與蛋白質(zhì)中的O-H 鍵伸縮振動一級倍頻有關(guān)。8 450，8 625，9 497 cm-1處吸收峰可能與脂肪中C-H 鍵伸縮、變形振動的一級、二級倍頻吸收有關(guān)。10 300 cm-1附近的譜峰有所差異，可能與水分中O-H 鍵伸縮振動的二級倍頻吸收有關(guān)。11 125 cm-1吸收峰與蛋白質(zhì)中的C-H 鍵伸縮振動的三級倍頻有關(guān)。

2.2 基于全譜的PCA 分析

為進(jìn)一步提高聚類分析的結(jié)果，將CWT 預(yù)處理與PCA 聚類分析相結(jié)合。圖4 代表了CWT 預(yù)處理后的PCA 結(jié)果。可以看出，在CWT 有效扣除背景干擾后，聚類分析結(jié)果得到了顯著提高。假冒、國內(nèi)和國外品牌之間的鑒別準(zhǔn)確率達(dá)到了100%，且國內(nèi)不同品牌之間的鑒別率提升至45.45%，然而，B 與C 類樣品的置信橢圓存在嚴(yán)重的重疊。表明僅通過CWT 預(yù)處理方法無法實現(xiàn)所有品牌豆?jié){粉的鑒別分析。

2.3 對豆?jié){粉光譜進(jìn)行波長篩選

選出光譜數(shù)據(jù)中的特征波長，有利于降低因大量冗余的波長變量對結(jié)果傳遞準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性的影響，選取SD 和相RSD 較大的波長點來進(jìn)行聚類分析。一般認(rèn)為SD 值小于5‰是由操作誤差引起的波動，剔除那些SD 值小于5 ‰的波長，有效波數(shù)范圍將縮小到7 500～4 000 cm-1；如果兩組數(shù)據(jù)的測量尺度相差太大，或者數(shù)據(jù)量綱的不同，直接使用SD 來進(jìn)行比較不合適，因此選擇RSD較大的波長點。然而，吸收度趨近于0 的波數(shù)會造成較大RSD，故應(yīng)首先篩選出平均值大于1%的波長。從圖5 可得，消除量綱后存在較大差異的波長點，且RSD 值均小于0.6。根據(jù)RSD 值從大到小選取20 個波長點，以下波段5 810～5 780 cm-1、4 725～4 740 cm-1、4 590～4 545 cm-1光譜存在較大差異，主要差異可能是由于蛋白質(zhì)、淀粉組成和含量不同所導(dǎo)致。

圖3 CWT 處理后的光譜Fig.3 Spectra after CWT method

圖4 小波變換后的PCA 圖Fig.4 PCA graft after CWT

圖5 小波變換后的RSD 圖Fig.5 RSD Graph after CWT

針對這20 個具有較大差異的波長點進(jìn)行PCA 分析。圖6 為通過CWT 以及變量篩選后的PCA 分析的結(jié)果，相較于只經(jīng)過CWT 的PCA 結(jié)果，鑒別準(zhǔn)確率得到進(jìn)一步提高。從圖6 可知，不同生產(chǎn)日期批次D 類產(chǎn)品中D1 與D2 置信橢圓部分重疊，與D3 得到很好的區(qū)分，且D 類品牌與其它品牌互不重疊。不同生產(chǎn)日期批次B 類產(chǎn)品之間得到較好的鑒別，C 類產(chǎn)品的不同生產(chǎn)日期批次中C2 與C3 置信橢圓重合嚴(yán)重，與C1 得到了良好區(qū)分，同時，B 與C 類之間僅有C1 組的2個驗證集樣品落入B1 和C1 組置信橢圓重疊區(qū)域內(nèi)，其余所有驗證集樣品均在各自品牌的置信橢圓內(nèi)，不同品牌豆?jié){粉鑒別成功率達(dá)到了93.94%。假冒豆?jié){粉以及國內(nèi)外豆?jié){粉之間的鑒別準(zhǔn)確率達(dá)到了100%。國內(nèi)品牌間鑒別未獲得100%準(zhǔn)確率的原因可能是原料的大豆來源或生產(chǎn)加工工藝過于相似。Shi 等[19]對不同大豆品種的理化指標(biāo)以及豆?jié){風(fēng)味特征指標(biāo)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)是造成不同豆?jié){粉風(fēng)味差別的主要原因。Ma 等[20]的研究也表明加工前、后豆?jié){粉之間的蛋白質(zhì)存在差異，從而導(dǎo)致豆?jié){粉風(fēng)味存在一定差異。因此，可以推測具有較大RSD值的4740 cm-1波數(shù)點可能是來自于自磨與品牌豆?jié){粉在蛋白質(zhì)含量或氨基酸組成的差異。

圖6 小波變換和波長篩選后的PCA 圖Fig6 PCA result after CWT and wavelength screening

3 結(jié)論

本研究通過近紅外光譜分析技術(shù)和化學(xué)計量學(xué)方法，實現(xiàn)了對假冒、國內(nèi)外不同品牌豆?jié){粉的快速無損鑒別。通過對光譜進(jìn)行了CWT 預(yù)處理，可有效消除背景和基線漂移的干擾；利用SD 與RSD 篩選出特征波段，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行PCA 分析可以獲得較好的鑒別結(jié)果，其中假冒豆?jié){粉、進(jìn)口豆?jié){粉與國產(chǎn)豆?jié){粉之間的鑒別準(zhǔn)確率達(dá)到了100%，而不同品牌豆?jié){粉之間的鑒別準(zhǔn)確率達(dá)到了93.94%。近紅外結(jié)合化學(xué)計量方法快速無損分析豆?jié){粉是一種環(huán)保、高效的安全控制方法，并且可以應(yīng)用于解決其它食品的摻偽摻假問題。