李玉婷 范美琪 余祥英 詹士杰 朱 杰 李 琳

（東莞理工學(xué)院 食品營養(yǎng)健康工程與智能化加工研究中心 化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院 廣東東莞 523808）

槲皮素作為天然抗氧化劑在食品體系中具有廣泛應(yīng)用，它可抑制食品組分氧化變質(zhì)[1]，減少面包加工過程中潛在有害物羧甲基賴氨酸[2]和丙烯酰胺的生成[3]。槲皮素在發(fā)揮抗氧化作用的同時(shí)，自身會(huì)被氧化形成槲皮素醌[4]。醌類物質(zhì)作為強(qiáng)親電化合物易與共存體系親核物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，例如：蛋白質(zhì)鏈賴氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸殘基[5-6]。現(xiàn)有相關(guān)研究多集中于反應(yīng)產(chǎn)物鑒定及互作對食品功能性質(zhì)的影響等方面，鮮有關(guān)于槲皮素醌與親核物質(zhì)互作效率的探討。

測定醌類物質(zhì)與親核物質(zhì)的互作效率，是了解兩者互作機(jī)制的重要手段。4-甲基鄰苯二醌（4MBQ）因較為穩(wěn)定而常被選作醌類模擬物用于互作效率相關(guān)研究。Nikolantonaki 等[7]利用化學(xué)法氧化制備得到4MBQ，而后利用紫外-可見分光光度計(jì)測定了其與紅酒相關(guān)親核物質(zhì)的互作效率。本課題組利用電化學(xué)氧化制備4MBQ，之后利用停流光譜測定其與氨基、巰基化合物的互作效率[8]。然而，槲皮素醌不穩(wěn)定且具有4 種互變異構(gòu)體[5]，無法利用上述方法制備，也因此無法采用上述手段測定槲皮素醌與親核物質(zhì)互作效率。

循環(huán)伏安法是測定酚類物質(zhì)氧化-還原特性的常規(guī)手段，在正向掃描時(shí)多酚類物質(zhì)氧化形成相應(yīng)的醌類物質(zhì)產(chǎn)生氧化峰，在隨后的負(fù)向掃描過程中，醌類物質(zhì)還原為初始多酚形成還原峰[9]。親核物質(zhì)與多酚循環(huán)伏安過程中氧化得到的醌類物質(zhì)互作會(huì)消耗體系醌類物質(zhì)，進(jìn)而降低多酚還原峰峰值電流[10]。循環(huán)伏安法可使醌類物質(zhì)的生成與后續(xù)互作測定過程同時(shí)進(jìn)行，消除了醌類物質(zhì)不穩(wěn)定對互作測定的影響。在理論上可以采用循環(huán)伏安法來研究槲皮素氧化生成的醌與親核物質(zhì)的相互作用。

本文采用循環(huán)伏安法研究了食品模擬體系【醬油（pH 5.0）、牛奶（pH 7.0）、雞 蛋制品（pH 8.0）】 中槲皮素醌與5 種氨基化合物和兩種巰基化合物及牛血清白蛋白（BSA）的互作效率，所得結(jié)果對闡明槲皮素醌與親核物質(zhì)互作機(jī)制有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素（95%）、BSA（≥98%），美國Sigma 試劑公司；甘氨酸（≥99.0%）、L-精氨酸（98%）、L-甲硫氨酸（99%）、Nα-乙酰-L-賴氨酸（＞97%）、L-半胱氨酸（99%）、Nα-乙酰-L-半胱氨酸（99%），阿拉丁試劑（上海）有限公司；L-賴氨酸（98%），上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇（≥99.7%）、十二水合磷酸氫二鈉（99.0%）、十二水合磷酸二氫鈉（99.0%），天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI600E 電化學(xué)工作站、玻璃碳工作電極（D=3 mm）、銀/氯化銀參比電極（KCl，c=3 mol/L）、鉑絲對電極（D=0.5 mm，L=35 mm），上海辰華儀器有限公司；DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，上海予華儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 槲皮素循環(huán)伏安測定條件的優(yōu)化

