翟 璐 郭建軍 桑麗雅 金仁耀* 廖 杰

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310012 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 浙江工商大學(xué) 杭州 310012 4 杭州南開(kāi)日新生物技術(shù)有限公司 杭州 310051 5 浙江華才檢測(cè)技術(shù)有限公司 浙江諸暨 311800）

隨著工業(yè)化發(fā)展水平的不斷提升，向環(huán)境中排放的工業(yè)污染物不斷增多，重金屬就是其中的重要污染物之一。由于重金屬具有易富集、難降解等特性，對(duì)環(huán)境和食品質(zhì)量的安全風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大[1]。重金屬分布廣泛、難以降解，并且可以經(jīng)空氣、水和食物鏈等途徑在人體中富集，當(dāng)超過(guò)人體耐受極限值后容易引起嚴(yán)重的急慢性中毒，具有明顯的致癌、致畸及致突特性，并有很強(qiáng)的生殖和遺傳毒性[2-3]。隨著人們對(duì)重金屬危害認(rèn)識(shí)的提升，如何有效控制重金屬的危害成為目前研究的重點(diǎn)，特別是開(kāi)展如何減少重金屬的污染、提高重金屬的降解和治理效果等更是研究的熱點(diǎn)。為了摸清環(huán)境中重金屬殘留和降解的動(dòng)態(tài)分布規(guī)律，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)重金屬污染的危害程度，有必要加強(qiáng)重金屬的研究，特別是開(kāi)展重金屬的快速、準(zhǔn)確和高靈敏檢測(cè)技術(shù)研究，可為今后開(kāi)展重金屬污染監(jiān)控和治理提供有力的技術(shù)支撐。

當(dāng)前針對(duì)重金屬檢測(cè)最常用的技術(shù)主要是陽(yáng)極溶出伏安法（ASV）[4]、原子吸收光譜分析（AAS）[5-6]、電感耦合等離子發(fā)射光譜（ICP-AES）[7-8]、液相色譜法[9-10]和其它色譜-質(zhì)譜等聯(lián)用技術(shù)。雖然這些手段技術(shù)成熟，市場(chǎng)應(yīng)用廣泛，但這些分析技術(shù)也存在一些明顯的不足，主要表現(xiàn)為分析儀器貴重，檢測(cè)成本高，操作人員要求專業(yè)培訓(xùn)，樣品前處理過(guò)程中常使用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等試劑，樣品分析時(shí)間長(zhǎng)，不能大批量同時(shí)檢測(cè)，只能在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室中分析檢測(cè)等，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)的快速、大批量檢測(cè)需求。免疫分析技術(shù)具有儀器簡(jiǎn)便，人員操作簡(jiǎn)單，樣品前處理簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，可高通量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，檢測(cè)成本低及分析靈明度和準(zhǔn)確率理想等優(yōu)勢(shì)，已成為目前最具競(jìng)爭(zhēng)性和市場(chǎng)前景的檢測(cè)分析技術(shù)之一，并得到廣泛開(kāi)發(fā)和推廣應(yīng)用。

國(guó)外針對(duì)重金屬離子的免疫分析技術(shù)研究最早要追溯到20 世紀(jì)80 年代，如1985 年Reardan等[11]首次將重金屬In3＋和EDTA 螯合物制備完全抗原，并成功制備多克隆抗體，開(kāi)啟了重金屬免疫檢測(cè)技術(shù)研究。隨后國(guó)內(nèi)快速興起了采用免疫分析技術(shù)進(jìn)行重金檢測(cè)的研究，先后合成制備了重金屬Hg2+、Pb2+、Cd2+和Pb2+的人工抗原和特異性抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了相應(yīng)的免疫分析方法[12-16]。

