李尚科 董怡青 李 跑，* 單 楊 蔣立文 劉 霞

（1 湖南農業(yè)大學食品科學技術學院 食品科學與生物技術湖南省重點實驗室 長沙410128 2 湖南省農業(yè)科學院 湖南省農產品加工研究所 長沙 410125）

我國是大豆盛產國，大豆類食品有著不遜于動物蛋白的營養(yǎng)價值，含有豐富且優(yōu)質的植物蛋白、維生素、礦物質等營養(yǎng)物質，以及生物活性物質，如大豆異黃酮、大豆甾醇等[1-2]。為有效減少營養(yǎng)物質的流失，去除不易消化吸收的物質，經過科學加工工序的豆?jié){粉成為更為適應“快餐”理念的一類食品?，F(xiàn)階段市場上有以自磨豆?jié){粉替代品牌豆?jié){粉，國內品牌代替國外品牌，即摻假、以次充好等食品安全問題。國內外不同品牌以及不同批次之間的原料以及生產工藝等存在差異，其豆?jié){粉所含營養(yǎng)物質組成和含量會有所不同?，F(xiàn)階段用于豆?jié){粉的分析方法主要是感官評價法[3]和化學分析法[4]。感官評價法是一種快速、簡單的鑒別方法，然而其準確度易受到主觀因素和外界環(huán)境的影響?；瘜W分析法主要通過測定其具體成分來實現(xiàn)對豆?jié){粉的檢測分析，相較于感官評價法結果更為準確可靠。李艷艷等[4]利用高效液相色譜法對豆?jié){粉中的4 種大豆黃酮進行分析，找到不同豆?jié){粉大豆黃酮之間的差異。然而，該方法操作步驟較為繁瑣，檢測費用也相應較高，無法實現(xiàn)快速無損分析。研究一種快速、無損鑒別豆?jié){粉的方法，可以有效解決豆?jié){粉產品溯源問題。

近紅外光譜技術是一種快速、無損的檢測方法。利用近紅外電磁波的波粒二象性使物質中的部分活性分子狀態(tài)發(fā)生變化或伴隨能級的躍遷，從而獲得被測物質的近紅外吸收光譜[5]。近紅外光譜技術具有無需樣品預處理，速度快，效率高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點，同時也存在譜帶較寬，吸收峰重疊嚴重，信噪比低等局限性[6-7]，因此常通過結合化學計量學方法對數據進一步處理和分析[8-9]。

近紅外分析技術在食品領域主要應用于食品溯源[10-11]、品種鑒別[12-13]、組成分檢測[14-16]等方面。然而用在豆?jié){粉的分析并不多。張初等[17]利用近紅外光譜技術結合偏最小二乘、線性判別分析、誤差反向傳播神經網絡等化學計量學法，實現(xiàn)了對于真?zhèn)味節(jié){粉的鑒別，準確率達到100%。然而這些方法參數較多，計算較為繁瑣，且現(xiàn)階段尚無利用近紅外光譜技術以實現(xiàn)國產與進口豆?jié){粉鑒別的研究報道。本研究旨在基于近紅外光譜技術以及化學計量學方法，實現(xiàn)假冒以及國內外不同品牌豆?jié){粉的快速、無損鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

參考文獻[17]，從本地超市購買大豆并粉碎，過100 目篩得到自磨豆?jié){粉記為A。此外，購買了1 個國外品牌樣品（阿華田豆?jié){粉）記為E，其所含營養(yǎng)成分為每30 g 中含有蛋白質5.6 g、脂肪3.2 g、碳水化合物19.1 g、微量元素31 mg。3 個國內品牌樣品（永和豆?jié){粉、維維豆?jié){粉和智仁豆?jié){粉）記為B、C、D。永和豆?jié){粉中營養(yǎng)成分為每100 g中含有蛋白質18 g、脂肪10 g、碳水化合物63.3 g、微量元素120 mg；維維豆?jié){粉中營養(yǎng)成分為每100 g 中含有蛋白質18.8 g、脂肪10.2 g、碳水化合物65 g、微量元素139 mg；智仁豆?jié){粉中營養(yǎng)成分為每100 g 中含有蛋白質12 g、脂肪8 g、碳水化合物75 g、微量元素150 mg。每一個國內品牌又分別選取3 個不同生產日期批次樣品，用阿拉伯數字表示不同生產日期批次，如B1。合計132 個豆?jié){粉樣本。

1.2 儀器與設備

豆?jié){粉全部近紅外光譜的采集：Vertex 70 多波段紅外/近紅外光譜儀、近紅外積分球漫反射附件，德國Bruker 公司。光譜預處理與聚類分析：MATLAB R2010b（The Math Works，Natick，USA）軟件。

1.3 試驗方法

1.3.1 光譜采集 本試驗近紅外波數范圍為12 000～4 000 cm-1，最小間隔為4 cm-1，共采集2 098 個數據點。同一樣品測量3 次，取3 條光譜的平均值作為該樣本的原始光譜，合計132 條光譜。