1.3.1.1 掃描電壓范圍的優(yōu)化 將槲皮素溶于無水乙醇，配制8.0 mmol/L 槲皮素儲(chǔ)備液，而后取一定量儲(chǔ)備液加入0.2 mol/L 磷酸鹽/乙醇（體積比4∶1，pH 7.0）溶液中使其終濃度為0.08 mmol/L，通氮?dú)饷撗?，而后進(jìn)行循環(huán)伏安測試。

1.3.1.2 槲皮素濃度的優(yōu)化 取一定量槲皮素儲(chǔ)備液加入0.2 mol/L 磷酸鹽/乙醇（體積比4∶1，pH 7.0）溶液使其終濃度分別為0.02，0.04，0.06，0.08 mmol/L，通氮?dú)饷撗?，而后進(jìn)行循環(huán)伏安測試。

1.3.2 親核物質(zhì)濃度對槲皮素醌與親核物質(zhì)反應(yīng)的影響 取一定量槲皮素儲(chǔ)備液加入0.2 mol/L磷酸鹽/乙醇（體積比4∶1，pH 7.0）溶液使其終濃度為0.08 mmol/L，而后加入一定量L-賴氨酸使其終濃度分 別 為0.8，4.0，8.0，12.0，16.0 mmol/L，或加入一定量L-半胱氨酸使其最終濃度分別為0.016，0.032，0.048，0.064，0.08 mmol/L 和0.8 mmol/L，通氮?dú)饷撗酰筮M(jìn)行循環(huán)伏安測試。

1.3.3 槲皮素醌與親核物質(zhì)相互作用的研究 取一定量槲皮素儲(chǔ)備液加入0.2 mol/L 磷酸鹽/乙醇（體積比4∶1；pH 5.0，7.0，8.0）溶液使其終濃度為0.08 mmol/L。而后加入一定量氨基化合物（L-賴氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、甘氨酸或Nα-乙酰-L-賴氨酸）使其最終濃度為16.0 mmol/L，或加入一定量巰基化合物（L-半胱氨酸或Nα-乙酰-L-半胱氨酸）或BSA 使其最終濃度為0.048 mmol/L，通氮?dú)饷撗?，而后進(jìn)行循環(huán)伏安測試。相同條件下，單獨(dú)槲皮素體系和單獨(dú)親核物質(zhì)體系的循環(huán)伏安圖作為對照。

1.3.4 循環(huán)伏安行為測試 采用電化學(xué)工作站、工作電極、參比電極和對電極如1.2 節(jié)所述。玻璃碳工作電極每次測試前用氧化鋁懸濁液打磨，而后用去離子水清洗。操作參數(shù)：掃描電壓最大范圍為-0.8～1.2 V，初始掃描方向正向，掃描段數(shù)2，掃描速率10，50，100 mV/s。所有試驗(yàn)均在（25±1）℃條件下進(jìn)行，所有試驗(yàn)重復(fù)3 次。氧化峰電壓記為EpA，還原峰電壓記為EpC，氧化峰電流記為IpA，還原峰電流記為IpC。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表明有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素循環(huán)伏安測定條件的優(yōu)化

