陳健樂(lè) 程 煥 陳士國(guó) 郭東啟 葉興乾*

（1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院 智能食品加工技術(shù)與裝備國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南方果蔬保鮮技術(shù)集成科研基地 浙江省健康食品制造與品質(zhì)控制國(guó)際合作基地 浙江大學(xué)馥莉食品研究院 杭州 310058 2 浙江大學(xué)寧波研究院 浙江寧波 315100）

果膠廣泛存在于陸生植物的細(xì)胞壁中，其作為天然健康的食品膠體被大量用于食品工業(yè)或其它行業(yè)的增稠凝膠劑，全球年產(chǎn)量達(dá)6 萬(wàn)t，然而仍供不應(yīng)求[1]。柑橘是最主要的果膠原料，傳統(tǒng)商品果膠一般用檸檬或甜橙皮提取，寬皮柑橘因白皮層薄、果膠得率相對(duì)較低、凝膠性較差而較少使用。近年來(lái)，針對(duì)柑橘罐頭（溫州蜜柑Citrus unshiu）加工脫囊衣工藝水中果膠含量高、水用量大、化學(xué)需氧量高的特點(diǎn)，作者建立了從中回收柑橘囊衣果膠的工藝與生產(chǎn)線，并獲得產(chǎn)品，促進(jìn)了對(duì)寬皮柑橘果膠資源的利用，同時(shí)推動(dòng)了柑橘罐頭加工清潔化與高值化發(fā)展[2]。

柑橘罐頭脫囊衣使用較低溫度的酸與堿處理，時(shí)間較短[3]。而傳統(tǒng)商品果膠多采用高溫酸提法，一般使用硫酸、鹽酸、硝酸、草酸等在60～100 ℃下提取1 h 以上[4-6]，二者所得果膠在性質(zhì)上差異較大，前者多為RG-I 果膠，后者則以HG 為主商品果膠。從原料的角度分析，柑橘罐頭加工使用最多的品種為晚熟溫州蜜柑，生產(chǎn)中常按果實(shí)大小分為大、中和小3 個(gè)級(jí)別，水果的果實(shí)大小不僅影響果實(shí)各部分比例，也可能對(duì)其植物化學(xué)素的含量有所影響[7-9]。

本研究以溫州蜜柑的囊衣為原料，柑橘按罐頭生產(chǎn)方法分為大橘、中橘和小橘，模擬罐頭脫囊衣工藝及商品果膠的提取工藝，驗(yàn)證工藝技術(shù)及果實(shí)大小對(duì)囊衣果膠性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘原料及處理：成熟溫州蜜柑（Citrus unshiu）果實(shí)，從象山華宇食品有限公司的生產(chǎn)線上取得，根據(jù)企業(yè)的生產(chǎn)方法，將果實(shí)大小分為大橘、中橘、小橘（具體尺寸與質(zhì)量分級(jí)見圖1）。手工分離果實(shí)的囊衣，對(duì)收集的囊衣用沸水燙漂5 s進(jìn)行滅酶并洗去游離糖，在烘箱中45 ℃干燥至水分含量低于5%，密封后保存于干燥器中，待用。

氫氧化鈉、鹽酸等試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；各種單糖標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；Gal-3 蛋白，美國(guó)R &D Systems 公司。

圖1 柑橘的尺寸與質(zhì)量分級(jí)Fig.1 Grading of mandarin by fruit size and weight

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相（e2695、1525）和2414 示差檢測(cè)器，美國(guó)Waters 科技有限公司；DAWN Heleos-II 光散射檢測(cè)器，美國(guó)Wyatt 技術(shù)公司；Nicolet Avatar 370 紅外分析儀，美國(guó)Nicolet 儀器技術(shù)公司（Thermo）；ZM200 超離心粉碎機(jī)，德國(guó)Retsch 公司；Biacore 3000SPR 儀，瑞典GE Healthcare 公司。

