楊金偉　趙燦　吳勇軍　劉秀　喻嶸

摘要：目的??采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討丹參飲治療糖尿病心肌病的化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)及可能作用機(jī)制。方法??應(yīng)用TCM?database@Taiwan、Chemistry?Database、HIT及Batman-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)獲取丹參飲的化學(xué)活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)信息，通過(guò)對(duì)比CTD及Gencards數(shù)據(jù)庫(kù)，歸納丹參飲化學(xué)成分中明確對(duì)糖尿病心肌病具有治療作用的靶基因，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。綜合藥物-疾病靶基因，使用String10.5構(gòu)建靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape3.6.1軟件的Network?Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，?duì)丹參飲關(guān)鍵化學(xué)成分及靶基因進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)基因功能進(jìn)行富集分析，通過(guò)KEGG通路分析獲得參與的相關(guān)作用通路。結(jié)果??篩選得到丹參飲中91種化學(xué)成分和924個(gè)靶點(diǎn)對(duì)糖尿病心肌病有明確治療作用，成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖顯示成分與疾病靶點(diǎn)可能通過(guò)ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A等關(guān)鍵基因，經(jīng)由神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、膽堿能突觸和癌癥中的蛋白聚糖等通路發(fā)揮治療作用。結(jié)論??丹參飲通過(guò)多種藥物化學(xué)成分及靶點(diǎn)效應(yīng)有效干預(yù)糖尿病心肌病，分析成分、靶點(diǎn)及通路的相互關(guān)系可為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);丹參飲;糖尿病心肌病;潛在靶點(diǎn)

中圖分類號(hào)：R259.872;R285.5????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????文章編號(hào)：1005-5304（2020）03-0078-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201812376

Discussion?on?Molecular?Mechanism?of?Danshen?Decoction?on?Diabetic?Cardiomyopathy?Based?on?Network?Pharmacology

YANG?Jinwei，?ZHAO?Can，?WU?Yongjun，?LIU?Xiu，?YU?Rong

Hunan?University?of?Chinese?Medicine，?Changsha?410208，?China

Abstract：?Objective?To?explore?the?chemical?components，?targets，?and?potential?mechanism?of?Danshen?Decoction?in?treating?of?diabetic?cardiomyopathy?based?on?network?pharmacology.?Methods?The?TCM?database@Taiwan，?Chemistry?Database，?HIT?and?Batman-TCM?database?were?used?to?obtain?information?about?chemical?active?components?and?targets?of?Danshen?Decoction.?By?comparing?the?CTD?and?Gencards?databases，?the?target?genes?that?had?a?therapeutic?effect?on?diabetic?cardiomyopathy?in?the?chemical?components?of?Danshen?Decoction?were?concluded.?A?component-target?network?map?was?constructed，?and?the?core?target?interaction?network?was?screened.?The?drug-disease?target?genes?were?synthesized，?and?the?String10.5?was?used?to?construct?a?target?interaction?network.?Network?Analyzer?tool?of?Cytoscape3.6.1?software?was?used?for?topological?analysis?to?evaluate?the?key?chemical?components?and?target?genes?of?Danshen?Decoction.?The?gene?function?enrichment?was?analyzed?with?DAVID6.8?database，?and?the?relevant?metabolic?pathways?were?analyzed?through?the?KEGG?pathway?analysis.?Results?Totally?91?chemical?components?and?924?targets?with?confirmed?therapeutic?effect?on?diabetic?cardiomyopathy?in?Danshen?Decoction?were?obtained?after?screening.?The?component-target?network?map?showed?that?components?and?disease?targets?may?pass?key?genes?such?as?ADH1C，?SCN10A，?RYR3，?MED1?and?SCN5A，?via?neuroactive?ligand-receptor?interactions，?calcium?signaling?pathways，?cAMP?signaling?pathways，?cholinergic?synapses?and?proteoglycans?in?cancer?to?play?an?intervention?in?the?treatment?of?diabetic?cardiomyopathy.?Conclusion?The?same?and?different?chemical?components?and?target?effects?exist?between?Danshen?Decoction?effectively?interfere?with?diabetic?cardiomyopathy，?and?analyzing?the?relationship?between?components，?targets?and?pathways?can?provide

a?basis?for?further?experiments?and?clinical?applications.