由圖1 可知，不同條件下，槲皮素正向掃描中均出現(xiàn)氧化峰A1，在隨后的負(fù)向掃描過程中出現(xiàn)與之相對應(yīng)的還原峰C1，對應(yīng)槲皮素B 環(huán)鄰二酚羥基的氧化還原過程[11]，即正向掃描過程中槲皮素B 環(huán)鄰二酚羥基氧化形成槲皮素醌，而后在負(fù)向掃描過程中槲皮素醌還原生成槲皮素。循環(huán)伏安過程中形成的醌類物質(zhì)可以與體系中剩余的多酚互作[12]，從而降低其含量使得IpC1值小于IpA1值，減少程度因多酚種類而異?？s小循環(huán)伏安掃描電壓范圍，可以減少上述副反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)而增加體系IpC1值。由圖1a 可知，正向掃描邊界電壓的減少（1.2 V 減少至0.4 V）對槲皮素EpA1、EpC1、IpA1值無顯著影響，槲皮素IpC1值由（1.07±0.04）μA增加至（2.14±0.06）μA。當(dāng)掃描電壓低于0.0 V時(shí)，因電壓值小于槲皮素特征氧化還原最低電勢，故負(fù)向掃描邊界電壓的減少對槲皮素氧化峰和還原峰的電壓與電流均無顯著性影響。親核物質(zhì)與槲皮素醌的互作效率由互作過程對槲皮素IpC1值的減少率來表示，所以較高的IpC1值將有利于后續(xù)互作效率的測定。因此，掃描電壓范圍選擇-0.4～0.4 V。

槲皮素濃度同樣顯著影響槲皮素氧化還原峰峰值電流值（圖2），隨著濃度的增加，槲皮素IpA1值從（2.49±0.01）μA（0.02 mmol/L）增加至（5.63±0.05）μA（0.08 mmol/L），IpC1值從（1.22±0.05）μA（0.02 mmol/L）增加至（2.22±0.09）μA（0.08 mmol/L）。繼續(xù)增加體系中槲皮素濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)槲皮素溶液在循環(huán)伏安過程中會(huì)產(chǎn)生絮狀物，影響測定過程。因此，后續(xù)測定過程中槲皮素濃度選擇0.08 mmol/L。

圖1 不同掃描電壓范圍下0.08 mmol/L 槲皮素在玻碳電極表面循環(huán)伏安圖Fig.1 Cyclic voltammogram of 0.08 mmol/L quercetin at the surface of a glassy carbon electrode at different scan potential ranges

圖2 不同濃度下槲皮素在玻璃碳電極表面的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammogram of quercetin at the surface of a glassy carbon electrode at different concentrations

2.2 親核物質(zhì)濃度對槲皮素醌與親核物質(zhì)反應(yīng)的影響

如圖3a 所示，在pH 7.0、掃描速率為10 mV/s的條件下，槲皮素氧化峰、還原峰峰值電壓及電流值分別為：EpA1，（0.165±0.004）V；IpA1，（0.89±0.03）μA；EpC1，（0.137±0.004）V；IpC1，（-0.15±0.05）μA。當(dāng)L-賴氨酸濃度增加至8.0～16.0 mmol/L時(shí)，其可顯著降低槲皮素IpC1值，降低百分比為～36.05%（8.0 mmol/L）～55.13%（16.0 mmol/L），即表明槲皮素醌與L-賴氨酸發(fā)生了相互作用，且互作效率隨著濃度的增加而增加。

槲皮素醌與L-半胱氨酸的作用效率顯著高于其與L-賴氨酸的作用效率，這是由于L-半胱氨酸中巰基比L-賴氨酸中氨基親核性更強(qiáng)。pH 7.0、掃描速率10 mV/s 條件下，0.8 mmol/L L-半胱氨酸與槲皮素醌互作可消耗體系所有槲皮素醌（圖3b），而相同條件下L-賴氨酸與槲皮素醌無顯著性互作（P＞0.05）。由圖3b 可知，L-半胱氨酸在0.2～0.4 V 范圍內(nèi)存在明顯氧化峰，為其巰基氧化峰，將對互作測定結(jié)果產(chǎn)生影響。降低L-半胱氨酸濃度可減少該氧化峰對巰基化合物與槲皮素醌互作的影響。當(dāng)L-半胱氨酸濃度降低至0.048 mmol/L 時(shí)，體系不再出現(xiàn)干擾峰（圖3c）。L-半胱氨酸與槲皮素醌的互作效率同樣隨著L-半胱氨酸濃度的增加而增加，0.032 mmol/L L-半胱氨酸對槲皮素IpC1值的減少率為（～30.84%），0.048 mmol/L L-半胱氨酸對槲皮素IpC1值的減少率為（～63.17%）。