1.3 3 種提取法的工藝流程

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)高溫酸提（商品果膠工藝）和低溫酸提（柑橘罐頭生產(chǎn)酸處理）、低溫堿提（柑橘罐頭生產(chǎn)堿處理）3 種工藝，流程見圖2，具體參數(shù)參照罐頭工業(yè)手冊(cè)[3]。果膠樣品干燥后，以囊衣原料干重為基礎(chǔ)計(jì)算得率。

圖2 提取工藝流程Fig.2 Flow chart of extraction processes

1.4 單糖組成

樣品水解：稱取2 mg 果膠樣品于安瓿瓶中，溶解后在2 mol/L 三氟乙酸（TFA）下水解，水解條件為110 ℃，8 h。待反應(yīng)完全后冷卻至室溫，使用氮吹儀50 ℃下吹干。用0.1 mol/L NaOH 調(diào)樣品pH 至中性，用水定容1 mL，備用。

單糖組成使用PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）柱前衍生紫外檢測(cè)法測(cè)定，根據(jù)文獻(xiàn)[10]和[11]并略作改動(dòng)。將400 μL 單糖混標(biāo)（2 mmol/L）或樣品水解液和450 μL NaOH（0.3 mol/L）、50 μL乳糖（0.002 mol/L）、450 μL 0.5 mol/L PMP（甲醇作溶劑）混勻，70 ℃水浴反應(yīng)30 min，冷卻后加入450 μL 0.3 mol/L HCl，混勻，再使用氯仿多次萃取過(guò)量PMP，過(guò)0.22 μm 水膜，濾液進(jìn)行色譜分析。使用高效液相色譜（Waters e2695）、Agilent XDB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和紫外檢測(cè)器（Waters 2489）在25 ℃，250 nm 下分離檢測(cè)。流動(dòng)相：溶劑A 為15%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈+0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（KH2PO4-NaOH，pH 6.8），溶劑B為40%（體積分?jǐn)?shù)）乙腈+0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（KH2PO4-NaOH，pH 6.8）；梯度模式：溶劑B 的體積分?jǐn)?shù)變化為0%→15%→25%→25%，對(duì)應(yīng)的時(shí)間為0 min→10 min→30 min→35 min。根據(jù)混標(biāo)各單糖的峰面積與濃度，計(jì)算各單糖的響應(yīng)因子，將樣品各單糖折合響應(yīng)因子后計(jì)算相對(duì)比例（mol%）。

1.5 紅外光譜分析

測(cè)試前將果膠樣品使用105 ℃烘箱干燥6 h以上，充分去除水分，以減少雜峰干擾[12]。與KBr在紅外燈下混合后用紅外光譜儀測(cè)定，以KBr 為空白背景在400～4 000 cm-1掃描。掃描次數(shù)為32次，分辨率為4 cm-1。獲得紅外譜圖用于多糖的鑒定與結(jié)構(gòu)分析。

果膠的酯化度計(jì)算參考文獻(xiàn)[13]～[15]的方法。紅外圖譜中1 740 cm-1和1 630 cm-1處的峰分別對(duì)應(yīng)果膠半乳糖醛酸上COOCH3和COO-的C=O伸縮振動(dòng)。果膠的酯化度（DE 值）計(jì)算公式：

式中，Area1740——紅外吸光度圖譜中1 740 cm-1峰面積；Area1740+1630——1 740 cm-1與1 630 cm-1的峰面積之和。

1.6 絕對(duì)分子質(zhì)量與鏈形態(tài)

參考文獻(xiàn)[16]的方法并略有改動(dòng)。用0.2 mol/L NaCl 溶液溶解樣品，配制樣品質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，使用0.45 μm 濾膜過(guò)濾樣品，濾液用高效液相色譜與光散射及示差串聯(lián)系統(tǒng)（HPSECMALLS-RI）檢測(cè)分析。流動(dòng)相：0.2 mol/L NaCl（含抑菌劑NaN30.02%）；流速：0.75 mL/min；色譜柱：Shodex OH SB-G（保護(hù)柱）以及Shodex SB-806 HQ（13 μm，8.0 mm×300 mm，排阻限2×107）和SB-804 HQ（10 μm，8.0 mm×300 mm，排阻限1×106）聯(lián)用；數(shù)據(jù)處理使用軟件Astra 6.1。

