段靖禹，周長志，曹 柳，吳志豪，侯 紅*，馬學(xué)文

1.中國環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012 2.山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所，山西 太原 030032 3.濟(jì)源市環(huán)境科學(xué)研究所，河南 濟(jì)源 454650

砷(As)是一種類金屬元素，廣泛存在于地殼表面[1].土壤中砷的來源是多方面的，有自然源與人為源，地質(zhì)巖石中的砷決定了砷的地域平均豐度，不同類型的巖石礦物決定了不同母質(zhì)發(fā)育土壤的含砷量，在自然本底值的基礎(chǔ)上，大量含砷礦物的開采以及含砷農(nóng)藥的使用，增加了土壤砷的含量，甚至在我國多個(gè)地域造成了嚴(yán)重的危害[2].砷污染土壤的治理已成為環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)問題之一[3].自1975年以來，已形成了多項(xiàng)砷污染土壤修復(fù)技術(shù)，整體分為土壤污染物總量消減技術(shù)與土壤污染物穩(wěn)定化技術(shù)，其中，土壤污染物總量消減技術(shù)主要包括客土換土技術(shù)[4]、超積累植物提取技術(shù)[5]、化學(xué)淋洗技術(shù)[6]，穩(wěn)定化技術(shù)主要包括無機(jī)鈍化技術(shù)[7]、有機(jī)鈍化技術(shù)[8]、生物鈍化技術(shù)[9].大部分砷污染土壤修復(fù)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于實(shí)際案例中，但是客土換土技術(shù)的高額費(fèi)用、超積累植物的適用地域問題、化學(xué)淋洗使用不當(dāng)?shù)亩挝廴尽⑩g化劑穩(wěn)定性的長期與否等問題，都在一定程度上影響著土壤砷污染修復(fù)效果，而微生物修復(fù)作為一種環(huán)境友好型的治理技術(shù)有著較好的發(fā)展前景.

土壤中的微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中最為主要的環(huán)節(jié)[10]，土壤生態(tài)系統(tǒng)的各種活動(dòng)都有微生物的參與，微生物被視為土壤條件轉(zhuǎn)化的驅(qū)動(dòng)因子[11]，微生物在土壤中的分布及其功能多樣性與環(huán)境之間存在互相影響的關(guān)系[12].土壤環(huán)境中的碳源分布決定了微生物的種類與分布，微生物的代謝活動(dòng)產(chǎn)物決定了土壤的肥力條件和營養(yǎng)結(jié)構(gòu)[13]，同時(shí)微生物在重金屬脅迫下的反應(yīng)比植物敏銳得多[14]，因此，土壤微生物群落功能多樣性也是土壤環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)優(yōu)劣的一個(gè)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn).目前微生物群落多樣性研究的方法主要有Biolog、16s rRNA基因測(cè)序等，后者通過基因測(cè)序，能夠得到土壤中微生物的具體種類及其豐度，但無法得到微生物的具體能量來源.在目前的微生物研究中，相比于傳統(tǒng)的菌種分離鑒研究方法，Biolog法能夠更快、更便捷、更有效地反映出微生物群落結(jié)構(gòu)功能的信息[15].Garland等[16]最先將Biolog ECO微平板運(yùn)用于微生物群落結(jié)構(gòu)特征的研究，這項(xiàng)工作上的創(chuàng)新引來了一系列的關(guān)注.多年來，Biolog法已成為研究微生物功能多樣性的重要工具.Biolog法在土壤微生物群落功能多樣性的研究中應(yīng)用最為廣泛，其中涉及各種不同類型天然土壤、不同土地利用類型土壤、退化土壤、受污染土壤以及濕地土壤等，所得微生物功能多樣性特征與土壤基本特征都能建立較好的聯(lián)系[17].