圖3 0.08 mmol/L 槲皮素與0.8～16.0 mmol/L L-賴氨酸（a）、0.8 mmol/L L-賴氨酸和L-半胱氨酸（b）、0.016～0.080 mmol/L L-半胱氨酸（c）相互作用的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of 0.08 mmol/L quercetin in the presence of 0.8-16.0 mmol/L of L-Lys（a），0.8 mmol/L of L-Lys or L-Cys（b），0.016-0.080 mmol/L of L-Cys（c）at the surface of glass carbon electrode

2.3 槲皮素醌與不同親核物質(zhì)的相互作用

槲皮素醌與親核物質(zhì)互作效率受體系pH 值及掃描速率影響（表1，圖4）。隨著體系pH 值的升高，巰基、氨基等親核基團(tuán)去質(zhì)子化程度增加，具有更強(qiáng)的親核性[13]，因而中性（pH 7.0）或堿性（pH 8.0）條件下槲皮素醌與親核物質(zhì)的互作效率優(yōu)于酸性（pH 5.0）條件（表1）。隨著循環(huán)伏安掃描速率的增加，槲皮素醌與親核物質(zhì)的互作時(shí)間降低，因此掃描速率為10 mV/s 時(shí)槲皮素醌與大部分親核物質(zhì)的互作效率高于掃描速率為50，100 mV/s。循環(huán)伏安過程中槲皮素醌和親核物質(zhì)的反應(yīng)與槲皮素醌副反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行存在競爭性，因而部分親核性較低的氨基酸（如甘氨酸、Nα-乙酰-L-賴氨酸）與槲皮素醌的互作不符合上述pH、掃描速率相關(guān)規(guī)律。

圖4 0.08 mmol/L 槲皮素與16.0 mmol/L L-賴氨酸（a）、L-精氨酸（b）、L-甲硫氨酸（c）、甘氨酸（d）、Nα-乙酰-L-賴氨酸（e），0.048 mmol/L L-半胱氨酸（f）、Nα-乙酰-L-半胱氨酸（g）、BSA（h）相互作用的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of 0.08 mmol/L quercetin in the absence and presence of 16.0 mmol/L of L-Lys（a），L-Arg（b），L-Met（c），Gly（d），Nα-acetyl-L-Lys（e）or 0.048 mmol/L of L-Cys（f），Nα-acetyl-L-Cys（g），BSA（h）

2.3.1 槲皮素醌與氨基化合物的相互作用 圖4a～e 為pH 7.0、掃描速率10 mV/s 下，0.08 mmol/L槲皮素與16.0 mmol/L 氨基化合物相互作用的循環(huán)伏安圖。如圖所示，5 種氨基化合物本身沒有電化學(xué)活性，當(dāng)將其加入槲皮素溶液時(shí)，可以顯著減少槲皮素IpC1值，減少順序依次為：L-賴氨酸（～55.13%）＞L-精氨酸（～39.58%）＞L-甲硫氨酸（～17.80%）＞甘氨酸（～0.00%）≈Nα-乙酰-L-賴氨酸（～0.00%）。L-賴氨酸的α-氨基（pKa 9.16）和ε-氨基（pKa 10.67），L-精氨酸的α-氨基（pKa 9.00）和胍基基團(tuán)（pKa 12.10），L-甲硫氨酸的α-氨基（pKa 9.08），甘氨酸的α-氨基（pKa 9.58）以及Nα-乙酰-L-賴氨酸氨基基團(tuán)（pKa 10.67，參照L-賴氨酸ε-氨基pKa 值）是與槲皮素醌作用的主要位點(diǎn)[14]。親核基團(tuán)pKa 值越小，相同pH 條件下越容易去質(zhì)子化，具有較高的親核性[15]，因而與槲皮素醌互作效率較高。具有多個(gè)親核基團(tuán)的氨基酸（如L-賴氨酸和L-精氨酸）因反應(yīng)位點(diǎn)增加其與槲皮素互作效率也較高。掃描速率10 mV/s，pH 5.0，8.0 時(shí)，氨基化合物與槲皮素醌互作效率同樣符合上述規(guī)律。氨基化合物與槲皮素醌的互作在特定條件下會(huì)影響槲皮素EpA1、EpC1和IpA1值，影響程度較IpC1值小，詳見表1 和表2。

