任大勇 宮圣潔 朱劍威 王 迪 高良鋒 曲天銘 劉宏妍 于寒松*

（1 吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院 長春 130118 2 吉林農業(yè)大學中藥材學院 長春 130118）

腸道菌群對人類健康起到關鍵作用[1]，腸道還是最大的免疫器官[2]。據(jù)估計健康成人胃腸道大約有1013個微生物[3]，這些微生物在繁衍過程中達到種類和數(shù)量的平衡[4]。然而，這種平衡可以通過干擾腸道而被破壞[5]。一旦腸道菌群結構失調，則會引起各種代謝類疾病[4]。同時，腸道菌群還與免疫類疾病、胃腸道類疾病甚至精神類疾病相關聯(lián)[6]。由于腸道微生物種群對外部和內部環(huán)境變化高度敏感，所以導致腸道菌群組成迅速改變[7]，從而使病原菌過度生長[8]。金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性兼性厭氧球菌[9]，在不同環(huán)境生存的條件下，能夠增殖和定植組織[10]，促發(fā)腸道感染[11-12]。前期實驗中，小鼠感染金黃色葡萄球菌后體重降低，感染期間血清中細胞因子IFN-γ 顯著增加，細胞因子IL-4 顯著降低[13]，出現(xiàn)炎癥反應。這說明一旦被金黃色葡萄球菌感染，將嚴重影響機體健康。

益生菌是定植于人體腸道內，能夠產生健康功效的活的有益微生物的總稱[4]，主要包括乳酸菌、鏈球菌、芽孢桿菌等[14]，在腸道內生殖繁衍，調節(jié)腸道紊亂的菌群結構，提高機體免疫力[4]，幫助機體恢復健康。口服益生菌能夠治愈或緩解多種胃、腸道或與胃、腸道相關的疾病[4]。有研究表明，發(fā)酵乳酸菌在環(huán)境和食物中有氧的情況下含量豐富，它們構成了腸道共生菌群的主要部分，在正常情況下維持腸內免疫穩(wěn)態(tài)條件[15]。乳酸鏈球菌是多肽物質，不會造成腸道內正常菌群失調，它能刺激免疫應答，發(fā)揮免疫調節(jié)作用[16]。前期研究結果顯示，用乳酸鏈球菌L16 對感染金黃色葡萄球菌的小鼠進行干預，結果發(fā)現(xiàn)小鼠的肝脹指數(shù)接近正常組，在感染期和恢復期，血清中IFN-γ 和IL-4 的比值顯著降低，預防組和治療組小鼠腸內容物中sIgA 的分泌較正常組和模型組高，且預防組腸內容物中sIgA 的分泌高于治療組，與臨床癥狀一致[17-18]。本實驗利用高通量測序技術對小鼠糞便中所有細菌的16sRNA V3-V4 區(qū)進行DNA測序，分析乳酸鏈球菌L16 對金黃色葡萄球菌感染的小鼠腸道菌群的改善作用，探究小鼠感染金黃色葡萄球菌后，病癥的改善與腸道菌群結構是否有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5 周齡無菌雌性昆明小鼠，體重18～20 g，長春生物制品研究所有限責任公司，scXK（吉）2011-0003。

1.2 菌株

乳酸鏈球菌L16，提取于農家發(fā)酵食品，在MRS 培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，7 500 r/min 離心2 min，用0.9%無菌鹽水稀釋成109CFU/mL。金黃色葡萄球菌由吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院毒理學試驗室分離并保存，將其在LB 培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)24 h，稀釋成106CFU/mL。4 ℃儲存?zhèn)溆?。試驗結束后，將細菌高溫殺菌。

1.3 儀器與設備

BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；H-2050R 臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；QL-866旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SW-CJ 無菌操作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；KYC-100B 空氣恒溫搖床培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DHP-781 電熱恒溫培養(yǎng)箱，湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；FA1004B 電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司。

1.4 動物喂養(yǎng)

5 周齡無菌雌性昆明小鼠，提供充足的水和鼠糧，由小鼠自由攝食。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，通風，溫度（20±1）℃，濕度50%±10%，自然光源。小鼠經一周適應性飼養(yǎng)后，隨機分配到各籠中。

