張馨月 岳曉潔 李錚崢 劉 倩 黃 茜 馬美湖 付 星

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 國家蛋品加工技術(shù)研究分中心 武漢 430070）

殼聚糖酶（EC 3.2.1.132）是一種催化殼聚糖中氨基葡萄糖之間β-1，4-糖苷鍵，并水解釋放殼寡糖的糖基水解酶[1]。由于殼寡糖有比殼聚糖更高效的抗菌、抗氧化、降血脂、降血壓、預(yù)防感染，控制關(guān)節(jié)炎以及增強(qiáng)抗腫瘤作用[2]，殼聚糖酶的降解作用廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[3]。

殼聚糖酶主要來自于細(xì)菌，有關(guān)真菌殼聚糖酶的研究報(bào)道相對較少。與細(xì)菌酶相比，真菌酶具有高效性和相容性，成本低，適于工業(yè)化生產(chǎn)，如酶蛋白的穩(wěn)定性、廣泛的多樣性及菌絲體易分離等[4-5]。真菌殼聚糖酶不僅可制備具有生物活性的殼寡糖和真菌原生質(zhì)體，還可作為針對病原真菌和昆蟲的有效生物防治劑，或者應(yīng)用于生物廢物的轉(zhuǎn)化[1]，有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]。針對真菌殼聚糖酶的研究，目前主要集中在曲霉屬[7-8]、木霉屬[9-10]、青霉屬[11-13]、毛霉屬[14]等，有必要在菌株篩選遺傳改良做進(jìn)一步深入探索[1]。

菌株發(fā)酵產(chǎn)酶可分為液體發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵，普遍采用液體培養(yǎng)基。固態(tài)發(fā)酵是指微生物在固體物質(zhì)上生長的發(fā)酵過程，微生物生長所需的水分以固體基質(zhì)吸附狀態(tài)存在[15]。固態(tài)發(fā)酵可以使用廉價(jià)的農(nóng)業(yè)工業(yè)殘留物，如麥麩、蝦副產(chǎn)品等[1，16]。采用固態(tài)發(fā)酵更利于霉菌生產(chǎn)高效價(jià)的微生物胞外酶，并且被認(rèn)為是一種經(jīng)濟(jì)有效的液體深層發(fā)酵替代方法。如閔偉紅等[17]經(jīng)過優(yōu)化固體發(fā)酵條件，使誘變后的枯青霉產(chǎn)纖溶酶總酶活提高1.32倍。另外Silva 等[9]報(bào)道了哈茨木霉（T.harzianum）、康寧木霉（T.koningii）、綠色木霉（T.viride）和多孢木霉（T.polyporum）通過固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶，并且從溫度和pH 值對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）是一種在土壤和植被中發(fā)現(xiàn)的真菌，較為新穎，于2012 年被Johny等[18]報(bào)道。因其有利于防治植物寄生線蟲，故作為生防菌大范圍應(yīng)用[19]。Chao 等[20]利用淡紫紫孢菌，采用液體搖床發(fā)酵分離純化出D-氨基葡萄糖苷酶（外切型），可促進(jìn)95%的脫乙酰殼聚糖從其非還原端水解并釋放氨基葡萄糖（GlcN），同時(shí)利用電噴霧電離質(zhì)譜分析其水解模式。目前，尚沒有關(guān)于優(yōu)化淡紫紫孢菌固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶條件的研究報(bào)道。本研究旨在篩選出一株新穎、傳代穩(wěn)定及產(chǎn)殼聚糖酶活力高的真菌菌株，利用單因素和響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化菌株固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶條件，為促進(jìn)殼聚糖酶工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土樣來自于中國杭州、邯鄲、武漢等地；殼聚糖，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白胨，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；酵母浸粉，安琪酵母股份有限公司；瓊脂粉，德國Biofroxx 公司；麩皮和豆粕，武漢當(dāng)?shù)厥袌?；乙二醇?xì)ぞ厶?、熒光增白?8、SDS-PAGE 凝膠試劑盒，美國Sigma 公司；其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