多數(shù)研究表明，Penicilliumsp.菌屬在砷污染土壤的修復(fù)中有著極大的潛力[18]，輔以一定的生物炭，加強(qiáng)生物刺激[19]，或許會(huì)有更好的修復(fù)效果.鑒于此，該文在青霉菌復(fù)合生物炭修復(fù)砷污染土壤的同時(shí)，采用Biolog法通過AWCD(Biolog微平板孔中溶液吸光值平均顏色變化率)、Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、均勻度指數(shù)探究不同處理下砷污染土壤中微生物群落功能多樣性，以此得出生物炭與青霉菌在改善砷污染土壤的同時(shí)，對(duì)土壤中微生物群落功能多樣性的影響；并通過Biolog法對(duì)31種碳源做詳細(xì)分析，得出青霉菌的優(yōu)勢(shì)碳源種類，在實(shí)際修復(fù)過程中通過控制碳源種類來控制青霉菌的數(shù)量分布，能夠根據(jù)微生物的優(yōu)勢(shì)碳源種類設(shè)計(jì)更好的處理方法，以期為砷污染土壤修復(fù)提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)概況及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試土樣為山西省古交市礦區(qū)土，土壤的基本理化性質(zhì)：w(TN)為0.35 g/kg；w(有機(jī)質(zhì))為1.256 g/kg；w(TP)為585.52 mg/kg；w(TK)為14.70 g/kg；w(堿解氮)為14.92 mg/kg；w(有效磷)為4.64 mg/kg；w(速效鉀)為89.1 mg/kg；EC為100.3 μS/cm；w(TAs)為10.67 mg/kg.通過外源砷的添加，進(jìn)行土壤老化，最終得到w(TAs)為20 mg/kg、有效砷含量為17.74 mg/kg的供試土壤，土壤老化完成后，取27個(gè)花盆，各花盆內(nèi)準(zhǔn)確稱量300 g老化土壤.

試驗(yàn)采用3×3完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)(見表1)，包括3個(gè)菌劑接菌量(質(zhì)量比)，分別為T1(0%)、T2(10%)、T3(20%)，每個(gè)接菌量下3個(gè)生物炭添加量(質(zhì)量比)，分別為B1(0%)、B2(2%)、B3(4%).共9個(gè)處理，每組處理3個(gè)重復(fù).

表1 完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Completely randomized block test design

1.2 供試菌種

試驗(yàn)用青霉菌購自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司，編號(hào)bio-65577.將培養(yǎng)好后帶有青霉菌的液體培養(yǎng)基按試驗(yàn)設(shè)計(jì)依次接種到花盆中.接菌時(shí)應(yīng)注意菌種與土壤充分混勻，后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育.

1.3 土壤中有效砷含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取 0.400 0 g土樣，放入50 mL離心管中，加入20 mL浸取劑(1 mol/L H3PO4與0.1 mol/L抗壞血酸的混合液)，搖勻并在回旋式振蕩器上以180 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩浸提一定時(shí)間，之后放入100 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)水浴3 h，然后將離心管放入離心機(jī)中，4 000 r/min下離心5 min，過濾得到試液，通過原子熒光法測(cè)定有效砷的含量.

1.4 土壤微生物功能多樣性分析

稱取培養(yǎng)第45天時(shí)各處理中10.0 g新鮮土樣，置于裝有90 mL已滅菌生理鹽水(0.85%的NaCl)的錐形瓶內(nèi)，200 r/min下振蕩30 min，加入少量玻璃珠，以使土壤中的菌充分釋放，靜置10 min后用生理鹽水(0.85%的NaCl)稀釋 1 000 倍，將稀釋好的土壤懸濁液150 μL接種到Biolog-Eco板(BIOLOG,Microstation,USA)微孔中，接種后的Biolog-Eco板在25 ℃下培養(yǎng)1周.每隔24 h用Biolog Reader儀(BIOLOG,Hayward,USA)測(cè)定波長在590和750 nm處的吸光值[20].

微平板孔中溶液吸光值平均顏色變化率(AWCD)用來描述土壤微生物的代謝活性，計(jì)算公式：

(1)

式中：Ri為培養(yǎng)基第i孔的吸光值；R0為對(duì)照孔的吸光值；n為培養(yǎng)基孔數(shù)，Biolog-Eco微平板的n值為31.

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)用于評(píng)估物種豐富度，計(jì)算公式：

(2)

式中，Pi為培養(yǎng)基第i孔的相對(duì)吸光值與整個(gè)微平板相對(duì)吸光值總和的比值.

均勻度指數(shù)(E)，計(jì)算公式：

E=H/lnS

(3)

式中，S為顏色變化的培養(yǎng)基孔數(shù).

Simpson優(yōu)勢(shì)度指數(shù)(D)用于評(píng)估最常見種的優(yōu)勢(shì)度，計(jì)算公式：

(4)

不同碳源的利用特征分析，用來評(píng)價(jià)微生物的優(yōu)勢(shì)碳源種類.利用每個(gè)碳源(見表2)微孔的平均顏色變化率(AWCD)的數(shù)值來評(píng)價(jià)微生物對(duì)各碳源的利用能力及特征.

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

每隔24 h測(cè)得的吸光值用Excel 2007軟件記錄并整理，碳源動(dòng)態(tài)利用特征采用各處理不同時(shí)段的AWCD平均值分析，土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)及土壤微生物特征碳源的利用分析均采用培養(yǎng)168 h的數(shù)據(jù)計(jì)算，運(yùn)用SPSS 20.0軟件做方差分析、主成分分析[21-22]，運(yùn)用Excel 2007、Origin 9與R語言軟件繪圖.