1.5 動物分組

實驗分為預防組（Protection）、治療組（Treatment）和對照組（正常組；模型組），（n=6）。小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，預防組先灌服乳酸鏈球菌1 周，再灌服金黃色葡萄球菌1 周。治療組用金黃色葡萄球菌感染小鼠1 周后，再用乳酸鏈球菌進行干預。對照組分為陰性對照組（Control）：提供充足水和糧食，自由攝食，以0.9%的無菌鹽水代替菌液灌服小鼠；陽性對照組（Model）：小鼠感染金葡菌1周，無乳酸菌干預。每天2 次灌胃，根據(jù)小鼠體重灌服乳酸鏈球菌（109CFU/mL）和金黃色葡萄球菌（106CFU/mL）以（10 mL/kg）計。通過腹腔注射進行麻醉（200 mg/kg·只），麻醉劑由20%的異戊巴比妥和無菌鹽水以1∶3（V/V）的比例配制而成。

1.6 病原菌感染小鼠

每天觀察小鼠，與前期試驗中小鼠感染后癥狀一致。感染初期伴有精神不佳，食欲不振；被毛聳立，排泄物粘連。繼續(xù)給藥，小鼠皮下出現(xiàn)膿包，部分表皮脫落，尾部較涼，相互擁擠蜷縮在一角，肛周紅腫。解剖后，病變小鼠內臟顏色偏黑，嚴重小鼠內脹氣味惡臭[13]?？瞻捉M小鼠未表現(xiàn)任何異常癥狀。

1.7 小鼠排泄物中菌群結構的分析方法

小鼠糞便中微生物DNA 通過Omega 試劑盒提?。◤V州飛揚生物工程有限公司）。按照試劑盒說明書提取小鼠糞便總DNA，所提取DNA 模板置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。樣品送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，采用Illumina 測序平臺。以16s rRNA V3-V4 區(qū)域帶barcode 的通用引物進行PCR 擴增。上下游引物分別為338F（5’-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3’）與806R（5’-GGAC TACHVGGGTWTCTAAT-3’）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用（vsesion 7.1 http：//drive5.com/uparse/）軟件平臺進行OTU 聚類分析，所有序列的OTU分配，通常在OTU 生物信息學統(tǒng)計分析的97%的相似水平。使用mothur 進行稀疏分析，使用R 語言工具制作圖形。

2 結果與分析

2.1 菌群結構和層次聚類分析

如圖1 所示，在門水平上，對小鼠腸道菌群結構進行分析。預防組中厚壁菌門（Firmicutes，49.03%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，43.15%）的相對豐度接近正常組（44.75%；42.08%）；模型組中厚壁菌門（Firmicutes，82.33%）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres，12.67%）的相對豐度較正常組顯著升高，擬桿菌門（Bacteroidetes，1.40%）較正常組顯著降低。通過圖2 進一步分析，預防組與正常組群落組成相似性最高，其次為治療組，而模型組與正常組有顯著差異。結果表明金黃色葡萄球菌感染的模型組小鼠腸道菌群結構異于正常組。

2.2 OTU 相對豐度和熱圖

等級豐度分布曲線用于分析物種分布，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大，曲線越平緩，物種分布越均勻[19]。如圖3 所示，根據(jù)各組曲線在橫軸范圍分布及曲線平緩程度可以看出，模型組小鼠腸道菌群物種豐度和均勻度較正常組低，預防組小鼠腸道菌群物種豐度較高，且分布均勻。如圖4 所示，熱圖根據(jù)顏色深淺反映物種豐度，通過顏色梯度及相似程度來反映各組樣本在門水平上群落組成的相似性和差異性。預防組中厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的豐度較高且接近正常組，模型組中各菌門豐度與正常組相比差異顯著。

圖1 小鼠腸道菌群門水平豐度Fig.1 Abundance of mice intestinal flora at phylum level

圖2 各組菌群結構的層次聚類分析Fig.2 Hierarchical clustering analysis for bacterial communities from different groups

圖3 等級豐度分布曲線Fig.3 OTU rank abundance distribution curve

圖4 各組門水平的熱圖Fig.4 Heatmap of groups at the phylum taxonomic level

2.3 小鼠腸道豐富性和多樣性

Shannon-Wiener 反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)，當曲線趨向平坦時，可以反映出樣本中大量微生物信息。如圖5 所示，預防組中小鼠腸道微生物多樣性指數(shù)最高，模型組最低。各組曲線趨向平坦，說明各組小鼠腸道菌群微生物信息量充足。通過稀釋性曲線分析樣本菌群物種的豐富度及其數(shù)據(jù)合理性，如圖6 所示，進一步分析，各組曲線趨向平坦，則測序數(shù)據(jù)量合理，模型組中小鼠腸道微生物群落多樣性和豐富度較低，預防組中小鼠腸道微生物群落多樣性和豐富度較高。相比于模型組，預防組的稀釋性曲線更接近正常組。