752N 紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Model 5414 高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman 公司；SW-CJ-2D 超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-250BS-II 生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DYY-III2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京市六一儀器廠；DF-101S 磁力攪拌水浴鍋，武漢科爾儀器設(shè)備有限公司；TG16-II 離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基組成 初篩平板培養(yǎng)基（g/L）：膠體殼聚糖5，KH2PO40.7，K2HPO40.3，蛋白胨2.5，酵母粉 2.5，NaCl 5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01；瓊脂20；自然pH 值。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：膠體殼聚糖 5，KH2PO40.7，K2HPO40.3，蛋白胨2.5，酵母粉2.5，NaCl 5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01；自然pH 值。裝液量為50 mL/250 mL。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：固體基質(zhì)12 g，其中麩皮、豆粕各6 g，置于250 mL 錐形瓶，加入20 mL 甲液和10 mL 乙液。甲液（g/L）：膠體殼聚糖10（pH 6.0）。乙液（g/L）：KH2PO41.4，K2HPO40.6，蛋白胨5，酵母粉 5，NaCl 10，MgSO4·7H2O 1.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02；自然pH 值。

粗酶液制備：無菌水稀釋產(chǎn)殼聚糖酶菌株為菌懸液，適量接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)完全加入pH 5.6 醋酸緩沖液150 mL，于4 ℃條件下磁力攪拌4 h。過濾后，將濾液4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，收集上清液，4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌株篩選及鑒定 滅菌的生理鹽水按照不同梯度稀釋土樣，涂布于初篩平板培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)3～6 d。隨后，對有明顯透明圈的單個(gè)菌落開展劃線純化培養(yǎng)。測量菌落直徑d 和透明圈直徑D，以D/d 值作為衡量產(chǎn)殼聚糖酶能力的初篩標(biāo)準(zhǔn)。初篩的菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)，37 ℃，4 d，通過DNS 法測定產(chǎn)酶活力高的菌株。

按照分子生物學(xué)操作手冊提取目標(biāo)菌株的DNA，利用真菌18S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果委托華大基因測序，將其具體測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因比對。根據(jù)比對結(jié)果，在ClustalX 和MEGA 軟件的輔助下構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

采用插片法培養(yǎng)該真菌，乳酸石炭酸棉藍(lán)染料染色15 min 制片，高倍鏡下觀察該菌株形態(tài)學(xué)。

1.3.3 殼聚糖酶活力及蛋白質(zhì)含量測定 采用DNS 法測還原糖的原理測定殼聚糖酶活力，取450 μL 膠體殼聚糖溶液（10 g/L）和400 μL 醋酸緩沖液（pH 5.6）于2 mL 離心管中，50 ℃水浴鍋中提前預(yù)熱30 min，再向離心管中加入150 μL 粗酶液。于50 ℃中恒溫反應(yīng)30 min，迅速加入750 μL DNS 終止反應(yīng)，渦旋儀振蕩均勻，沸水浴中顯色5 min。待反應(yīng)體系冷卻后，12 000 r/min 離心10 min。取上清液于在540 nm 處測定吸光值。酶活力單位（U）定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放1 μmol 氨基葡萄糖所需要的酶量。蛋白質(zhì)定量主要參考Lowry 法[21]，使用牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 產(chǎn)殼聚糖酶固體發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化 因目標(biāo)菌株M7a 液體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的酶活力較低，為提高其殼聚糖酶活力，以及結(jié)合霉菌的發(fā)酵產(chǎn)酶特性，故采用固體發(fā)酵并優(yōu)化其固體發(fā)酵條件。單因素優(yōu)化包括碳源、氮源、初始pH 值、發(fā)酵溫度、麩皮豆粕質(zhì)量比及發(fā)酵時(shí)間。選擇10 g/L 粉末殼聚糖、膠體殼聚糖、幾丁質(zhì)粉末、膠體幾丁質(zhì)、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉以及在10 g/L 膠體殼聚糖基礎(chǔ)上添加5 g/L 葡萄糖和蔗糖為碳源，通過添加不同碳源，觀察對目標(biāo)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。在最佳碳源基礎(chǔ)上，選取10 g/L 蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、硫酸銨、硝酸銨、尿素為氮源，進(jìn)一步確定最佳氮源。在最適碳源和氮源的條件下，梯度改變固體發(fā)酵培養(yǎng)基（乙液）起始pH（4.0～9.0）和培養(yǎng)溫度（27～52 ℃，5 ℃為梯度），確定最佳初始pH 值和發(fā)酵溫度。然后改變培養(yǎng)基中豆粕麩皮的比例，觀察對菌株產(chǎn)殼聚糖酶的影響。最后，在以上單因素最優(yōu)條件下培養(yǎng)，在0～8 d 連續(xù)觀察菌株M7a 產(chǎn)蛋白質(zhì)和殼聚糖酶活力，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.3.5 產(chǎn)殼聚糖酶固體發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶條件進(jìn)一步優(yōu)化，開展基于Box-Behnken 設(shè)計(jì)的3因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見下表1。