Keywords：?network?pharmacology;?Danshen?decoction;?diabetic?cardiomyopathy;?potential?targets

糖尿病心肌病（diabetic?cardiomyopathy，DCM）是糖尿病并發(fā)的特異性心肌病，表現(xiàn)為心肌肥厚、心肌纖維化，進(jìn)一步影響心肌收縮舒張功能，常并發(fā)心力衰竭及心律失常[1]。DCM發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在多因素共同介導(dǎo)，糖脂代謝失衡、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞的凋亡、心肌纖維化等參與DCM的進(jìn)程[2-3]。調(diào)節(jié)血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、改善微循環(huán)及保護(hù)心肌細(xì)胞是治療關(guān)鍵[4]。中藥存在復(fù)雜化學(xué)架構(gòu)，多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用，用于DCM辨證治療具有明顯優(yōu)勢(shì)?！稌r(shí)方歌括》有“丹參飲，治心痛、胃脘諸痛多效”。丹參飲由丹參、砂仁、檀香3味藥組成。大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，丹參飲具有保護(hù)心肌、維持血管內(nèi)皮完整抑制血小板聚集、抗炎、抗脂質(zhì)過(guò)氧化和清除自由基等多種藥理作用[5]。臨床研究表明，丹參飲可緩解DCM患者臨床癥狀，改善心肌細(xì)胞功能，提高綜合治療的有效性[6]。通過(guò)研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)作用靶點(diǎn)，可進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合藥物、靶點(diǎn)與疾病間相互作用的關(guān)聯(lián)性，從整體視角解析中藥與機(jī)體之間的作用關(guān)系，通過(guò)構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，可系統(tǒng)并可視化多成分與多靶點(diǎn)之間的相互作用[7]。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建丹參飲的主要化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)藥物與疾病對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，明確丹參飲治療DCM的潛在分子機(jī)制，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供依據(jù)。

1??資料與方法

1.1??化學(xué)成分收集

以丹參飲組成藥物丹參、砂仁、檀香作為關(guān)鍵詞，通過(guò)中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TCM?database@Taiwan（http：//?tcm.cmu.edu.tw/）[8]、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)Chemistry?Database（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp）及中草藥活性成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)HIT（http：//lifecenter.sgst.cn/hit/）[9]?收集丹參飲主要化學(xué)成分，建立數(shù)據(jù)集。

1.2??潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

應(yīng)用Batman-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-?tcm/）分析平臺(tái)[10]，在線提交丹參飲各單味藥化學(xué)成分信息，獲得與丹參飲可能作用靶點(diǎn)，以高可信度的蛋白作為靶點(diǎn)提取標(biāo)準(zhǔn)（Prediction?Score?cutoff>20）。使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能，通過(guò)輸入蛋白名稱并限定物種為人，將檢索得到的所有靶點(diǎn)校正為其官方名稱（official?symbol），經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和轉(zhuǎn)化操作，獲取與活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)信息[11]。

1.3??疾病靶點(diǎn)篩選

CTD數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//ctdbase.org/）提供關(guān)于化學(xué)-基因/蛋白質(zhì)相互作用、化學(xué)疾病和基因-疾病關(guān)系的信息[12]。Gencards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）是整合詳細(xì)的人類基因信息（包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組學(xué)、遺傳、臨床和功能信息）[13]。以“diabetic?cardiomyopathy”為關(guān)鍵詞，通過(guò)對(duì)比CTD、Gencards數(shù)據(jù)庫(kù)，歸納對(duì)DCM具有治療作用的靶點(diǎn)。

1.4??成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述化學(xué)成分和靶點(diǎn)數(shù)據(jù)信息，剔除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的化學(xué)成分及重復(fù)靶點(diǎn)后，導(dǎo)入Cytoscape3.6.1（https：//cytoscape.org/），構(gòu)建丹參飲化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并使用String10.5（https：//string-db.org/）構(gòu)建靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，對(duì)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯骄砍煞峙c潛在靶點(diǎn)在其系統(tǒng)層面的復(fù)雜關(guān)系[14]。

1.5??網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

運(yùn)用Cytoscape3.6.1軟件的Network?Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治觥Ｍㄟ^(guò)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)和邊的拓?fù)涮卣髦?，包括?jié)點(diǎn)連接度（betweenness?centrality）及介度（degree），對(duì)丹參飲關(guān)鍵化合物及靶點(diǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.6??基因富集分析

DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息[15]。將篩選得到的干預(yù)DCM作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為人，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行基因富集分析，通過(guò)KEGG通路分析獲得參與的相關(guān)通路，從分子生物學(xué)角度闡釋丹參飲治療DCM的作用機(jī)制。

2??結(jié)果與分析

2.1??有效成分及靶點(diǎn)

