陳哲，于康英，周鳴鳴

血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)產(chǎn)生的生物活性肽［1］，作用于血管平滑肌，是調(diào)節(jié)心血管活動的一個重要活性物質(zhì)，在心血管疾病如高血壓、心肌肥厚、心臟衰竭的發(fā)生中有重要作用［2］。自噬是體內(nèi)消化大分子蛋白的重要途徑，當(dāng)遇到營養(yǎng)缺乏等刺激時細(xì)胞通過形成自噬體消化體內(nèi)的大分子物質(zhì)，分解成氨基酸供機(jī)體使用，但是過度的自噬可能會過度消耗體內(nèi)物質(zhì)，造成細(xì)胞死亡，稱為程序性死亡［3-5］，有文獻(xiàn)報道在各類心血管疾病的發(fā)生過程中均有自噬水平的變化［6-8］，在心血管疾病的發(fā)生過程中，Ang Ⅱ和自噬水平的變化之間是否有內(nèi)在的關(guān)系，Ang Ⅱ是否通過自噬水平的改變來調(diào)節(jié)心臟機(jī)能變化還鮮有報道，Ang Ⅱ下游的受體主要有AT1 受體和AT2 受體兩種，而AT1 受體在Ang Ⅱ發(fā)揮的大部分功能中起到介導(dǎo)作用［9］，若Ang Ⅱ能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，那么是不是通過Ang Ⅱ的主要受體AT1 受體來發(fā)揮作用呢，本研究自2017年3月至2018年3月以體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）為實(shí)驗(yàn)材料，設(shè)計了以下一系列實(shí)驗(yàn)來探討這幾個問題。

1 材料與方法

1.1 原代細(xì)胞培養(yǎng) 采用組織貼塊法原代培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞。取150 g 左右的雄性SD 大鼠，斷頭法處死，無菌條件下迅速剝離腹主動脈，去除外膜和內(nèi)皮層，切成1 mm3的小塊貼在培養(yǎng)皿瓶底上，培養(yǎng)皿中加入10 mL含20%胎牛血清，1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基后，置于37 ℃，含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待單層細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿瓶底80%以上后去除組織塊，用0.25%胰酶傳代，取傳代在5～10 次以內(nèi)的血管平滑肌細(xì)胞備用。

1.2 Ang Ⅱ作用后蛋白質(zhì)免疫印跡測定 取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞以1×106/mm2傳代到六孔板中，將六孔板中生長面積達(dá)70%～80%的血管平滑肌細(xì)胞饑餓12 h 后，加入Ang Ⅱ等藥物，作用24 h 后，取細(xì)胞標(biāo)本做蛋白質(zhì)免疫印跡。在4 ℃條件下，用細(xì)胞裂解液收集貼壁細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min，取上清蛋白，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)膜60 min，所用抗體為脂化和膜相關(guān)蛋白3B（LC3B）（Abcam公司）。

1.3 免疫熒光觀察 取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞以1×105個/平方毫米傳代到24孔板中，將24孔板中生長面積達(dá)70%～80%的血管平滑肌細(xì)胞饑餓12 h后，加入Ang Ⅱ等藥物，作用24 h后，取細(xì)胞標(biāo)本做免疫熒光。用1∶1甲醇∶丙酮固定，用Triton-x100透化，所用抗體為LC3B（Abcam公司），Anti-actin antibody（密理博公司）。

1.4 方法 以VSMC 為研究對象，設(shè)立組別分別為空白組、Ang Ⅱ組、自噬抑制劑（3-MA）組、自噬促進(jìn)劑雷帕霉素（Rap）組、AT1 受體抑制劑（ARB）組、3-MA+Ang Ⅱ組、Rap+Ang Ⅱ組、ARB+Ang Ⅱ組，采用四唑鹽（MTT）比色法檢測細(xì)胞存活率，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ表達(dá)的變化，免疫熒光法檢測自噬小體數(shù)目的變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用Sigma Pro5.0軟件分析蛋白質(zhì)免疫印跡圖像結(jié)果，用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ang Ⅱ?qū)?xì)胞生存和活力的影響 對96孔板中生長面積70%～80%的血管平滑肌細(xì)胞用Ang Ⅱ作用24 h 后做MTT 實(shí)驗(yàn)，測定吸光度（吸光度和細(xì)胞生存活力成正相關(guān)），結(jié)果空白組吸光度為（0.159±0.001），Ang Ⅱ組吸光度為（0.151±0.003），P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可見Ang Ⅱ作用24 h后細(xì)胞生存活力變化不明顯，影響不大，說明AngⅡ作用這些時間后沒有造成細(xì)胞生存率的變化，即沒有造成細(xì)胞死亡。

