劉 洪 周亨樂(lè) 陳 磊，2 邢亞閣 劉曉翠 畢秀芳*

（1 西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 四川省食品生物技術(shù)省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 成都610039 2 宜賓西華大學(xué)研究院 四川宜賓 644000）

超聲波是一種極具發(fā)展前途的非熱殺菌技術(shù)，其中頻率在20～100 kHz，功率密度為10～1 000 W/cm2的高場(chǎng)強(qiáng)超聲波，在食品加工中最為常用[1]。近年來(lái)，超聲波作為非熱加工技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用得到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注[1]。目前，超聲技術(shù)被應(yīng)用于多種果蔬汁加工中。超聲波處理果蔬汁不僅能達(dá)到較好的殺菌效果，而且還能有效鈍化酶的活性[2]。超聲波對(duì)酶的鈍化作用主要是因其引起的空化效應(yīng)，形成空化氣泡，并在氣泡破裂時(shí)產(chǎn)生極高的溫度和壓力，釋放出大量的能量，而導(dǎo)致酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變[3]。

芒果是著名的熱帶水果，其果肉細(xì)膩、風(fēng)味獨(dú)特、品種繁多、種植地域廣，又被稱(chēng)為“熱帶水果之王”[4]。成熟的芒果果實(shí)中糖分和蛋白質(zhì)含量分別約為12%和0.6%，還含有豐富的果膠，pH 值為3.40～4.80[5]。目前，芒果除鮮食外，大部分被加工成芒果汁、芒果原漿和芒果罐頭等。芒果中多酚物質(zhì)含量豐富，在加工過(guò)程中極易受到機(jī)械損傷，導(dǎo)致其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，使類(lèi)囊體中釋放的多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）與液泡中釋放的酚類(lèi)物質(zhì)接觸，從而發(fā)生褐變反應(yīng)，影響其外觀風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[6]。除PPO 外，引起芒果褐變的酶主要還有過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）[7]。前人研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理對(duì)PPO 和POD 有顯著鈍化效果[8-9]。

超聲波對(duì)食品內(nèi)源酶的鈍化效果主要受超聲波作用參數(shù)、環(huán)境條件和介質(zhì)特性等影響。前人的研究主要集中于超聲波鈍酶處理參數(shù)（功率、時(shí)間、溫度、間歇比等）的優(yōu)化[10]，而關(guān)于環(huán)境條件及介質(zhì)特性對(duì)鈍酶效果的影響研究較少。其中，介質(zhì)中碳水化合物、蛋白質(zhì)等組分的含量可能是影響超聲波鈍酶效果的重要因素。一般而言，由于食品中其它成分的存在對(duì)酶具有保護(hù)作用，所以導(dǎo)致單一緩沖溶液中的酶比在實(shí)際食品體系中更容易鈍化。Lopez 等[11]研究發(fā)現(xiàn)在介質(zhì)中添加抗壞血酸、糖等成分能提高脂肪氧合酶（LOX）的穩(wěn)定性，從而降低超聲波的鈍化效果，而加入氯化鉀對(duì)超聲波鈍酶效果影響不大。本文通過(guò)研究超聲波對(duì)不同糖含量、蛋白質(zhì)添加量，pH 值及介質(zhì)黏度的芒果粗酶液的鈍化效果，為芒果汁鈍酶加工提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料：攀枝花地區(qū)主栽的凱特芒果，產(chǎn)于攀枝花市鹽邊縣。選取無(wú)機(jī)械傷，無(wú)病蟲(chóng)害，成熟度適中、果重均勻的芒果。

白砂糖，上海信冉食品有限公司；檸檬酸，鄭州潤(rùn)杰化工產(chǎn)品有限公司；大豆蛋白胨，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；卡拉膠，騰州市香凌生物工程有限責(zé)任公司；黃原膠，山東優(yōu)雪化工科技有限公司；阿拉伯膠、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），浙江多味化工食品有限公司；商品蘋(píng)果果膠、柑桔皮果膠、鄰苯二酚、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；過(guò)氧化氫（30%），天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；愈創(chuàng)木酚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純級(jí)，成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-IID 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；WFJ7200 分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司；MC-00000411pH 計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；糖度計(jì)，廣州市愛(ài)宕科學(xué)儀器有限公司；MCR302 流變儀，奧地利安東帕公司；Heraeus multifuge X1R 臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；GL124-1SCN 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；MJBL25B26 多功能家用攪拌機(jī)，美的集團(tuán)；HH-6 水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 芒果汁的制備 將新鮮芒果切成小塊，加入3 倍質(zhì)量水，打漿，4 層紗布過(guò)濾2 次，制得芒果汁。芒果汁經(jīng)測(cè)定其糖度為5.5 Birx，pH 值為5.7，黏度為25.7 mPa·s。