共篩選得到丹參飲治療DCM的化學(xué)成分91個(gè)、靶點(diǎn)924個(gè)，其中丹參成分和靶點(diǎn)分別為37、646個(gè)，砂仁成分和靶點(diǎn)分別為37、446個(gè)，檀香成分和靶點(diǎn)分別為20、513個(gè)。

2.2??成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

丹參飲成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖1，包括2150個(gè)節(jié)點(diǎn)（94個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、2056個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和5415條邊，每條邊表示化合物分子與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。丹參飲治療DCM的靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖2，包括557?個(gè)節(jié)點(diǎn)和6488條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為23.3。

注：紅色、紫色、黃色節(jié)點(diǎn)分別表示丹參飲中丹參、檀香、砂仁的化合物分子，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示藥物靶點(diǎn)

圖1??丹參飲治療DCM化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖2??丹參飲治療DCM靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3??靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

節(jié)點(diǎn)連接度表示網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點(diǎn)相連路線的條數(shù)，連線較多的節(jié)點(diǎn)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起樞紐作用，可能是關(guān)鍵的化合物或靶點(diǎn)。丹參飲治療DCM靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)中前15位靶點(diǎn)拓?fù)鋵傩砸?jiàn)表1。前5位靶點(diǎn)為ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A，分別與13、12、12、11、11個(gè)化合物發(fā)生相互作用。

表1??丹參飲治療DCM靶點(diǎn)拓?fù)鋵傩苑治觯ㄇ?5位）

2.4??靶點(diǎn)基因富集分析

對(duì)丹參飲治療DCM的有效成分靶點(diǎn)進(jìn)行基因富集分析，結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。丹參飲治療DCM參與的通路包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、膽堿能突觸和癌癥中的蛋白聚糖等，表明丹參飲有效成分可能通過(guò)作用這些靶點(diǎn)所在的信號(hào)通路發(fā)揮治療DCM作用。

表2??丹參飲治療DCM靶點(diǎn)參與的KEGG通路分析

圖3??丹參飲治療DCM相關(guān)靶點(diǎn)-通路

3??討論

DCM是一種獨(dú)立于糖尿病大血管并發(fā)癥的心肌結(jié)構(gòu)和功能改變的疾病，其早期癥狀隱匿，進(jìn)展性心肌細(xì)胞損害持續(xù)存在，后期易致糖尿病患者致命性心力衰竭[16]。心肌細(xì)胞凋亡及心肌間質(zhì)纖維化是DCM發(fā)生發(fā)展的重要病理改變[17]。DCM病理機(jī)制包括糖、血脂代謝異常對(duì)心肌細(xì)胞損害;細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失常影響心肌細(xì)胞舒張和收縮功能異常;心臟自主神經(jīng)病變引起心率以及血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生異常的病理改變;腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活觸發(fā)心肌肥厚，并導(dǎo)致心功能不全的發(fā)生;胰島素抵抗心肌細(xì)胞的糖代謝效率，導(dǎo)致心臟的功能障礙等[18-19]。目前臨床對(duì)DCM的藥物治療主要以延緩心肌損傷、改善心肌代謝為主，難以修復(fù)受損心肌。中藥對(duì)DCM的早期治療及患者癥狀改善有明顯優(yōu)勢(shì)。丹參飲具有活血祛瘀、理氣止痛功效，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療。研究表明，丹參飲可通過(guò)調(diào)節(jié)糖脂代謝，下調(diào)心肌血小板反應(yīng)蛋白-1、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)水平，減輕DCM大鼠心肌纖維化，顯著延緩高血糖大鼠DCM進(jìn)程[20]。