重金屬離子結(jié)構(gòu)極其簡(jiǎn)單，且沒(méi)有活性基團(tuán)，只有與雙功能螯合劑螯合后，再與載體蛋白連接制備的復(fù)合物才具有免疫活性，才能篩選制備相應(yīng)的抗重金屬抗體。從現(xiàn)有研究報(bào)道來(lái)看，在制備重金屬離子制備人工抗原過(guò)程中涉及的雙功能螯合劑主要為DTPA、EDTA 和ITCBE 等的結(jié)構(gòu)衍生物[17-20]，這些螯合物在結(jié)構(gòu)上屬于直鏈開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)，螯合劑結(jié)構(gòu)中的多齒配體端與重金屬離子螯合形成螯合復(fù)合物，氨基或羧基等活性基團(tuán)端與載體蛋白偶聯(lián)后制備人工抗原，并在此基礎(chǔ)上制備多克隆或單克隆抗體，后續(xù)建立免疫分析方法用于重金屬檢測(cè)。

與所述研究報(bào)道不同，本研究選用的雙功能螯合劑2-S-（4-氨基苯）-1，4，7 三氮雜環(huán)壬烷-1，4，7-三乙酸（P-NH2-Bn-NOTA，以下簡(jiǎn)稱NOTA）在結(jié)構(gòu)上屬于閉環(huán)結(jié)構(gòu)，以重金屬鉛為研究對(duì)象，采用半抗原、完全抗原和多克隆抗體的制備技術(shù)，參考本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)表的論文中相關(guān)技術(shù)路線和手段[21]，通過(guò)合成重金屬Pb2+人工抗原，制備兔克隆抗體，建立免疫分析方法來(lái)評(píng)價(jià)人工抗原和抗體特性，研究閉環(huán)結(jié)構(gòu)雙功能螯合劑在制備重金屬離子抗體中的效果，為今后優(yōu)化重金屬離子人工抗原技術(shù)方案和完善重金屬抗體制備體系提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HRP 標(biāo)記羊抗兔酶標(biāo)二抗、雞卵清蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA），美國(guó)Sigma 公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、硝酸鉛水合物（99.99%）、Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液、Zn2+標(biāo)準(zhǔn)溶液、Cd2+標(biāo)準(zhǔn)溶液、Fe2+鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、吐溫-20，上海阿拉丁公司；2-S-（4-氨基苯）-1，4，7 三氮雜環(huán)壬烷-1，4，7-三乙酸（P-NH2-Bn-NOTA），美國(guó)AREVA MED 公司；超濾離心管（Amicon Ultra-15，30KD），美國(guó)密理博公司；Bardford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，江蘇碧云天；96 孔酶標(biāo)板，廣州潔特；其它試劑市售所得，均為AR 級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Fresco 21 型離心機(jī)、紫外分光度計(jì)，美國(guó)熱電公司；萬(wàn)分之一分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；超純水制備儀，美國(guó)密理博公司；移液器，德國(guó)艾本德公司；自動(dòng)洗板機(jī)，美國(guó)分子設(shè)備公司；電泳儀、酶標(biāo)儀，美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)、動(dòng)物免疫和采血等在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.4 方法

1.4.1 人工抗原的合成 采用戊二醛法[21]合成免疫原Pb-NOTA-BSA。技術(shù)路線見(jiàn)圖1。具體試驗(yàn)步驟如下：

配制NOTA 螯合劑溶液，稱取7.5 mg NOTA，用0.01 mol/L，pH 7.4 N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）溶液2 mL 充分溶解，此反應(yīng)液為A液；

配制7.5×10-2mol/L 的硝酸鉛溶液，稱取124.2 mg 硝酸鉛，用5 mL 超純水充分溶解，此反應(yīng)液為B 液；

吸取上述配制好的硝酸鉛溶液170 μL 逐滴加入到NOTA 螯合劑溶液中，室溫避光緩慢攪拌4 h 后逐滴加入20 mmol/L 的戊二醛溶液600 μL，室溫避光條件下攪拌反應(yīng)12～14 h 為重金屬螯合劑復(fù)合物；