1.3.2 粗酶液的制備 將新鮮芒果去皮去核后倒入食物攪拌機(jī)，以1∶3（g/mL）的比例加入0.2 mol/L 磷酸緩沖液（pH 6.50）打成勻漿，4 層紗布過(guò)濾2次，加入4%的PVPP 后靜置聚沉12 h。聚沉液在4 ℃，8 000 r/min 條件下離心25 min，上清液即為粗酶液。粗酶液經(jīng)測(cè)定其糖度為4.4 Brix，pH 值為5.2，黏度為15.2 mPa·s。

1.3.3 粗酶液介質(zhì)特性的調(diào)整 介質(zhì)糖含量調(diào)整，添加蔗糖至糖度分別為5，10，15，20 Brix；介質(zhì)蛋白質(zhì)含量調(diào)整，分別添加0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的大豆蛋白胨；介質(zhì)pH 調(diào)整，加入檸檬酸，至pH 分別為3，4，5；介質(zhì)黏度調(diào)整，通過(guò)分別向粗酶液加入卡拉膠、蘋(píng)果果膠、柑桔皮果膠、CMC-Na、黃原膠、阿拉伯膠等6 種增稠劑，至黏度為17.6，19.4，22.7，25.4，27.1 mPa·s。

1.3.3 酶活性的測(cè)定 粗酶液酶活測(cè)定：PPO 活性的測(cè)定參照Tan 等[2]的方法，并略加修改。向試管中加入3 mL 0.1 mol/L 的鄰苯二酚溶液，并于30°C 保溫3 min，然后加入0.4 mL 粗酶液，迅速搖勻后，倒入比色皿中，于420 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每10 s 記錄1 次吸光值，連續(xù)記錄60 s。以向底物中添加0.4 mL 磷酸緩沖液為吸光值空白調(diào)零。

POD 活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]的方法。向試管中加入3 mL 1.0%愈創(chuàng)木酚和0.2 mL 1.5%過(guò)氧化氫于30°C 保溫3 min，加入0.2 mL 粗酶液，迅速搖勻后，倒入比色皿中，于470 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，每20 s 記錄1 次吸光度值，連續(xù)記錄100 s。以向底物中添加0.2 mL 磷酸緩沖液為吸光值空白調(diào)零。

芒果汁酶活測(cè)定：芒果汁中加入4%的PVPP，并于4°C，8 000 r/min 條件下離心25 min，上清液即為酶液，按照上述步驟測(cè)定。

PPO 和POD 的一個(gè)酶活力單位（U）定義為每分鐘吸光值增加0.1。并利用公式（1）計(jì)算殘余酶活力：

式中，At——處理后樣品酶活力；A0——未處理樣品初始酶活力。

1.3.4 超聲波處理 取30 mL 粗酶液或芒果汁于50 mL 燒杯中進(jìn)行超聲處理，超聲波處理時(shí)水浴溫度為45°C，超聲波功率密度為799.31 W/cm2，脈沖間隔為2 s 開(kāi)2 s 關(guān)，探頭浸入液面深度為1.5 cm，超聲波處理時(shí)間為15 min。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)采用方差分析（ANOVA），使用軟件Origin8.5（美國(guó)Microcal 公司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪圖。α=0.05，所有試驗(yàn)重復(fù)2 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波對(duì)粗酶液和芒果汁鈍酶效果的比較

在45°C，799.31 W/cm2，15 min 條件下，超聲處理對(duì)粗酶液和芒果汁中PPO 和POD 的鈍化效果如圖1 所示。超聲波使粗酶液和芒果汁中PPO活性分別下降了40.31%，15.87%，POD 活性分別下降了64.50%，21.82%。結(jié)果表明，超聲波對(duì)芒果汁中PPO 和POD 的鈍化效果顯著低于對(duì)粗酶液的鈍化效果。這種差異可能是由于粗酶液和芒果汁的保護(hù)性組分含量和介質(zhì)黏度不同所致。相關(guān)研究表明，處理介質(zhì)特性的差異會(huì)影響超聲波空化效應(yīng)傳遞效果，從而影響超聲波鈍酶效果[13]。

圖1 超聲波處理對(duì)芒果汁和粗酶液中PPO和POD 的鈍化效果Fig.1 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in mango juice and crude enzyme solution