本研究通過(guò)對(duì)丹參飲進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，對(duì)復(fù)方中單味藥物進(jìn)行化學(xué)成分和相應(yīng)的靶點(diǎn)基因進(jìn)行篩選，綜合DCM相關(guān)靶基因信息，構(gòu)建了成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。其中丹參平均靶點(diǎn)數(shù)目為49個(gè)，每個(gè)靶點(diǎn)平均與3種化合物相互作用;檀香平均靶點(diǎn)數(shù)目為51個(gè)，每個(gè)靶點(diǎn)平均與3種化合物相互作用;砂仁平均靶點(diǎn)數(shù)目為69個(gè)，每個(gè)靶點(diǎn)平均與4種化合物相互作用。單個(gè)化學(xué)成分可有多個(gè)靶點(diǎn)作用效應(yīng)，同時(shí)，不同化學(xué)成分在同一靶點(diǎn)上也有交集，體現(xiàn)了中藥作用靶點(diǎn)廣泛、途徑多樣、功能豐富的特點(diǎn)。化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)包括ADH1C、SCN10A、RYR3、MED1、SCN5A。ADH1C是成熟肝細(xì)胞所特有的基因表達(dá)，可氧化腸道微生物產(chǎn)生內(nèi)源性乙醇，氧化類固醇和膽汁酸[21]。MED1作為PPARs等核受體和轉(zhuǎn)錄因子的激活子，可調(diào)控細(xì)胞代謝、增殖及分化，在肝臟中亦有明顯表達(dá)[22]。調(diào)節(jié)ADH1C表達(dá)可促進(jìn)肝臟糖異生和糖分解平衡，而MED1可提升胰島素敏感性，使葡萄糖耐受性增加。碳水化合物在體內(nèi)過(guò)程富余時(shí)，多余的能量則轉(zhuǎn)化為脂肪酸，以三酰甘油和膽固醇的形式儲(chǔ)存于脂肪組織。ADH1C將乳糜顆粒加工成游離的脂肪酸和三酰甘油，促進(jìn)轉(zhuǎn)運(yùn)，穩(wěn)定血脂狀態(tài)。MED1具有氧化脂肪酸的能力，減少極低密度脂蛋白含量。丹參飲通過(guò)調(diào)節(jié)二者在肝臟中特異性表達(dá)，調(diào)節(jié)糖脂代謝水平，截?cái)郉CM進(jìn)程。人基因組中存在11種編碼電壓門控鈉離子通道（voltage-gated?sodium?channel，VGSC）α亞單位的基因。SCN5A編碼的Nav1.5對(duì)心臟組織中的鈉離子通道有特異性作用，在心肌細(xì)胞及特化的心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)中均大量表達(dá)。SCN10A同樣在心臟電生理中有重要作用，與心肌傳導(dǎo)系統(tǒng)功能和多種心律失常密切相關(guān)[23]。丹參飲可干預(yù)SCN5A及SCN10A調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞功能狀態(tài)和電生理過(guò)程，達(dá)到治療DCM的效應(yīng)。丹參飲靶向細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)通道基因RyR3，可影響Ca2+信使作用，調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)遞質(zhì)釋放、細(xì)胞增殖與凋亡，在小腸黏膜上皮細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)效應(yīng)可以促進(jìn)葡萄糖吸收，維持心肌細(xì)胞的正常收縮舒張功能[24]。KEGG通路主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路、膽堿能突觸和癌癥中的蛋白聚糖等，由此推測(cè)丹參飲的有效成分可能通過(guò)作用于上述信號(hào)通路達(dá)到治療DCM的目的。其中神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的受體配體的集合，與神經(jīng)功能關(guān)系最為密切。電生理活動(dòng)和機(jī)械運(yùn)動(dòng)是心臟的基本活動(dòng)形式，心肌細(xì)胞代謝障礙、自主神經(jīng)功能紊亂、胰島素抵抗及細(xì)胞因子等都參與了DCM的發(fā)生發(fā)展。在DCM病理狀態(tài)下，心臟電生理活動(dòng)出現(xiàn)障礙及紊亂，進(jìn)而影響心臟的泵血功能，引起血流動(dòng)力學(xué)異常[25]。而心肌細(xì)胞外葡萄糖水平升高直接引起鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，通過(guò)鈣信號(hào)通路影響胞內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)，降低肌膜上的Na+-K+-ATP酶及肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性，造成鈣離子超載，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，心肌舒張期延長(zhǎng)。細(xì)胞胞膜受損，肌動(dòng)蛋白對(duì)外周鈣離子濃度敏感性下降，引起心室收縮功能障礙[26]。cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，經(jīng)由PKA磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中靶點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞代謝功能，與血壓、心率及心肌收縮等心血管功能密切相關(guān)[27]。抑制心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP蓄積，可減少心肌耗氧量，緩解過(guò)度激素及神經(jīng)遞質(zhì)釋放造成的心肌組織損傷，維持心肌正常不應(yīng)期狀態(tài)，防止心率失常的發(fā)生。上述研究均佐證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析藥物與疾病靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，明確了丹參飲有效成分及其治療DCM潛在作用靶點(diǎn)，并通過(guò)KEGG通路分析闡釋其信號(hào)通路及分子機(jī)制，可為丹參飲干預(yù)DCM的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，為后續(xù)機(jī)制研究提供思路和方法。

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（收稿日期：2018-12-29）

（修回日期：2019-01-30;編輯：陳靜）