2.4 菌群結構維恩圖和組合分析圖

維恩圖用于統(tǒng)計多個樣本中所共有和獨有的OTU 數(shù)目，選用相似水平為97%的OTU 樣本進行分析，如圖7 所示，預防組和模型組與正常組重疊部分共有OTU 數(shù)目分別為229，163。相比于模型組，預防組與正常組的OTU 數(shù)目組成具有更高的相似性。進一步分析各組菌群結構之間的關系，如圖8 所示，預防組小鼠腸道菌群中厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的菌群組成與正常組最為相似。模型組小鼠腸道菌群中厚壁菌門（Firmicutes）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres）的菌群組成與正常組有顯著差異。

圖5 Shannon-Wiener 曲線Fig.5 Shannon-Wiener curve

圖6 稀釋性曲線Fig.6 Rarefaction curve

圖7 維恩圖Fig.7 Venn diagram

圖8 樣本聚類樹與柱狀圖組合分析圖Fig.8 Hclust-bar

3 討論

腸道菌群豐富多樣，參與多種生理活動[20]，腸道微生物群與很多疾病相關[21]，維持腸道內環(huán)境穩(wěn)定對人類健康有重要作用，一旦平衡被破壞，容易引發(fā)疾病[5，22]。有研究表明，在金黃色葡萄球菌感染的腸道中，觀察到內部盲腸壁的標記厚度，肌層水腫，以及嚴重的出血情況[23]。由金黃色葡萄球菌感染導致的腸炎，是嚴重的術后并發(fā)癥之一，因為這種感染通常伴隨著快速惡化，一旦在感染初期延遲治療，可能危及生命[23]。因此預防和治療金黃色葡萄球菌感染，使腸道保持健康至關重要。

大多數(shù)腸細菌屬于厚壁菌門（Firmicutes）或擬桿菌門（Bacteroidetes），其中少部分細菌存在于變形菌門（Proteobacteria）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres）[24]。本實驗中，感染金黃色葡萄球菌的小鼠腸道中厚壁菌門（Firmicutes）和脫鐵桿菌門（Deferribacteres）較正常組顯著增多，菌群結構異常，平衡被破壞，在前期實驗中，感染金黃色葡萄球菌的小鼠出現(xiàn)明顯病癥[13]，體重下降，血清中炎癥因子增加，免疫力降低，說明腸道菌群結構失衡能夠導致相應疾病的發(fā)生。

益生菌能夠限制病原體的定植和增殖，在腸道中起到有益作用[24]，促進腸道菌群平衡，可使紊亂的腸道菌群恢復到正常結構[20]，是一種能夠平衡宿主腸道菌群，產生活性物質，同時對宿主產生有益作用的微生物，是人類及動物腸道內尤為重要的生理菌[4，14]。有研究表明，血清生化指標的變化與腸道菌群的變化有關[25]，健康人群和患者之間的菌群結構的比例不同，慢性腎臟疾病患者的腸道微生物群落較少，乳酸菌通過改變菌群成分，影響肝臟和腎臟的功能[25]。本研究采用乳酸鏈球菌L16 對金黃色葡萄球菌進行干預，通過結果分析可知，相比于模型組，預防組和治療組腸道菌群豐富多樣，尤其是預防組中的優(yōu)勢菌群，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）的含量更接近正常組。前期試驗中，乳酸鏈球菌L16 對金黃色葡萄球菌感染的小鼠內脹起到預防保護作用，同時能夠恢復被感染小鼠體重的正常增長，增加腸道中sIgA 的分泌，使IFN-γ/IL-4 比值從感染期到恢復期顯著降低[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌L16 可以改善由金黃色葡萄球菌引起的腸道紊亂，使腸道菌群結構恢復平衡狀態(tài)，同時還可以預防和治療金黃色葡萄球菌感染小鼠出現(xiàn)的病癥。說明腸道菌群結構恢復正常，能使疾病得到緩解。

4 結論

乳酸鏈球菌L16 調節(jié)金黃色葡萄球菌感染的小鼠腸道菌群結構，能夠改善金黃色葡萄球菌感染小鼠出現(xiàn)的病癥，通過以上分析可以看出，腸道菌群結構與癥狀的改善密切相關，腸道健康有助于病癥恢復。