表1 響應(yīng)面分析的因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3.6 SDS-PAGE 及酶譜分析 SDS-PAGE 電泳采用濃度為12%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠。電泳后固定液固定30 min，考馬斯亮藍(lán)R-250 染色30 min，水洗后利用Gel-Pro analyzer 軟件分析蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量。殼聚糖酶的酶譜分析，于電泳分離膠中加入溶解完全的乙二醇?xì)ぞ厶?，使其在分離膠中的質(zhì)量濃度保持在100 mg/L。電泳結(jié)束后，分離膠用10 mL/L Triton X-100 復(fù)性劑振蕩復(fù)性36 h。然后，用熒光染料染色5 min，水洗1 h，將電泳膠置于紫外燈下觀察，所在位置的條帶顯示為暗帶表明具有殼聚糖酶活性。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 采用 Excel 2010、OriginPro 2017C 64Bit 及Design-Expert8.0.6 軟件進(jìn)行分析做圖，試驗(yàn)中各發(fā)酵條件的優(yōu)化均做3 次平行，結(jié)果取3 次結(jié)果的均值，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)誤差及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)殼聚糖酶菌株的篩選及鑒定

通過初篩培養(yǎng)基，從土樣中篩選出有明顯透明圈且能夠高產(chǎn)殼聚糖酶的菌株。其中菌株M7a產(chǎn)殼聚糖酶活性較高，透明圈與菌落直徑比（D/d）為4.8，初始酶活力達(dá)到3.29 U/mL，且傳代產(chǎn)酶較為穩(wěn)定，因此將M7a 作為目標(biāo)菌株。圖1a，1b 顯示M7a 菌落質(zhì)地緊密，初白色圓形顆粒狀，后變?yōu)榈涎蚱?，背面淡黃色。分生孢子短而密，顯微鏡下孢子梗直立呈分支狀，分生孢子橢圓到梭形，無厚壁孢子。進(jìn)一步通過18S rDNA 分析，測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對。圖1c 顯示菌株M7a與淡紫紫孢菌HT011（MH512954.1）同屬一個(gè)分支，結(jié)合菌株形態(tài)鑒定M7a 為淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）。