1.3.2 光譜預處理與聚類分析 由于儀器和環(huán)境的干擾，近紅外光譜信號中易出現(xiàn)噪聲以及基線漂移的干擾。為提高信噪比，篩選出有效數據的范圍，需進行有效的預處理。連續(xù)小波變換（Continuous wavelet transform，CWT）方法可以提取光譜中的有效信息，突出特征譜峰。因此本研究利用CWT 方法消除背景和基線漂移的干擾，并選用了范圍為25 的“haar”的小波基。大量冗余的光譜信息變量會對模型的穩(wěn)定性造成影響，波長篩選的手段可以很好地消除這些干擾。在平均值大于1%的波長基礎上，選取標準偏差（Standard deviation，SD）大于5‰與相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD）較大的波長點作為特征波數[18]。此外，利用主成分分析（Principal component analysis，PCA）方法對豆?jié){粉樣品數據進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 豆?jié){粉的光譜特征

為消除隨機誤差的影響，對全部豆?jié){粉樣品重復測量3 次并取其平均值。圖1 為全部樣品的光譜圖?？梢钥闯鏊泄庾V大致趨勢一致，大部分譜線重合，且具有相似的吸收峰，說明其主要成分相似或者相同。在11 000 cm-1附近處明顯的吸收峰可能與C-H 鍵伸縮振動的三級倍頻有關，8 400 cm-1附近處吸收峰可能與C-H 鍵伸縮振動的二級倍頻有關，5 250 cm-1附近處吸收峰可能與C=O鍵伸縮振動的二級倍頻吸收有關，7 000～5 600 cm-1、5 000～4 000 cm-1存在著較明顯差別，且自磨豆?jié){粉光譜吸光度值普遍低于其它品牌豆?jié){粉吸光度，說明自磨豆?jié){粉與品牌豆?jié){粉某些成分含量有差異。然而，由于光譜中存在嚴重的基線漂移干擾，較難找到組成成分的特征吸收峰。

為實現(xiàn)假冒以及不同品牌豆?jié){粉的鑒別分析，采用PCA 方法對數據進行處理。在計算時，使用Kennard-Stone（KS）方法得到數據的校正集和預測集，其中99 個樣品數據被選為校正集，33 個樣品數據被選為驗證集。此外由于第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）的方差貢獻率之和在90%以上，因此選取PC1 和PC2 進行PCA 分析。圖2 為原始數據的PCA 結果，其中驗證集數據用空心圖形表示。不同顏色的橢圓形為不同豆?jié){粉數據95%置信度的置信橢圓。由圖2 可知，假冒豆?jié){粉（A 類）與品牌豆?jié){粉存在明顯差別，可能原因是品牌豆?jié){粉在生產加工過程中會添加維生素、礦物質等其它營養(yǎng)成分，而假冒豆?jié){粉中并未添加。假冒豆?jié){粉與品牌豆?jié){粉的驗證結果準確率達到了100%，表明該方法可以鑒別出用自磨豆?jié){粉以次充好代替品牌豆?jié){粉的現(xiàn)象，然而不同品牌之間樣品的鑒別率為0，因此，僅靠原始光譜PCA 分析是無法實現(xiàn)不同品牌豆?jié){粉的快速鑒別。

圖1 豆?jié){粉原始光譜圖Fig.1 Original spectra of soybean milk powder samples

圖2 原始光譜的PCA 圖Fig.2 PCA result of the original spectra

為了提高鑒別能力，采取CWT 預處理方法以消除背景或基線漂移干擾。圖3 是通過CWT 處理后的豆?jié){粉光譜，從圖中可以看出背景干擾被有效扣除，且光譜中出現(xiàn)了明顯的特征譜峰，表明CWT 方法是消除背景干擾和基線漂移的良好工具。從圖3 可以觀察到在11 125，10 300，9 475，8 625，8 450，7 400，7 000，6 400，5 910，5 700，5 250，4 900，4 425，4 100 cm-1附近有明顯的吸收峰，其中4 100，4 425，4 900，5 250，5 910，7 000，11 125 cm-1處信號較為強烈。其中4 100，4 425 cm-1處吸收峰可能與淀粉中的C-H 鍵伸縮振動、C-C 鍵伸縮振動以及O-H 鍵伸縮、變形振動的合頻有關。4 900，5 250 cm-1處吸收峰可能與蛋白質中的N-H 鍵對稱伸縮振動和C=O 鍵伸縮振動的二級倍頻有關。5 700，5 910 cm-1處吸收峰可能與脂肪中C-H 鍵伸縮振動的一級倍頻有關，然而，國外產品在5 910 cm-1處未有吸收峰而在5 940 cm-1處有吸收峰，可能與大豆異黃酮中CH 鍵伸縮振動的一級倍頻有關。7 000 cm-1附近假冒、國內和國外品牌產品的吸收峰存在差異，其中國內和假冒產品分別在7 042 cm-1和7 100 cm-1處的吸收峰可能與大豆甾醇中O-H 鍵伸縮振動的一級倍頻有關，國外產品的吸收峰在7 000 cm-1，可能與蛋白質中的O-H 鍵伸縮振動一級倍頻有關。8 450，8 625，9 497 cm-1處吸收峰可能與脂肪中C-H 鍵伸縮、變形振動的一級、二級倍頻吸收有關。10 300 cm-1附近的譜峰有所差異，可能與水分中O-H 鍵伸縮振動的二級倍頻吸收有關。11 125 cm-1吸收峰與蛋白質中的C-H 鍵伸縮振動的三級倍頻有關。