稱取30 mg BSA 溶解于3 mL HEPES 中，逐滴加入反應(yīng)好的重金屬螯合劑復(fù)合物，室溫下避光攪拌反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液裝入8 ku的透析袋，用0.01 mol/L，pH 7.4 HEPES 透析1 d。期間更換透析液4 次，然后反應(yīng)液再用30 ku的超濾離心管8 000 r/min 離心4 次，后用0.01 mol/L，pH 7.4 的HEPES 溶液5 mL 充分溶解分裝后置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。包被原Pb-NOTA-OVA的合成方法與合成步驟同上，區(qū)別在于BSA 代替OVA。

圖1 鉛人工抗原合成路線Fig.1 Reaction schemes of synthesis for artificial antigen of heavy metal Pb2+

1.4.2 人工抗原的鑒定 金屬-螯合劑復(fù)合物及人工抗原的合成效果鑒定采用紫外掃描法和SDS-PAGE 法進(jìn)行。紫外掃描方案：將Pb-NOTA、OVA、BSA、包被抗原Pb-NOTA-OVA 和免疫抗原Pb-NOTA-BSA 先在不同濃度下進(jìn)行預(yù)掃描，后配制合適濃度的溶液在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度，根據(jù)不同波長(zhǎng)的吸光值建立吸收曲線，通過(guò)對(duì)比最大吸收峰所在的波長(zhǎng)數(shù)值位移變化程度來(lái)判定合成試驗(yàn)效果。SDS-PAGE 電泳方案：濃縮膠選擇體積分?jǐn)?shù)5%，濃縮膠電壓75 V，分離膠選擇體積分?jǐn)?shù)10%，分離膠電壓100 V，樣品上樣量為每孔10 μL，考馬斯亮藍(lán)染色1 h，在搖床上脫色4 次后，將電泳膠放入凝膠成像儀中拍照分析。

1.4.3 人工抗原結(jié)合比的測(cè)定 將制備好的人工抗原分別測(cè)定其載體蛋白濃度和重金屬離子濃度，然后將測(cè)定含量轉(zhuǎn)化為摩爾濃度后進(jìn)行比較，即可測(cè)定出每個(gè)載體蛋白偶聯(lián)的重金屬離子數(shù)量。蛋白濃度采用商品化的BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定，Pb2+離子濃度采用電感耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS）測(cè)定。

1.4.4 多克隆抗體的免疫 選取3 只體重為2.5 kg 左右的新西蘭大白兔，以Pb-NOTA-BSA 為免疫原免疫兔子。免疫方案和免疫劑量見(jiàn)表1。

表1 免疫原Pb-NOTA-BSA 免疫方案Table 1 The immune protocol of immunogen Pb-NOTA-BSA

從第2 次加強(qiáng)免疫7 d 的兔耳靜脈采1 mL血吸入EP 管中，在6 000 r/min 條件下離心10 min 后取上清10 μL 加入到2 mL 的pH 7.4，0.01 mol/L 的PBS 緩沖液中，后繼續(xù)用該緩沖液進(jìn)行倍比稀釋抗體效價(jià)，陰性對(duì)照則選用未免疫兔子血清或初免之前采集的兔子血清，選擇檢測(cè)血清與陰性對(duì)照血清OD450值的比值大于2.1 所在最大稀釋倍數(shù)為效價(jià)指標(biāo)。當(dāng)抗體效價(jià)與前次免疫檢測(cè)效價(jià)值變化不明顯則表明可以進(jìn)行末次免疫。抗體效價(jià)測(cè)定采用ELISA 方法進(jìn)行，具體步驟如下：

1）包被：pH 9.6，0.05 mol/L CBS 為包被緩沖液，包被原Pb-NOTA-OVA 質(zhì)量濃度為10 μg/mL，包被量為100 μL/孔，37 ℃包被2 h，洗板4次，吸水紙上拍干；

2）封閉：每孔加入2%脫脂牛奶300 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，洗板4 次，吸水紙上拍干；

3）加一抗：一抗起始濃度為200 倍稀釋液，后倍比稀釋11 個(gè)梯度和1 個(gè)陰性對(duì)照，每孔加100 μL，每濃度4 孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h，洗板4 次，吸水紙上拍干；

4）加酶標(biāo)二抗：每孔加入10 000 倍稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h，洗板4 次，吸水紙上拍干；

