齊孟孟，徐艷，葉黎離，王軍

支氣管肺發(fā)育不良（BPD）是世界早產(chǎn)兒最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，大多數(shù)BPD發(fā)生在胎齡小于32周的嬰兒，胎齡每小1 周，BPD 的發(fā)生率即增加2～3倍［1］，與正常早產(chǎn)兒相比，患有BPD的嬰兒更易患呼吸系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重影響了生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。然而目前對(duì)于BPD 仍缺乏有效的治療手段，更多的集中在預(yù)防BPD 的發(fā)生上。近年來，越來越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者熱衷于尋找BPD 的早期生物學(xué)標(biāo)志物，以早期預(yù)測(cè)BPD 的發(fā)生，其中LXA4 和MMP9 已被多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明在肺損傷的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，但在早產(chǎn)兒BPD 中的研究甚少，本研究通過檢測(cè)BPD組和非BPD組早產(chǎn)兒生后2周不同時(shí)間點(diǎn)血漿LXA4 和MMP9 表達(dá)水平，探討其在早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良中的變化及早期預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年1—7月入住徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院新生兒科的出生胎齡＜32周且住院時(shí)間超過28 d的早產(chǎn)兒；排除嚴(yán)重的先天性畸形、先天性遺傳代謝病，本研究征得病兒家長(zhǎng)知情同意簽字。符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 BPD 的診斷標(biāo)準(zhǔn) 超過21%的氧氣治療時(shí)間至少28 d 的新生兒［來源于新的國(guó)立衛(wèi)生研究院（美國(guó)）］［2］

1.3 標(biāo)本的采集 收集病兒一般信息，包括胎齡、出生體質(zhì)量、分娩方式、性別、上機(jī)時(shí)間；并于生后第1、7、14 天分別采集外周血1.5 mL，放入EDTA 抗凝管中，避免溶血，靜置30 min，然后2 000 r/min 離心15 min，分離血漿，放入-80 ℃冰箱中保存。

1.4 LXA4 及MMP9 的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)兩指標(biāo)，試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物有限公司。將各種試劑移至室溫（18～25 ℃）平衡20 min配制后備用，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測(cè)樣品10μL；每孔加入酶標(biāo)試劑100μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min，棄去孔內(nèi)液體甩干，洗板5次；每孔先加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B50μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min；每孔加終止液50μL 終止反應(yīng)，在反應(yīng)終止后15 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔光密度（OD值），然后計(jì)算樣本濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多時(shí)點(diǎn)觀測(cè)資料采用兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，時(shí)間兩兩比較采用差值t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)初期共納入61例早產(chǎn)兒作為研究對(duì)象，其中死亡5 例，放棄3 例，嚴(yán)重先天性畸形2 例，先天性遺傳代謝病1 例，其余的50 例有20例發(fā)展為BPD，未發(fā)展為BPD的30例為非BPD組。BPD 組和非BPD 組病兒胎齡、出生體質(zhì)量及孕母分娩方式差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；吸氧時(shí)間、最高氧濃度及機(jī)械通氣差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 血漿中LXA4表達(dá)水平變化 整體比較知：組間差異、時(shí)間差異及交互作用均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩精細(xì)比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：生后第1天BPD組和非BPD組血漿LXA4表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著時(shí)間推移，BPD 組LXA4含量逐漸下降，非BPD組LXA4水平逐漸上升，于第7天達(dá)到峰值，后又逐漸下降；不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），病兒生后第7、14天BPD 組的LXA4 的水平低于非BPD 組，時(shí)間越長(zhǎng)LXA4 水平越低，不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 早產(chǎn)兒50例支氣管肺發(fā)育不良組與非支氣管肺發(fā)育不良組基本情況比較

表2 早產(chǎn)兒50例支氣管肺發(fā)育不良組與非支氣管肺發(fā)育不良組不同時(shí)間血漿LXA4水平比較/（pg/mL）

表2 早產(chǎn)兒50例支氣管肺發(fā)育不良組與非支氣管肺發(fā)育不良組不同時(shí)間血漿LXA4水平比較/（pg/mL）

注：整體分析為兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，資料球型性校正采用HF系數(shù)法；時(shí)間精細(xì)比較為差值t檢驗(yàn)，顯著性標(biāo)記a為和組內(nèi)第1時(shí)間點(diǎn)比較P＜0.05；組間精細(xì)比較為L(zhǎng)SD-t檢驗(yàn)，顯著性標(biāo)記b為兩組同時(shí)點(diǎn)相比P＜0.05。LXA4為脂氧素A4，BPD為支氣管肺發(fā)育不良