2.2 單因素優(yōu)化淡紫紫孢菌M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶

2.2.1 碳源對淡紫紫孢菌M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的影響 選擇粉末殼聚糖、膠體殼聚糖、幾丁質(zhì)粉末、膠體幾丁質(zhì)、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、CMC 進(jìn)行菌株產(chǎn)殼聚糖酶固體發(fā)酵碳源優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果如圖2a。10 g/L 膠體殼聚糖+5 g/L 葡萄糖為碳源時(shí)產(chǎn)酶水平最高，達(dá)到9.75 U/mL，其次為10 g/L 膠體殼聚糖+5 g/L 蔗糖（9.49 U/mL）、10 g/L膠體殼聚糖（9.33 U/mL）和10 g/L 殼聚糖粉末（5.62 U/mL）。以膠體幾丁質(zhì)、幾丁質(zhì)粉末為碳源時(shí)，殼聚糖酶活力較低。而葡萄糖、蔗糖、CMC 或可溶性淀粉為碳源時(shí)，殼聚糖酶幾乎沒有活力。殼聚糖酶可分為誘導(dǎo)酶和組成酶，其中組成酶無需殼聚糖底物誘導(dǎo)也能產(chǎn)酶且主要來于植物病原真菌[22]，結(jié)果顯示，淡紫紫孢菌M7a 產(chǎn)殼聚糖酶為誘導(dǎo)酶，需要?dú)ぞ厶钦T導(dǎo)的作用。這與陳小娥等[23]的報(bào)道相似，而Nguyen 等[10]報(bào)道的Penicillium janthinellum D4 則以海螵鞘粉末為誘導(dǎo)碳源。雖然蔗糖和葡萄糖不誘導(dǎo)菌株產(chǎn)殼聚糖酶，但有利于菌體生長繁殖，當(dāng)與膠體殼聚糖復(fù)合作為碳源時(shí)，產(chǎn)酶活力達(dá)到最高。另外，粉末和膠體幾丁質(zhì)均基本無法被菌體所同化利用[24]。

圖2 碳源（a）、氮源（b）、pH 值（c）、培養(yǎng)溫度（d）、豆粕麩皮質(zhì)量比（e）對淡紫紫孢菌M7a 產(chǎn)殼聚糖酶的影響Fig.2 Effect of carbon sources（a），nitrogen sources（b），pH value（c），culture temperature（d）and the mass ratio of soybean meal（e）on chitosanase production by P.lilacinum M7a

2.2.2 氮源對淡紫紫孢菌M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的影響 在最佳碳源的條件下，選擇不同氮源優(yōu)化菌株固體發(fā)酵產(chǎn)酶。如圖2b 所示，其中蛋白胨作為氮源時(shí)酶活力達(dá)到最高（10.10 U/mL），其次為硫酸銨和酵母浸粉，硝酸銨產(chǎn)酶活力最低（3.46 U/mL）。結(jié)果表明，該菌株不僅可以利用有機(jī)氮產(chǎn)殼聚糖酶，也可以利用無機(jī)氮源，對于氮源的選擇具有廣譜性。而Sinha[7]報(bào)道的A.fumigatus IIT-004 則以酵母浸粉為產(chǎn)殼聚糖酶的氮源。

2.2.3 培養(yǎng)基初始pH 值對淡紫紫孢菌M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的影響 培養(yǎng)基的初始pH 值對微生物攝取利用外界環(huán)境中的營養(yǎng)和分泌積累代謝物有一定的作用，調(diào)節(jié)固體發(fā)酵培養(yǎng)基的乙液為不同pH 值，比較不同條件下的酶活力，得出發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)pH 值，結(jié)果如圖2c 所示。該菌株產(chǎn)酶活力在pH 為6.0 時(shí)最高（11.09 U/mL）。當(dāng)pH在5.0～8.0 之間時(shí)，pH 值對菌株發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的影響不大。當(dāng)初始pH 值繼續(xù)降低至4.0 時(shí)，與升高至9.0 相比，殼聚糖酶活力下降更顯著，僅為最高酶活的14.86%。得出最佳pH 為6.0。Silva等[8]所報(bào)道的Trichoderma koningii sp.產(chǎn)殼聚糖酶最佳pH 為5.5，條件均偏酸性。