5）加底物顯色：每孔加入100 μL TMB 底物緩沖液，37 ℃反應(yīng)20 min；

6）加硫酸終止反應(yīng)：在底物液基礎(chǔ)上加入2 mol/L 硫酸50 μL/孔，后讀取OD450值并進(jìn)行計(jì)算分析。

1.4.5 多克隆抗體的提取與純化 采血收集的抗血清按照辛酸-硫酸銨法[22]純化，具體純化步驟為：

1）抗血清用60 mmol/L pH 4.0 的醋酸鹽緩沖溶液稀釋，其血清與醋酸鹽緩沖液稀釋體積比為1∶4，混勻后再用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)pH 值至4.5；

2）按照每1 mL 血清滴加75 μL 辛酸的比例逐滴加入，室溫下磁力攪拌反應(yīng)30 min，置于4 ℃冰箱2 h，10 000 r/min 離心30 min；

3）離心后上清用定性濾紙過(guò)濾，上清用10倍體積的0.1 mol/L PBS 稀釋，攪拌混勻后用1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.4，置于4 ℃冰箱中30 min 預(yù)冷；

4）按照每1 mL 混合液加入0.277 g 硫酸銨比率在磁力攪拌下分批加入，加完后繼續(xù)攪拌反應(yīng)30 min，置于4 ℃冰箱中靜置3 h，12 000 r/min 離心30 min，棄上清；

5）剩余沉淀用5～10 mL 0.01 mol/L PBS 溶解后裝入8 ku 透析袋中透析以去除辛酸、硫酸銨等，透析液選用pH 7.4，0.01 mol/L 的PBS，在4℃冰箱中透析2 d，中間更換透析液4～6 次，透析完全后將透析袋內(nèi)溶液分裝后置于-20 ℃冷凍，冷凍干燥制備抗體凍干粉。

1.4.6 多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定 效價(jià)測(cè)定方法與1.4.4 節(jié)所述一致，不同點(diǎn)在于將抗體凍干粉代替抗血清。

1.4.7 抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 通過(guò)正交試驗(yàn)確定抗原抗體最佳工作濃度，采用間接競(jìng)爭(zhēng)-ELISA 試驗(yàn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體試驗(yàn)步驟如下：

1）包被：用pH 9.6，0.05 mol/L CBS 稀釋適當(dāng)濃度的包被原Pb-NOTA-OVA 后加入酶標(biāo)板，每孔100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h，洗板4 次后拍干；

2）封閉：每孔加入250 μL，2%脫脂牛奶封閉，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，洗板4 次后拍干；

3）樣品前處理：不同濃度梯度重金屬鉛離子標(biāo)樣與5 mmol/L NOTA 按照1∶1 比例預(yù)混均勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h；

4）加樣：每孔分別加入50 μL 預(yù)混好的樣品和2 倍工作濃度一抗，微量振蕩器上混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h，洗板4 次后拍干；

5）加酶標(biāo)二抗：每孔加入10 000 倍稀釋的羊抗兔HRP 標(biāo)記二抗100 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h，洗板4 次后拍干；

6）加底物顯色：每孔加入100 μL TMB 底物緩沖液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min；

7）加硫酸終止反應(yīng)：每孔加入2 mol/L 硫酸50 μL，讀取OD450值進(jìn)行計(jì)算分析。

1.4.8 抗體特異性測(cè)定 采用間接競(jìng)爭(zhēng)-ELISA法進(jìn)行交叉反應(yīng)率測(cè)定。具體試驗(yàn)步驟與1.4.5 節(jié)所述一致，不同點(diǎn)在于用其它重金屬離子代替銅離子進(jìn)行ic-ELISA 檢測(cè)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算IC50值，然后根據(jù)公式：CR（%）=IC50（銅離子）/IC50（待測(cè)重金屬）×100，測(cè)定交叉反應(yīng)率結(jié)果，評(píng)價(jià)抗體的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原合成的鑒定