組別BPD組非BPD組整體分析組間F，P值時(shí)間F，P值交互F，P值例數(shù)20 30第1天330.4±21.6 321.1±35.9第7天281.8±7.0a 348.6±4.4ab第14天188.4±5.7a 270.3±5.4ab（HF系數(shù)：0.5225）247.875，0.000 455.125，0.000 97.468，0.000

2.3 血漿中MMP9 表達(dá)水平變化 亦經(jīng)整體比較：組間差異、時(shí)間差異及交互作用均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩兩精細(xì)比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)分析：生后第1 天BPD 組和非BPD 組血漿MMP9 表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著時(shí)間推移，BPD組血漿MMP9含量逐漸上升，且生后第7、14天BPD 組血漿中MMP9 表達(dá)水平均高于非BPD 組，時(shí)間越長(zhǎng)MMP9 水平越高，不同時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 早產(chǎn)兒50例支氣管肺發(fā)育不良組與非支氣管肺發(fā)育不良組不同時(shí)間血漿MMP9水平比較/（ng/mL，）

表3 早產(chǎn)兒50例支氣管肺發(fā)育不良組與非支氣管肺發(fā)育不良組不同時(shí)間血漿MMP9水平比較/（ng/mL，）

注：同表2注。MMP9為基質(zhì)金屬蛋白酶9，BPD為支氣管肺發(fā)育不良

組別BPD組非BPD組整體分析組間F，P值時(shí)間F，P值交互F，P值例數(shù)20 30第1天23.9±3.9 25.3±2.6第7天32.6±3.9a 28.8±2.9ab第14天39.0±2.1a 32.2±3.4ab（HF系數(shù)：0.9349）29.744，0.000 161.724，0.000 22.296，0.000

2.4 血漿中LXA4 和MMP9 表達(dá)水平對(duì)早產(chǎn)兒BPD 發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值 依據(jù)BPD 組和非BPD 組LXA4濃度繪制ROC 曲線下面積AUC 為0.670（95%可信區(qū)間為0.580～0.759），最佳診斷界值為328.454 pg/mL，其特異度為0.867，靈敏度為0.514；依據(jù)BPD組和非BPD 組MMP9 濃度繪制ROC 曲線下面積AUC 為0.749（95%可信區(qū)間為0.667～0.830），最佳診斷界值為31.643 ng/mL，其特異度為0.856，靈敏度0.633；見圖1。

3 討論

BPD 是一種嬰兒期的慢性肺病，它的發(fā)病機(jī)制是多因素的，已有的相關(guān)研究［3］表明，早產(chǎn)兒肺發(fā)育不成熟、吸入氧濃度過高、過長(zhǎng)時(shí)間接觸氧氣及機(jī)械通氣，抗氧化能力缺陷以及蛋白酶抑制劑缺乏是BPD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，炎癥是BPD多因素起源的共同特征，本研究中病兒在吸入氧濃度、用氧及機(jī)械通氣時(shí)間上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與已有的研究［4］相一致，盡管在過去幾十年中新生兒醫(yī)學(xué)取得了許多進(jìn)展，如引入更好的機(jī)械通氣策略以及使用表面活性劑和產(chǎn)前類固醇激素，但BPD的發(fā)病率并未下降，因此早期預(yù)測(cè)BPD 的發(fā)生，并給予相應(yīng)的預(yù)防和治療對(duì)BPD的進(jìn)展及預(yù)后有重要的意義。