2.2 不同組分對(duì)超聲波鈍酶效果的影響

2.2.1 糖含量對(duì)超聲波鈍酶效果的影響 在45℃，799.31 W/cm2，15 min 條件下，超聲波處理對(duì)不同糖含量的粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果如圖2 所示。不同糖含量對(duì)未處理粗酶液酶活性無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。將粗酶液糖含量從4.4 Brix提高至5 Brix 和10 Brix，經(jīng)超聲波處理后，隨著糖含量的升高，PPO 和POD 的超聲波鈍化率顯著降低（P＜0.05）。與未調(diào)整組相比，糖含量為5 Brix和10 Brix 的粗酶液中PPO 超聲波鈍化率分別降低了20.67%和29.36%，POD 超聲波鈍化率分別降低了40.34%和46.22%。繼續(xù)提高粗酶液中的糖含量至15 Brix 和20 Brix，PPO 和POD 的超聲波鈍化率未進(jìn)一步降低（P＞0.05）。結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)，隨著糖含量的提升，體系對(duì)超聲波鈍化中PPO 和POD 的保護(hù)效果隨之提升。Lopez 等[11]發(fā)現(xiàn)通過(guò)向LOX 酶液中添加一定量的蔗糖或葡萄糖（2.9%～10.9%）可以降低壓熱超聲（MTS，20 kHz，71 ℃，10 min）對(duì)LOX 的鈍酶效果，兩種糖都能提高LOX 對(duì)MTS 的耐受性。Vercet 等[14]通過(guò)向橙汁體系和檸檬酸鹽緩沖液中添加糖分（3%葡萄糖、3%果糖、6%蔗糖），發(fā)現(xiàn)這些糖分可以使果膠甲酯酶（PME）在MTS（24 kHz，72～82 ℃，5 min）下的D 值增加3 倍，顯著增強(qiáng)了PME 的MTS 穩(wěn)定性。這可能是由于添加糖分增加了酶蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而不易被超聲波破壞[14]。

圖2 超聲波處理對(duì)不同糖含量粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果Fig.2 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in crude enzyme solution with different sugar content

2.2.2 蛋白添加量對(duì)超聲波鈍酶效果的影響 在45°C，799.31 W/cm2，15 min 條件下，超聲波處理對(duì)不同蛋白添加量的粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果如圖3 所示。不同蛋白添加量對(duì)未處理粗酶液酶活性無(wú)顯著影響（P＞0.05）。向粗酶液中添加0.5%和1.0%的蛋白，經(jīng)超聲波處理后，隨著蛋白添加量的增加，PPO 和POD 的超聲波鈍化率發(fā)生顯著性降低（P＜0.05）。與未調(diào)整組相比，0.5%和1.0%的蛋白添加量粗酶液中PPO 和POD 鈍化率分別降低了24.55%，42.36%和30.9%，47.19%。繼續(xù)提高粗酶液中的蛋白添加量至1.5%，2.0%和2.5%，PPO 和POD 的超聲波鈍化率未進(jìn)一步降低（P＞0.05）。結(jié)果表明一定量范圍內(nèi)，蛋白添加可以抑制超聲波的鈍酶效果，且該抑制效果與蛋白添加量呈正相關(guān)。Tarun 等[15]發(fā)現(xiàn)添加大豆蛋白（1%，2%）使超聲波（1.0 W/cm2）對(duì)脲酶的鈍化率降低18%。蛋白質(zhì)可以降低超聲波對(duì)葡萄球菌[16]、大腸桿菌[17]的殺滅效果，可能是由于蛋白質(zhì)可以影響超聲波的傳遞，從而減少其空化作用，影響超聲波的殺菌效果[17]。本試驗(yàn)中蛋白質(zhì)抑制超聲波鈍酶效果也可能是因?yàn)槌暡栈饔檬艿较拗?，減少了能量的釋放，從而使得超聲鈍酶效果降低。

圖3 超聲波處理對(duì)不同蛋白添加量的粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果Fig.3 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in crude enzyme solution with different protein addition