2.2.4 溫度對淡紫紫孢菌M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的影響 溫度是微生物發(fā)酵的重要因素，對酶的產(chǎn)生、合成階段的持續(xù)時(shí)間以及固體產(chǎn)物的穩(wěn)定性有一定程度的影響[16]。在最佳碳源、氮源以及pH 值的條件下，觀察溫度對菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖2d 所示。淡紫紫孢菌M7a 在較廣的溫度范圍（27～52 ℃）保持產(chǎn)酶能力，當(dāng)發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)酶活力達(dá)到最高，為16.33 U/mL。當(dāng)溫度為27 ℃或37 ℃時(shí)，菌株產(chǎn)殼聚糖酶能力較高，沒有明顯下降，分別為最高酶活的71.4%和85.9%。當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到42 ℃時(shí)，產(chǎn)殼聚糖酶量明顯下降，為最高酶活的53.2%，酶活力損失接近一半。在一定溫度范圍內(nèi)，微生物生長代謝速率與溫度呈正相關(guān)；然而像蛋白質(zhì)、核酸等作為組成生物機(jī)體的重要物質(zhì)，會隨著溫度升高造成永久性的損壞[25]。另外，低溫也會阻礙真菌生長。因此，菌株在最佳發(fā)酵溫度32 ℃條件下，有良好的產(chǎn)酶效果。Aktuganov 等[12]報(bào)道青霉菌（Penicillium sp.）最適發(fā)酵溫度為28 ℃。周念波等[26]報(bào)道芽孢桿菌（Bacillus sp.LS）最適發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶溫度為55 ℃。不同的菌株產(chǎn)殼聚糖酶所需的最佳培養(yǎng)溫度有很大差異。淡紫紫孢菌M7a 的最佳固體發(fā)酵溫度相對而言較溫和，沒有低溫或高溫的嚴(yán)格要求，更有利于工業(yè)生產(chǎn)。

2.2.5 豆粕麩皮質(zhì)量比對淡紫紫孢菌M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的影響 豆粕營養(yǎng)豐富，含有大量多種的蛋白質(zhì)和比例平衡的氨基酸以及糖類、無機(jī)鹽等，主要可以提供豐富的氮源。培養(yǎng)基中隨著殼聚糖含量的增加而促進(jìn)產(chǎn)酶，而麩皮的增加不利于產(chǎn)酶[9]。由于麩皮強(qiáng)吸水力[27]且能夠增加介質(zhì)孔隙度，同時(shí)可以提供一些營養(yǎng)物質(zhì)，如淀粉、維生素、生物素等，因此適當(dāng)添加可以滿足菌株固體發(fā)酵產(chǎn)酶必需。充分利用豆粕麩皮作為固體培養(yǎng)基原料，一方面綠色環(huán)保，減少農(nóng)業(yè)廢棄物對環(huán)境的不良影響；另一方面，提高了菌株M7a 產(chǎn)殼聚糖酶的能力，促進(jìn)高效產(chǎn)酶，降低成本。在測定的最適條件下，通過調(diào)整豆粕麩皮的質(zhì)量比，優(yōu)化菌株固體發(fā)酵產(chǎn)酶。測定結(jié)果如圖2e 所示，其中酶活力在豆粕麩皮質(zhì)量比為7∶5 的條件下達(dá)到最高（16.44 U/mL）。因此，7∶5 為最佳豆粕麩皮質(zhì)量比。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對淡紫紫孢菌M7a 產(chǎn)殼聚糖酶的影響Fig.3 Effect of culture time on chitosanase production by P.lilacinum M7a