表2 31種碳源的分類、編碼及名稱Table 2 Classification,coding and name of 31 carbon sources

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下土壤中有效砷的含量

注：不同小寫字母表示各處理之間在0.05水平存在顯著性差異(n=3).下同.圖1 不同處理土壤中有效砷含量的變化Fig.1 Changes of available arsenic content in soil of different treatments

青霉菌復(fù)合生物炭在砷修復(fù)治理中有顯著的交互作用.由圖1可見：青霉菌與生物炭的添加會(huì)使土壤中有效砷含量發(fā)生變化，T1B1(CK)處理中的有效砷含量基本保持不變，其余處理有效砷含量均有不同幅度的下降.T1B1、T1B2、T1B3、T2B1處理之間差異較大(P<0.05)，有效砷含量下降幅度大；T2B3、T3B1、T3B2、T3B3處理之間差異很小，有效砷含量下降幅度較小.與未經(jīng)任何處理的T1B1相比，鈍化效果最好的處理為T3B3，有效砷含量由17.74 mg/kg降至12.69 mg/kg，鈍化率為27.6%.

2.2 砷污染土壤中微生物利用碳源的動(dòng)態(tài)特征

不同時(shí)間階段的AWCD值可以用來表示微生物平均活性的變化，能直觀地體現(xiàn)微生物群落的生長速度和能夠達(dá)到的最終反應(yīng)程度，細(xì)胞死亡階段無法觀測(cè)到樣品的AWCD值.通過SPSS 20.0軟件對(duì)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的AWCD平均值做雙因素方差分析，結(jié)果如圖2所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，不同處理組的AWCD值均呈上升的趨勢(shì).前24 h內(nèi)，各處理組的AWCD值均很低，處理之間無顯著性差異；24 h后，除T1B1處理之外，其余處理組的AWCD值均顯著升高.

由圖2可見：T1組的3個(gè)處理中，T1B1處理的AWCD值在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)期均顯著低于T1B2、T1B3處理，T1B3處理在各時(shí)間段的AWCD值均低于T1B2處理，但不存在顯著性差異(p>0.05)；添加10%青霉菌(T2)的3個(gè)處理中，T2B1與T2B2隨培養(yǎng)時(shí)間的變化，AWCD值均呈上升趨勢(shì)，且二者之間沒有顯著性差異，T2B3處理的AWCD值在培養(yǎng)72 h之前顯著低于T2B1、T2B2處理，但培養(yǎng)96 h之后，3個(gè)處理的AWCD值之間無顯著性差異；添加20%青霉菌(T3)的3個(gè)處理中，T3B2處理的AWCD值顯著高于T3B1、T3B3處理.B1組的3個(gè)處理中，T2B1與T3B1在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的AWCD值均顯著高于T1B1，T2B1、T3B1處理的AWCD值在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)沒有顯著性差異；B2組、B3組與B1組的情形相似.

圖2 不同處理下土壤微生物利用碳源的動(dòng)態(tài)特征Fig.2 Dynamic characteristics of soil microbial utilization carbon source under different treatments

2.3 砷污染土壤中微生物對(duì)不同碳源的利用特征

2.3.1生物炭對(duì)砷污染土壤中微生物碳源利用特征的影響

由圖3可見：在T1B1處理中，甘氨酰-L-谷氨酸(由植物根系分泌)的AWCD值最高，但也僅為0.037;其余碳源的AWCD值均不超過0.020，大部分為0.001.由此可以看出，在有效砷含量較高(17.74 mg/kg)的土壤中，大部分微生物被滅活，僅有少數(shù)與植物根系有密切關(guān)系的微生物存活.T1B2處理中加入了2%的生物炭，50%碳源的AWCD值有顯著的上升，D-纖維二糖的AWCD值達(dá)1.500，其余均在0.500以上.生物炭加入土壤后，對(duì)環(huán)境中的有效砷產(chǎn)生一定的吸附鈍化作用，有效砷含量(16.90 mg/kg)下降使得部分微生物重新開始了生命活動(dòng)，此時(shí)土壤中微生物能夠利用的碳源大多數(shù)為單糖類及其及衍生物、二糖底物、多糖底物，少數(shù)為脂類、氨基酸以及其代謝中間產(chǎn)物.T1B3處理中加入了4%的生物炭，相比于T1B2處理，只有N-乙?；?D-葡萄胺、a-D-乳糖兩種碳源的AWCD值上升，AWCD值整體呈下降的趨勢(shì).