圖1 兩組指標(biāo)預(yù)測(cè)早產(chǎn)兒BPD的ROC曲線：A為L(zhǎng)XA4的ROC生存曲線，B為MMP9的ROC生存曲線

脂氧合酶（LXs）是花生四烯酸的重要代謝產(chǎn)物，能廣泛抑制多種炎性細(xì)胞的分泌和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，稱為炎性反應(yīng)的“剎車信號(hào)”，其強(qiáng)大的抗炎作用涉及機(jī)體的呼吸、消化、泌尿和自身免疫等多個(gè)系統(tǒng)［5-6］。朱天琦與楊建平［7］通過測(cè)定細(xì)胞活力證實(shí)LXA4可以通過促進(jìn)人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)和增殖減輕急性肺損傷；李淑君等［8］通過高氧誘導(dǎo)構(gòu)建的BPD動(dòng)物模型表明LXA4可能通過抑制TGF-β1信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)對(duì)高氧損傷小鼠肺上皮細(xì)胞的保護(hù)；Kumar 等［9］發(fā)現(xiàn)暴露于高氧環(huán)境中的小鼠體內(nèi)的LXA4 表達(dá)水平降低，推測(cè)LXA4對(duì)高氧所致肺損傷有重要的保護(hù)意義。本研究中BPD 組LXA4 的表達(dá)水平較非BPD 組明顯降低，與動(dòng)物及細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，且本研究發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間延長(zhǎng)，BPD 組LXA4 的表達(dá)水平越來越低，考慮可能是由于病兒出生后長(zhǎng)時(shí)間暴露高氧環(huán)境及機(jī)械通氣引起肺部反復(fù)感染，而肺部感染又引起一系列炎癥反應(yīng)，使炎癥細(xì)胞募集并激活造成肺組織和結(jié)構(gòu)損傷，肺損傷又使機(jī)械通氣、氣管插管及供氧時(shí)間延長(zhǎng)，形成惡性循環(huán)，引起抗炎因子如LXA4越來越低，這與Krishnamoorthy 等［10］發(fā)現(xiàn)的LXA4受體的表達(dá)水平隨著炎癥持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低相一致；本研究中BPD組LXA4表達(dá)水平在第7天明顯下降，而非BPD 組LXA4 的表達(dá)水平在第7天達(dá)到最高峰，可能與其在母體獲得的不飽和脂肪酸或腸道喂養(yǎng)有關(guān)，在炎癥反應(yīng)期間形成，然后起作用以解決炎癥反應(yīng)［11］，因此生后7 d檢測(cè)LXA4表達(dá)水平對(duì)早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良的早期預(yù)測(cè)有重要意義，對(duì)于可能發(fā)展為BPD 的早產(chǎn)兒，早期應(yīng)用LXA4類似物能預(yù)防BPD的發(fā)生。

細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和重塑是肺泡形成過程中的關(guān)鍵步驟，ECM 重構(gòu)與MMP9 基因、TIMP 1 基因表達(dá)增加和MMP 12 基因表達(dá)降低有關(guān)。有實(shí)驗(yàn)表明，40%氧氣的長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用增加了MMP9 和彈性蛋白酶活性，導(dǎo)致彈性蛋白降解增加和肺泡出現(xiàn)肺氣腫，類似于BPD 的結(jié)果。Lim 等［12］實(shí)驗(yàn)表明在高氧暴露后成年大鼠的II 型肺泡上皮細(xì)胞中MMP9 表達(dá)水平增高；Lee 等［13］研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)展為BPD 的早產(chǎn)兒肺泡灌洗液或氣管抽吸物中MMP9表達(dá)水平升高；本研究中BPD 組MMP9 的表達(dá)水平較非BPD 組明顯升高，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及既往臨床試驗(yàn)結(jié)果相符，表明MMP9 在BPD 的形成過程中發(fā)揮了重要的作用；且本研究發(fā)現(xiàn)生后7d 內(nèi)BPD組MMP9 的表達(dá)水平明顯升高，非BPD 組MMP9 的表達(dá)水平升高不明顯，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，BPD 組MMP9 的表達(dá)水平會(huì)越來越高，考慮可能是由于感染、機(jī)械通氣、吸入高氧等炎癥反應(yīng)的初期，引起炎性細(xì)胞肺內(nèi)聚集，活化的炎癥細(xì)胞釋放大量的氧自由基，導(dǎo)致彈性蛋白酶如MMP9 增高；而在肺纖維化啟動(dòng)階段，內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致炎性細(xì)胞聚集，釋放促纖維化細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子，促使MMPs 的合成與活化水平更高，從而參與肺基質(zhì)和基底膜的破壞［14］，導(dǎo)致BPD 發(fā)生，因此生后7 d 檢測(cè)MMP9 的表達(dá)水平對(duì)BPD 發(fā)生的早期預(yù)測(cè)有重要的價(jià)值。

綜上所述，LXA4 和MMP9 在BPD 早期預(yù)測(cè)中有重要的意義，根據(jù)ROC 曲線可知，當(dāng)早產(chǎn)兒血漿中LXA4 表達(dá)水平≤328.454 pg/mL，MMP9 表達(dá)水平≥31.643 ng/mL時(shí)發(fā)展為BPD的可能性大，但靈敏度和特異度還不夠高，可能與樣本量少、檢測(cè)儀器有限等有關(guān)，仍需要大量的臨床研究進(jìn)一步觀察兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)BPD 的診斷價(jià)值，以及LXA4 和MMP9與不同程度BPD 之間的相關(guān)性及與BPD 預(yù)后之間的關(guān)系。