2.2.6 培養(yǎng)時(shí)間對淡紫紫孢菌M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的影響 在最佳發(fā)酵條件下，觀察發(fā)酵時(shí)間對菌株產(chǎn)殼聚糖酶的影響，包括產(chǎn)殼聚糖酶活力和蛋白質(zhì)含量，如圖3 所示。在培養(yǎng)第1 天，固體發(fā)酵培養(yǎng)基無明顯菌絲，殼聚糖酶活力和蛋白質(zhì)含量很低。之后的2～3 d，開始出現(xiàn)白色菌絲，酶活和蛋白質(zhì)含量緩慢提高。第4 天時(shí)，培養(yǎng)基出現(xiàn)大量白色菌絲，菌株的殼聚糖酶活和蛋白質(zhì)含量較前1 天提高了很多，達(dá)到14.28 U/mL。菌株產(chǎn)殼聚糖酶活力和蛋白質(zhì)含量在第5 天達(dá)到最高，為16.66 U/mL。在培養(yǎng)到6 d 時(shí)，殼聚糖酶活力開始下降，同時(shí)蛋白質(zhì)含量也開始下降。之后的7～8 d 內(nèi)，菌絲顏色由白色變暗紫褐色，酶活力和蛋白質(zhì)含量接近直線下降。可能是由于隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌體細(xì)胞開始成熟老化以及發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)損耗與代謝累積，破壞了菌體細(xì)胞產(chǎn)殼聚糖酶最適環(huán)境。另外，可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中殼聚糖酶活力的變化同菌體胞外蛋白質(zhì)含量的變化趨勢相近。因此，培養(yǎng)5 d 為菌株產(chǎn)酶的最佳時(shí)間。與已報(bào)道的煙曲霉A.fumigatus IIT-004（7 d）[15]、Penicillium janthinellum D4（6 d）[10]相比，淡紫紫孢菌M7a 產(chǎn)酶效率更高，同時(shí)適中的發(fā)酵周期也有利于實(shí)際操作和降低成本。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化淡紫紫孢菌M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果，選擇培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基（乙液）起始pH 值以及培養(yǎng)時(shí)間為自變量，菌株M7a 產(chǎn)殼聚糖酶活力為響應(yīng)值。基于Box-Behnken 設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.3.2 模型的建立及統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn) 采用回歸分析法處理響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得出菌株M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶活力（Y）對試驗(yàn)因素培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)基（乙液）起始pH（B）、培養(yǎng)時(shí)間（C）的三元二次多項(xiàng)回歸方程：Y=16.63+0.45A+0.31B+0.84C+0.18AB+0.52AC+0.20BC-1.29A2-1.23B2-0.97C2，相關(guān)系數(shù)R2=0.9656，說明回歸方程擬合良好，結(jié)果科學(xué)，可以分析預(yù)測菌株M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶活力。

對回歸模型進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn)，從表3 可知，該模型極顯著（模型的F=21.80，P=0.0003）；失擬項(xiàng)P=0.2515＞0.05，不顯著則說試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型相符，無異常；R2Adj=0.9213，模型能夠解釋92.13%的響應(yīng)值變化。此回歸模型的一次項(xiàng)A、交互項(xiàng)AC 對菌株M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶活力影響顯著；一次項(xiàng)C、二次項(xiàng)A2、B2、C2對酶活力影響極顯著。

2.3.3 響應(yīng)面的分析 通過響應(yīng)曲面圖和等高圖，進(jìn)一步分析培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基（乙液）起始pH值以及培養(yǎng)時(shí)間對淡紫紫孢菌M7a 產(chǎn)殼聚糖酶活力的影響，結(jié)果如圖4 所示。兩因素之間交互作用的強(qiáng)弱可以通過等高圖的形狀體現(xiàn)，其中橢圓說明兩因素交互作用顯著，形狀為圓形則說明交互作用不顯著[28]。同時(shí)，響應(yīng)曲面坡度越陡，則表明兩因素交互作用對菌株產(chǎn)酶活力影響越大[29]。溫度和時(shí)間的交互作用對菌株產(chǎn)酶活力影響顯著。另外，由圖4 等高線圖可知，時(shí)間對產(chǎn)酶酶活力影響最大，依次為溫度、pH 值。綜上與回歸方差分析表結(jié)果一致。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for response surface of the quadratic polynomial model

圖4 各因素交互作用對淡紫紫孢菌產(chǎn)殼聚糖酶的影響Fig.4 The pairwise interaction of various factors on chitosanase production by P.lilacinum M7a