2.2.3 pH 對(duì)超聲波鈍酶效果的影響 在45°C，799.31 W/cm2，15 min 條件下，超聲波處理對(duì)不同pH 的粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果如圖4 所示。在4.0～5.2 范圍內(nèi)，pH 對(duì)未處理粗酶液酶活性無(wú)顯著影響（P＞0.05），經(jīng)超聲波處理后，pH 4.0 和pH 5.0 的粗酶液中PPO 和POD 鈍化率與未調(diào)整組相比分別降低了22.73%，27.19%和41.32%，34.58%。繼續(xù)降低粗酶液pH 值至3.0，未處理的PPO 和POD 活性顯著降低（P＜0.05），比未調(diào)整組粗酶液的活性分別降低了21.57%和13.69%；經(jīng)超聲波處理后，與pH 值為4.0 的粗酶液相比，PPO 和POD 的超聲波鈍化率未發(fā)生顯著變化。結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)，降低pH 值可以抑制超聲波的鈍酶效果，pH 3.0 的酸性環(huán)境可直接抑制PPO 和POD 的活性。相反的結(jié)果被前人所報(bào)道，Thakur 等[18]研究了超聲波（200 W，10 min）對(duì)不同pH 值的大豆粉懸浮液中LOX 活性的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH＞5 時(shí)，超聲波對(duì)LOX 的活性影響較小，而pH 值在4.0～5.0 時(shí)，相同的超聲波條件可使LOX活性降低70%～85%。Lopez 等[11]也發(fā)現(xiàn)隨著pH 值的升高，LOX 的MTS（2.64 MHz，67.5～76.3 ℃，10 min）穩(wěn)定性提高。不同結(jié)果可能是由于酶的種類(lèi)、來(lái)源以及最適反應(yīng)pH 值不同所致。PPO 和POD分別是含銅和鐵的酶蛋白，其活性與pH 值密切相關(guān)，當(dāng)其處于高酸性環(huán)境中，蛋白質(zhì)可能發(fā)生變性從而導(dǎo)致酶活性降低，這可能是本研究中pH 3.0的未處理粗酶液中PPO 和POD 活性降低的原因。超聲波處理時(shí)，當(dāng)PPO 和POD 接近其最適反應(yīng)pH 值（6.5）時(shí)，其活性部位的酸性或堿性氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生解離，影響酶的活化和酶與底物的親和力，從而更易被超聲波鈍化[19]，這可能是本研究中pH 值越高，超聲波鈍酶效果越好的原因。

圖4 超聲波處理對(duì)不同pH 粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果Fig.4 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD activity in crude enzyme solution with different pH

2.3 同介質(zhì)黏度對(duì)超聲波鈍酶效果的影響

在45°C，799.31 W/cm2，處理15 min 條件下，超聲波對(duì)不同黏度粗酶液中PPO 和POD 的鈍化效果如圖5 所示。本研究范圍內(nèi)，黏度的改變對(duì)未處理粗酶液酶活性無(wú)顯著影響（數(shù)據(jù)未顯示，P＞0.05）。隨著黏度增加，PPO 和POD 超聲波鈍化率發(fā)生顯著性降低（P＜0.05），與未調(diào)整組（黏度15.2 mPa·s）相比，使用卡拉膠增稠后，黏度為27.1 mPa·s 粗酶液中PPO 和POD 鈍化率分別降低了27.14%和29.96%。6 種增稠劑在相同黏度下的超聲鈍酶效果差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，增加介質(zhì)黏度可以抑制超聲波的鈍酶效果，不同增稠劑增稠作用對(duì)超聲波鈍酶效果影響不大。吳虹等[20]發(fā)現(xiàn)使用超聲波（100 W）進(jìn)行脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)時(shí)，處于高黏度反應(yīng)液中的酶活力僅為81%，顯著低于低黏度組。Raviyan 等[21]發(fā)現(xiàn)超聲波（25 kHz，55 ℃）對(duì)緩沖液中PME 的鈍化效果要顯著高于對(duì)番茄汁體系中PME 的鈍化效果。Vercet等[14]發(fā)現(xiàn)橙汁體系的PME 超聲波抗性是其在檸檬酸鹽緩沖液的25 倍，這可能是由于果膠的存在。介質(zhì)會(huì)影響超聲波的傳遞和能量分布，高黏度的介質(zhì)使聲波傳遞困難，導(dǎo)致能量分布不均、消耗大。果汁勻漿的黏度一般高于緩沖液的黏度，高黏度的果汁超聲產(chǎn)生的空化數(shù)量少，可能降低超聲波的鈍酶效果[13]。

圖5 超聲波處理對(duì)不同黏度粗酶液的鈍酶效果Fig.5 Inactivation effect of ultrasound on PPO and POD in crude enzyme solution with different viscosity

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，增加糖分、蛋白質(zhì)和介質(zhì)黏度以及降低pH 可顯著降低超聲波對(duì)芒果PPO 和POD 的鈍化效果。證實(shí)了食品組分和介質(zhì)黏度等介質(zhì)特性會(huì)影響超聲波鈍酶效果，為芒果汁的超聲波生產(chǎn)提供一定理論支撐。