1.7 果膠與半乳糖凝集素-3（Gal-3）的親和強(qiáng)度

參考文獻(xiàn)[17]的方法，使用表面等離子體共振儀測(cè)定果膠與半乳糖凝集素-3（Gal-3）的親和強(qiáng)度。CM-5 芯片先用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化，然后加載Gal-3 蛋白，果膠樣品溶解于HBS-EP 緩沖液（10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，3 mmol/L EDTA，0.005%表面活性劑P20），配制成梯度濃度依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量90 μL，25 ℃下測(cè)試SPR 曲線。最后采用軟件BIAevaluation 4.1.1 擬合SRP 曲線，并計(jì)算KD值。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20.0（美國(guó)IBM）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析（Duncan）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料果實(shí)組成比例與果膠提取得率

不同大小橘子的組成比例見表1。大橘的橘皮與囊衣占比均多于小橘，小橘皮薄、囊衣少。小橘囊衣雖薄，但酸提果膠得率反而高（因得率的計(jì)算是基于相同的原料干重，而非相同的橘子個(gè)數(shù)）（表2），提示小橘囊衣的變薄可能由非果膠物質(zhì)（如纖維素、半纖維素等）的減少引起。同時(shí)由于非果膠大分子的減少，減少了其與果膠的纏繞與結(jié)合[18]，因此在酸的作用下果膠更容易被提出。低溫堿提是對(duì)低溫酸提的渣進(jìn)行提取，因小橘酸提容易提出果膠，故小橘堿提得率有所下降，具有合理性。

表1 不同果實(shí)大小的柑橘各部分所占比例（以100 g 鮮果計(jì)）Table 1 The weight ratio of each fruit part in different size mandarin fruits（presented as each 100 g fresh fruit）

表2 大、中、小橘囊衣在3 種提取工藝下的果膠得率（基于囊衣干重，%）Table 2 Yields of the pectin extracted from large，middle and small fruits under three extraction methods（based on the dry basis of segment membrane，%）

2.2 提取工藝與果實(shí)大小對(duì)果膠理化性質(zhì)的影響

單糖組成分析表明，無(wú)論柑橘的果實(shí)大小，通過(guò)高溫提取具有較多的半乳糖醛酸，而低溫則相反（有較多的中性糖側(cè)鏈）；堿提取具有更高的中性糖含量（表3）。

由表3 可知，大、中、小橘在相同提取工藝下，單糖組成相似。高溫酸提的果膠GalA 高，之后為低溫酸提和低溫堿提，說(shuō)明高溫酸提得到標(biāo)準(zhǔn)的商品果膠。大橘在高溫酸提下Gal 含量偏低，在低溫酸提下大橘的Gal 與Ara 偏低。由于Ara 易水解，推測(cè)高溫酸提大橘Ara 的提出量同樣偏低，只是大、中、小橘在高溫提取中Ara 均有水解而未顯示出差異。Gal 和Ara 是RG-I 結(jié)構(gòu)的支鏈組成[19]，表明大橘酸提果膠中RG-I 支鏈較短。

表3 大、中、小橘囊衣在3 種提取工藝下果膠的單糖組成（mol%）Table 3 Monosaccharides composition of the samples extracted from large，middle and small fruits under three extraction methods（mol%）

圖3 可見，大、中、小橘囊衣果膠在同一種提取工藝下的圖譜信號(hào)峰相似，提示果實(shí)大小對(duì)果膠多糖的基團(tuán)特征沒(méi)有影響，而不同提取工藝下差別顯著，如1 750～1 600 cm-1的酯化度相關(guān)信號(hào)，以及1 300～1 200 cm-1的指紋圖譜區(qū)，酸提與堿提有較大差異。