根據(jù)圖2 的紫外掃描結(jié)果顯示，制備的包被抗原（Pb-NOTA-OVA）和免疫抗原（Pb-NOTABSA）最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生位移改變，初步說(shuō)明載體蛋白上成功偶聯(lián)上了雙功能螯合劑和鉛離子。

人工抗原SDS-PAGE 電泳結(jié)果如圖3 所示。從圖中可知，與BSA 和OVA 相比，免疫抗原（Pb-NOTA-BSA）與包被抗原（Pb-NOTA-OVA）電泳條帶出現(xiàn)明顯滯后現(xiàn)象，說(shuō)明制備的2 種人工抗原的分子質(zhì)量均分別比BSA 和OVA 大，說(shuō)明一定數(shù)量的重金屬螯合物連接到載體蛋白上，進(jìn)一步證明偶聯(lián)成功。

2.1.1 人工抗原結(jié)合比的測(cè)定 制備的人工抗原進(jìn)行結(jié)合比測(cè)定，蛋白濃度測(cè)定采用Bradford 法試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，重金屬離子含量采用ICP-MS法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)測(cè)定蛋白濃度和重金屬離子濃度計(jì)算免疫原和包被原的結(jié)合比分別為9∶1 和7∶1，說(shuō)明人工抗原合成成功。

圖2 鉛人工抗原紫外掃描圖Fig.2 UV spectrum of Pb artificial antigen

圖3 鉛人工抗原的SDS-PAGE 電泳圖Fig.3 The SDS-PAGE of Pb artificial antigen

2.1.2 抗體效價(jià)測(cè)定 經(jīng)ic-ELISA 方法測(cè)定，免疫的3 只兔子所制備的多克隆抗體的效價(jià)從低到高分別為16 000∶1、32 000∶1 和45 000∶1，說(shuō)明制備的抗原效果好，動(dòng)物免疫應(yīng)答強(qiáng)烈，制備獲得理想的多克隆抗體，選用45 000∶1 效價(jià)的多克隆抗體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 經(jīng)測(cè)定，包被抗原和一抗的工作質(zhì)量濃度分別為1.5 μg/mL 和2.2 μg/mL，并在此工作質(zhì)量濃度下建立ic-ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4），經(jīng)擬合曲線回歸方程為y=12.127ln（x）-11.386（R2=0.9961），其IC50和IC20值分別為157.89 ng/mL 和13.30 ng/mL。

2.1.4 抗體交叉反應(yīng)率測(cè)定 用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)其它重金屬離子的IC50值（表2），除了與Cd2+的交叉反應(yīng)率達(dá)到12.3%外，與其它重金屬離子的CR 值均低于5.3%，說(shuō)明制備的抗重金屬鉛離子多克隆抗體的特異性較理想。

圖4 間接競(jìng)爭(zhēng)ic-ELISA 抑制率標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Inhibition reaction of indirect competitive ELISA

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以NOTA 和Pb2+為研究對(duì)象，采用戊二醛法成功制備了免疫抗原（Pb-NOTA-BSA）與包被抗原（Pb-NOTA-OVA），通過(guò)動(dòng)物免疫，抗血清的采集、純化和鑒定獲得優(yōu)質(zhì)抗重金屬鉛的兔多克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了ic-ELISA 分析方法，線性回歸方程為y=12.127ln（x）-11.386（R2=0.9961），IC50和IC20分別為157.89 ng/mL 和13.30 ng/mL。除與Cd2+的CR 值達(dá)到12.3%外，與其它重金屬離子的CR 值均較低，說(shuō)明成功制備了抗重金屬鉛的多克隆抗體，試驗(yàn)結(jié)果為閉環(huán)結(jié)構(gòu)雙功能螯合劑在重金屬制備抗體中的可行性提供了技術(shù)參考，為后續(xù)開(kāi)展重金屬離子單、多克隆抗體制備及免疫分析技術(shù)研究提供技術(shù)依據(jù)。

表2 多克隆抗體與重金屬離子的交叉反應(yīng)Table 2 Cross reactivity of polyclonal antibody for heavy metal ion