2.2 基于全譜的PCA 分析

為進一步提高聚類分析的結果，將CWT 預處理與PCA 聚類分析相結合。圖4 代表了CWT 預處理后的PCA 結果?？梢钥闯?，在CWT 有效扣除背景干擾后，聚類分析結果得到了顯著提高。假冒、國內和國外品牌之間的鑒別準確率達到了100%，且國內不同品牌之間的鑒別率提升至45.45%，然而，B 與C 類樣品的置信橢圓存在嚴重的重疊。表明僅通過CWT 預處理方法無法實現(xiàn)所有品牌豆?jié){粉的鑒別分析。

2.3 對豆?jié){粉光譜進行波長篩選

選出光譜數據中的特征波長，有利于降低因大量冗余的波長變量對結果傳遞準確性和穩(wěn)定性的影響，選取SD 和相RSD 較大的波長點來進行聚類分析。一般認為SD 值小于5‰是由操作誤差引起的波動，剔除那些SD 值小于5 ‰的波長，有效波數范圍將縮小到7 500～4 000 cm-1；如果兩組數據的測量尺度相差太大，或者數據量綱的不同，直接使用SD 來進行比較不合適，因此選擇RSD較大的波長點。然而，吸收度趨近于0 的波數會造成較大RSD，故應首先篩選出平均值大于1%的波長。從圖5 可得，消除量綱后存在較大差異的波長點，且RSD 值均小于0.6。根據RSD 值從大到小選取20 個波長點，以下波段5 810～5 780 cm-1、4 725～4 740 cm-1、4 590～4 545 cm-1光譜存在較大差異，主要差異可能是由于蛋白質、淀粉組成和含量不同所導致。

圖3 CWT 處理后的光譜Fig.3 Spectra after CWT method

圖4 小波變換后的PCA 圖Fig.4 PCA graft after CWT

圖5 小波變換后的RSD 圖Fig.5 RSD Graph after CWT

針對這20 個具有較大差異的波長點進行PCA 分析。圖6 為通過CWT 以及變量篩選后的PCA 分析的結果，相較于只經過CWT 的PCA 結果，鑒別準確率得到進一步提高。從圖6 可知，不同生產日期批次D 類產品中D1 與D2 置信橢圓部分重疊，與D3 得到很好的區(qū)分，且D 類品牌與其它品牌互不重疊。不同生產日期批次B 類產品之間得到較好的鑒別，C 類產品的不同生產日期批次中C2 與C3 置信橢圓重合嚴重，與C1 得到了良好區(qū)分，同時，B 與C 類之間僅有C1 組的2個驗證集樣品落入B1 和C1 組置信橢圓重疊區(qū)域內，其余所有驗證集樣品均在各自品牌的置信橢圓內，不同品牌豆?jié){粉鑒別成功率達到了93.94%。假冒豆?jié){粉以及國內外豆?jié){粉之間的鑒別準確率達到了100%。國內品牌間鑒別未獲得100%準確率的原因可能是原料的大豆來源或生產加工工藝過于相似。Shi 等[19]對不同大豆品種的理化指標以及豆?jié){風味特征指標進行了分析。結果表明，蛋白質和脂質是造成不同豆?jié){粉風味差別的主要原因。Ma 等[20]的研究也表明加工前、后豆?jié){粉之間的蛋白質存在差異，從而導致豆?jié){粉風味存在一定差異。因此，可以推測具有較大RSD值的4740 cm-1波數點可能是來自于自磨與品牌豆?jié){粉在蛋白質含量或氨基酸組成的差異。

圖6 小波變換和波長篩選后的PCA 圖Fig6 PCA result after CWT and wavelength screening

3 結論

本研究通過近紅外光譜分析技術和化學計量學方法，實現(xiàn)了對假冒、國內外不同品牌豆?jié){粉的快速無損鑒別。通過對光譜進行了CWT 預處理，可有效消除背景和基線漂移的干擾；利用SD 與RSD 篩選出特征波段，在此基礎上進行PCA 分析可以獲得較好的鑒別結果，其中假冒豆?jié){粉、進口豆?jié){粉與國產豆?jié){粉之間的鑒別準確率達到了100%，而不同品牌豆?jié){粉之間的鑒別準確率達到了93.94%。近紅外結合化學計量方法快速無損分析豆?jié){粉是一種環(huán)保、高效的安全控制方法，并且可以應用于解決其它食品的摻偽摻假問題。