表4 為根據(jù)紅外譜圖計(jì)算的酯化度，表明果實(shí)大小對(duì)酯化度沒(méi)有影響。而提取工藝不同則有很大差別，堿提的脫酯作用明顯。

圖3 大、中、小橘囊衣在3 種提取工藝下果膠的紅外譜圖Fig.3 FTIR spectra of the samples extracted from large，middle and small fruits under three extraction methods

表4 大、中、小橘囊衣在3 種提取工藝下果膠的酯化度（%）Table 4 Degree of esterification of the samples extracted from large，middle and small fruits under three extraction methods（%）

表5 顯示，低溫堿提分子質(zhì)量大于低溫酸提，更大于高溫酸提。大橘重均分子質(zhì)量小于中橘和小橘。分子質(zhì)量的微分重量分布圖也能直觀顯示大、中、小橘的差異（以高溫酸提為例，圖4a），結(jié)合糖組成的結(jié)果，分析原因可能是由大橘果膠中性糖側(cè)鏈少所致，這與大橘非果膠大分子多，從而與果膠纏結(jié)多的猜想相符，即可以解釋為大橘果膠主要由相對(duì)易于被提?。▊?cè)鏈較少，纏結(jié)少）的果膠組成，因此分子質(zhì)量較小。

大、中、小橘在每種提取工藝下的果膠分子鏈形態(tài)差異?。ㄒ愿邷厮崽釣槔瑘D4b），根據(jù)擬合斜率分析其均為分支結(jié)構(gòu)[20]，堿提果膠分支最嚴(yán)重。

表5 大、中、小橘囊衣在3 種提取工藝下的果膠分子質(zhì)量與旋轉(zhuǎn)半徑Table 5 Average values of molecular weight and radius of the extracted pectin

圖4 大、中、小橘囊衣在高溫酸提下的果膠分子質(zhì)量與鏈形態(tài)Fig.4 Molar mass distribution and conformation of the samples extracted from large，middle and small fruits under hot acid extraction

2.3 低溫酸提下果實(shí)大小對(duì)半乳糖凝聚素-3（Gal-3）親和力的影響

據(jù)報(bào)道，RG-I 果膠具有結(jié)合Gal-3 的活性，而結(jié)合Gal-3 與抗癌等多種生理活性相關(guān)[21]。上述結(jié)果表明，低溫酸提能較好地保留富含中性糖側(cè)鏈的RG-I 結(jié)構(gòu)。比較了低溫酸提的大、中、小橘果膠的Gal-3 親和力。圖5 顯示，大、中、小橘果膠的KD值在4.13～5.51 μmol/L 之間，表明果實(shí)大小對(duì)所提果膠的Gal-3 親和力影響小，這與其果膠結(jié)構(gòu)相近的結(jié)論相符。其Gal-3 的親和力均屬于中等結(jié)合強(qiáng)度，與富含RG-I 的其它果膠多糖活性相近[17，22]。

圖5 低溫酸提果膠與Gal-3 相互作用的SPR 信號(hào)圖（黑細(xì)線為擬合曲線）Fig.5 SPR sensorgrams of pectin-Gal-3 interaction（the black curves are the fitting curves）

3 結(jié)論

對(duì)于寬皮橘囊衣果膠，在提取率、單糖組成、酯化度、分子質(zhì)量和Gal-3 結(jié)合活性方面，果實(shí)大小對(duì)其影響不大，而提取工藝則有很大的影響。傳統(tǒng)的商品果膠工藝，所得果膠半乳糖醛酸較多，中性糖含量較少，分子質(zhì)量相對(duì)較小；低溫的酸提取則得到分子質(zhì)量更大的果膠，中性糖支鏈保留較多，而半乳糖醛酸數(shù)量降低；低溫堿提取分子質(zhì)量最大，幾乎無(wú)酯化度，存在大量的中性糖。

本研究結(jié)果同時(shí)表明柑橘中存在著大量的不同性質(zhì)的多糖，提取的果膠多糖結(jié)構(gòu)主要取決于提取工藝的差異。