2.3.2砷污染土壤中青霉菌對(duì)碳源的利用特征

由圖3可見，T2B1處理中加入了10%的青霉菌，與T1B1處理對(duì)比可見，青霉菌在砷污染土壤中的活性很高，幾乎對(duì)所有的碳源都有一定的吸收，但a-環(huán)狀糊精、肝糖這兩種碳源的AWCD值幾乎為零.青霉菌對(duì)D,L-a-甘油、2-羥苯甲酸、a-丁酮酸、L-蘇氨酸這4種碳源的利用率極低，AWCD值均<0.5.青霉菌對(duì)氨基酸類中大部分碳源以及脂類碳源的AWCD值均高于1.0，對(duì)糖類、酚酸類代謝能力稍弱一些，AWCD值在0.3～1.0之間.

T2B2處理中添加了2%的生物炭，青霉菌優(yōu)勢(shì)碳源的AWCD值均下降，但相較于T2B1處理，AWCD平均值上升；T2B3處理中，所有碳源的AWCD值均下降.

接菌量為T3的三組處理改變了菌種濃度，由10%提高為20%，結(jié)果顯示無論是整體AWCD值，還是各碳源的利用率均與10%菌種濃度結(jié)果相似，因此該研究不再做過多的分析.

2.4 土壤微生物對(duì)碳源利用多樣性的PCA分析

為進(jìn)一步了解不同處理下微生物群落功能的差異，選用培育168 h的微生物對(duì)31種碳源的AWCD值做PCA分析，對(duì)數(shù)據(jù)提取2個(gè)主成分，并將不同處理在2個(gè)主成分上的得分值以PC1、PC2為橫縱坐標(biāo)作圖，以表征土壤微生物的代謝特征.由圖4可見：僅有T1B1位于PC1的負(fù)方向上，表明T1B1處理中的土壤微生物對(duì)碳源的利用模式與其余處理均有極大的差異；T1B2、T1B3處理分別位于PC1軸的正方向與PC2軸的正方向，可見這兩個(gè)處理中微生物對(duì)碳源的利用模式較為相似；其余處理在圖中分布比較集中，幾乎全部位于PC1軸正方向與PC2軸負(fù)方向上，由此得出這幾種處理對(duì)碳源的利用模式?jīng)]有差異，只是對(duì)碳源的利用能力上有稍有不同.

圖5 土壤微生物多樣性指數(shù)Fig.5 Functional diversity indices of soil microbial communities

圖3 砷污染土壤中微生物對(duì)不同碳源的利用特征Fig.3 Microbial use of different carbon sources in arsenic-contaminated soil

圖4 不同處理下碳源利用主成分分析Fig.4 Principal component analysis of carbon source utilization under different treatments

2.5 不同處理下土壤中可培養(yǎng)微生物多樣性指數(shù)

由圖5可見：隨著青霉菌接菌量與生物炭施用量的變化，Shannon-Wiener指數(shù)(H)與均勻度指數(shù)(E)的變化趨勢(shì)高度一致.在相同的菌種梯度下，隨著生物炭含量的增加，Shannon-Wiener指數(shù)(H)與均勻度指數(shù)(E)均呈小幅先升后降的趨勢(shì).在相同生物炭梯度下，當(dāng)青霉菌含量由0增至10%時(shí)，Shannon-Wiener指數(shù)(H)與均勻度指數(shù)(E)呈跳躍式上升;當(dāng)青霉菌含量由10%加至20%時(shí)，二者出現(xiàn)略微的下降.在沒有青霉菌的處理中，Simpson指數(shù)隨生物炭含量的上升呈先降后升的趨勢(shì)，在加入青霉菌的處理中Simpson指數(shù)均為0.05.

各指數(shù)與土壤中有效砷含量之間的相關(guān)性分析如表3所示，土壤中有效砷含量與Shannon-Wiener指數(shù)(H)、均勻度指數(shù)(E)均呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.886、-0.876，與Simpson指數(shù)(D)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.901.

表3 各指數(shù)與土壤中效砷含量相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between the indexes and the available arsenic content in soil

注：*表示在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)，**表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān).