2.3.4 實(shí)際優(yōu)化及驗(yàn)證試驗(yàn) 由軟件Design-Expert8.0.6 獲得最優(yōu)工藝條件：培養(yǎng)溫度32.9 ℃、培養(yǎng)時(shí)間5.5 d 以及培養(yǎng)基（乙液）起始pH 為6.1，最終酶活力達(dá)到16.95 U/mL。通過一定的實(shí)際調(diào)整，得出最佳條件為溫度33 ℃、時(shí)間5.5 d 及pH 6.0。通過淡紫紫孢菌M7a 固體發(fā)酵平行3 次試驗(yàn)來驗(yàn)證該最佳條件，結(jié)果所得殼聚糖酶活力分別為16.69，16.96，16.76 U/mL，平均值為16.80 U/mL，回歸模型預(yù)測值為16.90 U/mL，相對誤差為0.59%。實(shí)際測量值與模型預(yù)測值擬合較好，因此利用響應(yīng)面法優(yōu)化淡紫紫孢菌M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶活力具有可行性。與采用液體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶的Bacillus thuringiensis ZJOU-010（4.16 U/mL）[30]、Bacillus cereus D-11（4.84 U/mL）[31]以及Penicillium sp.IB-37-2（3.0 U/mL）[12]相比，淡紫紫孢菌M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶活力更高且具有優(yōu)勢。

2.4 淡紫紫孢菌M7a 產(chǎn)殼聚糖酶的SDSPAGE 及酶譜分析

菌株M7a 在最佳固體發(fā)酵條件下培養(yǎng)，其殼聚糖酶粗酶液的SDS-PAGE 及酶譜見圖5。在膠體殼聚糖的誘導(dǎo)下，酶譜中有1 條明顯的暗帶，表明該菌株所產(chǎn)的一種殼聚糖酶，對照marker 及SDS-PAGE 電泳圖，對應(yīng)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為40 ku。目前報(bào)道的殼聚糖酶分子質(zhì)量大多為20～75 ku[1]，其中真菌殼聚糖酶分子質(zhì)量一般大于40 ku[22]，Penicillium sp.IB-37-2 被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生分子質(zhì)量分別為89，41 ku 的兩種優(yōu)勢蛋白[13]。Paecilomyces lilacinus 殼聚糖酶分子質(zhì)量為23 ku[32]和95 ku[20]分別于2005 年和2013 年被發(fā)現(xiàn)，尚沒有關(guān)于淡紫紫孢菌40 ku 殼聚糖酶的報(bào)道。

注：Std：170 Marker；1 道為固體發(fā)酵粗酶液；2 道為酶譜。圖5 淡紫紫孢菌M7a 的粗酶液電泳圖及殼聚糖酶酶譜Fig.5 SDS-PAGE and chitosanase zymogram analysis of the crude proteins from P.lilacinum M7a

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從中國杭州土樣中分離純化出一株傳代穩(wěn)定且產(chǎn)殼聚糖酶活力較高的菌株M7a，鑒定為淡紫紫孢菌（P.lilacinum）。采用單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，獲得其最佳固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶條件：10 g/L 膠體殼聚糖+5 g/L 葡萄糖、10 g/L 蛋白胨、培養(yǎng)基初始pH 值為6.0、豆粕麩皮質(zhì)量比7∶5、發(fā)酵溫度33 ℃、發(fā)酵時(shí)間5.5 d。通過回歸模型方差分析得出，發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)酶影響極顯著（P＜0.01），發(fā)酵溫度和溫度時(shí)間交互作用對產(chǎn)酶的影響顯著（0.01＜P＜0.05）。綜上，淡紫紫孢菌（P.lilacinum）M7a 固體發(fā)酵產(chǎn)殼聚糖酶水平達(dá)到16.80 U/mL，是初始液體發(fā)酵的5.1 倍。本試驗(yàn)深入探究淡紫紫孢菌M7a 的產(chǎn)殼聚糖酶固體發(fā)酵條件，極大提高了其產(chǎn)酶能力，為其未來在食品工業(yè)等方面的廣泛應(yīng)用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。