2.3.2 槲皮素醌與巰基化合物及BSA 的相互作用 圖4f～h 為pH 7.0、掃描速率10 mV/s 下，0.08 mmol/L 的槲皮素與0.048 mmol/L 的巰基化合物及BSA 相互作用的循環(huán)伏安圖。如圖所示，巰基化合物與BSA 在所述條件下無電化學(xué)活性，當(dāng)將其加入槲皮素溶液時(shí)，槲皮素IpC1值顯著降低，降低順序?yàn)椋篖-半胱氨酸（～63.17%）＞Nα-乙酰-L-半胱氨酸（～54.28%）＞BSA（～37.55%）。L-半胱氨酸的巰基基團(tuán)（pKa 8.3）和Nα-乙酰-L-半胱氨酸的巰基基團(tuán)（pKa 9.5）[16]是其與槲皮素醌作用的主要位點(diǎn)，因L-半胱氨酸巰基基團(tuán)較Nα-乙酰-L-半胱氨酸具有更低的pKa 值，親核性更強(qiáng)，所以L-半胱氨酸的反應(yīng)活性更大。BSA 鏈上含有約82 個(gè)胍基/氨基基團(tuán)以及一個(gè)自由巰基，然而其反應(yīng)活性卻低于Nα-乙酰-L-半胱氨酸，這可能是由于BSA空間位阻效應(yīng)造成，且該結(jié)果與前期4MBQ 與L-半胱氨酸、Nα-乙酰-L-半胱氨酸和BSA 互作效率強(qiáng)弱結(jié)果相同[8]。掃描速率10 mV/s、pH 5.0 條件下，因酸性條件下去質(zhì)子化程度較低，整體反應(yīng)較弱，所以Nα-乙酰-L-半胱氨酸與槲皮素醌的互作效率和BSA 與槲皮素醌的互作效率無顯著性差異。掃描速率10 mV/s、pH 8.0 條件下，因堿性條件下去質(zhì)子化程度較高，整體反應(yīng)較強(qiáng)，L-半胱氨酸和Nα-乙酰-L-半胱氨酸均能完全消耗體系所產(chǎn)生的槲皮素醌（表1）。巰基化合物/BSA 與槲皮素醌的互作在特定條件下會(huì)影響槲皮素EpA1、EpC1和IpA1值，影響程度較IpC1值小，詳見表1 和表2。

3 結(jié)論

槲皮素醌可以與氨基、巰基等親核基團(tuán)發(fā)生Michael 加成反應(yīng)，反應(yīng)速率與親核基團(tuán)親核性相關(guān)。槲皮素醌與L-半胱氨酸的互作效率高于L-賴氨酸。pH 7.0、掃描速率10 mV/s 的條件下，5 種氨基化合物（16.0 mmol/L）與槲皮素醌互作效率大小為：L-賴氨酸＞L-精氨酸＞L-甲硫氨酸＞甘氨酸≈Nα-乙酰-L-賴氨酸；2 種巰基化合物及BSA（0.048 mmol/L）與槲皮素醌互作效率大小為：L-半胱氨酸＞Nα-乙酰-L-半胱氨酸＞BSA。具有多個(gè)親核基團(tuán)或親核基團(tuán)pKa 值較小的親核物質(zhì)具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性。研究表明，可以采用循環(huán)伏安法研究槲皮素氧化生成的醌與親核物質(zhì)的相互作用。槲皮素氧化形成的醌類物質(zhì)將與食品體系中氨基酸類親核物質(zhì)作用，消耗體系必需氨基酸，影響食品的質(zhì)量和安全性。