3 討論

Biolog法擁有相對(duì)簡便的操作流程，其可以通過AWCD值以及多種指數(shù)直觀地反映出土壤中微生物功能多樣性、物種多樣性，由AWCD值演算來的Shannon-Wiener指數(shù)(H)與均勻度指數(shù)(E)[23]能夠反映微生物群落的豐富度，二者值越大表明群落多樣性越高.Simpson指數(shù)(D)能夠反映土壤微生物群落常見種的優(yōu)勢(shì)度變化，數(shù)值越大表明得到同一物種的幾率越大，微生物多樣性越低.砷污染土壤中有效砷含量、生物炭濃度、青霉菌添加量等因素都會(huì)對(duì)土壤中微生物群落多樣性以及微生物的活性產(chǎn)生一定的影響.武愛蓮等[24-25]研究表明，生物炭的加入會(huì)導(dǎo)致AWCD值、土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)、碳源利用豐富度降低，與該研究結(jié)果不同.

目前許多生物炭修復(fù)重金屬土壤的研究[26]表明，生物炭的添加會(huì)使得砷污染土壤的pH升高，進(jìn)而引起砷的解析，激發(fā)砷的活性，增加砷的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn).但是生物炭在加入土壤中會(huì)作為碳庫長時(shí)間的儲(chǔ)存，豐富土壤中的碳源種類、改善土壤中營養(yǎng)結(jié)構(gòu)[27]、增加土壤的養(yǎng)分含量[28]；同時(shí)生物炭有較強(qiáng)的陽離子交換能力，其表面豐富的含氧官能團(tuán)能與土壤中的鐵、錳結(jié)合，形成鐵錳氧化物，對(duì)環(huán)境中的有效砷產(chǎn)生一定的吸附鈍化作用.有效砷含量下降的同時(shí)，與有效砷含量呈顯著負(fù)相關(guān)的微生物群落多樣性指數(shù)與碳源利用豐度均上升(筆者將此處上升的部分定義為U)，生物炭過量添加會(huì)對(duì)微生物的活性產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致土壤微生物群落多樣性指數(shù)及碳源利用豐度均下降(下降的部分定義為D).低濃度生物炭添加后，U遠(yuǎn)大于D；高濃度生物炭添加后，U遠(yuǎn)小于D.直觀地表現(xiàn)為砷污染土壤中微生物群落功能多樣性、碳源利用豐富度均隨著生物炭濃度的上升呈先升后降的趨勢(shì).

青霉菌加入土壤中，土壤微生物群落的AWCD值顯著上升，添加少量生物炭后，青霉菌對(duì)大部分碳源的利用率下降，而整體AWCD值上升，原因有兩個(gè)：①適量生物炭與青霉菌的共同作用使得土壤中有效砷含量下降[29]，其他微生物活化、土壤微生物群落多樣性上升以及碳源利用豐度上升，使得整體的AWCD值上升；②多種微生物同存，在土壤中養(yǎng)分含量一定的條件下，青霉菌的數(shù)量會(huì)相應(yīng)減少，因此青霉菌對(duì)碳源的利用能力會(huì)減弱，AWCD值下降.

青霉菌對(duì)脂類碳源及氨基酸類碳源的利用率很高，對(duì)糖類、酚酸類碳源的利用率稍弱一些，對(duì)胺類及少部分酸類碳源的利用能力最弱.青霉菌對(duì)D-半乳糖醛酸、L-天冬酰胺酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、r-羥基丁酸這5種碳源的利用率均較高，將這5種碳源定義為青霉菌的優(yōu)勢(shì)碳源，而L-天冬酰胺酸、L-絲氨酸、L-精氨酸都是植物根際分泌物，由此推斷青霉菌與植物復(fù)合修復(fù)砷污染土壤有一定的潛力.超積累植物既可富集土壤中的砷，也可分泌促進(jìn)青霉菌生長發(fā)育的優(yōu)勢(shì)碳源，在二者的共同作用下，土壤中有效砷含量可能會(huì)發(fā)生顯著的下降；青霉菌還可以添加到某些對(duì)砷有累積性的農(nóng)作物的根際土壤中，在植物根部吸收土壤中砷的時(shí)候，先一步將有效砷鈍化，從而減少作物對(duì)砷的累積量.

4 結(jié)論

a) 砷污染土壤中微生物群落功能多樣性、碳源利用豐富度均隨著生物炭濃度的升高呈先升后降的趨勢(shì)，適量生物炭對(duì)土壤微生物的生長有促進(jìn)作用，生物炭過量會(huì)抑制土壤微生物的活性.

b) 青霉菌添加到砷污染土壤后，會(huì)顯著提升砷污染土壤中微生物的群落功能多樣性，改善砷污染土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)，不同的接菌量對(duì)結(jié)果沒有顯著影響.

c) 青霉菌的優(yōu)勢(shì)碳源(AWCD值>1.2)大多為植物根系分泌物，為后續(xù)青霉菌與超級(jí)累植物復(fù)合修復(fù)砷污染土壤提供了一定參考.