2.2 Ang Ⅱ促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的LC3-Ⅱ表達(dá)量增多且呈時間依賴性和濃度依賴性 對六孔板中生長面積達(dá)到70%～80%的血管平滑肌細(xì)胞用10-7mol/L Ang Ⅱ作用0、6、12、24、48、72 h后蛋白質(zhì)免疫印跡檢測LC-3Ⅱ［10-12］表達(dá)量的變化，結(jié)果如圖1，將0 h 組灰度值定為1，則6，12，24，48，72 h 組分別為0.91，1.23，2.35，1.85，1.51。隨著時間延長，LC-3Ⅱ表達(dá)量增多，24 h達(dá)到最大，說明Ang Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞LC-3Ⅱ表達(dá)量增多，且呈現(xiàn)一定的時間依賴性。另外，對六孔板中生長面積達(dá)到70%～80%的血管平滑肌細(xì)胞用10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L Ang Ⅱ作用24 h 后蛋白質(zhì)免疫印跡檢測LC-3Ⅱ表達(dá)量的變化，結(jié)果如圖2，將濃度為0 組灰度值定為1，則10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 濃度組分別為1.81，2.81，3.32，3.15，3.92。隨著濃度遞減，LC-3Ⅱ表達(dá)量增多，說明Ang Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞LC-3Ⅱ表達(dá)量增多，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

圖1 Ang Ⅱ促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的LC3-Ⅱ表達(dá)量增多且呈時間依賴性：A為蛋白質(zhì)免疫印跡圖像，B為統(tǒng)計直方圖

同時自噬抑制劑3-MA 和自噬促進(jìn)劑Rap［13］的實(shí)驗(yàn)佐證了這一結(jié)果，設(shè)立組別為空白組、Ang Ⅱ、3-MA、3-MA+Ang Ⅱ組，及空白組、Ang Ⅱ、Rap、Rap+Ang Ⅱ組，Ang Ⅱ濃度采用10-7mol/L，作用時間為24 h 后，檢測LC-3Ⅱ表達(dá)水平的變化，結(jié)果如圖3。將空白組灰度值定為1，則Ang Ⅱ組，3-MA組，3-MA+Ang Ⅱ組分別為2.52，0.71，0.82。將空白組灰度值定為1，則Ang Ⅱ組，Rap組，Rap+Ang Ⅱ組分別為1.89，1.54，2.48。可見3-MA+Ang Ⅱ組比Ang Ⅱ組的LC-3Ⅱ表達(dá)量少，即3-MA對Ang Ⅱ（作用濃度和時間為10-7mol/L，24 h）引起的LC-3Ⅱ表達(dá)量增多起到抑制作用，也就是說Ang Ⅱ能夠誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞自噬的發(fā)生，且可被自噬抑制劑抑制。Rap+Ang Ⅱ組比Ang Ⅱ組的LC-3Ⅱ表達(dá)量多，可見Rap對Ang Ⅱ（作用濃度和時間為10-7mol/L，24 h）引起的LC-3Ⅱ表達(dá)量增多起到疊加作用，也就是說Ang Ⅱ能夠誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞自噬的發(fā)生，且可被自噬抑制劑抑制，被自噬促進(jìn)劑疊加作用，且呈現(xiàn)一定的時間依賴性和濃度依賴性。

圖2 Ang Ⅱ促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的LC3-Ⅱ表達(dá)量增多且呈濃度依賴性：A為蛋白質(zhì)免疫印跡圖像，B為統(tǒng)計直方圖

2.3 免疫熒光顯示自噬小體的變化 多種檢測方法共同使用能夠確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，為此，采用另外一種實(shí)驗(yàn)方法免疫熒光來檢測自噬發(fā)生的水平已驗(yàn)證是否和蛋白質(zhì)免疫印跡的結(jié)果一致。取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞以1×105個/mm2傳代到24 孔板中，將24 孔板中生長面積達(dá)70%～80%的血管平滑肌細(xì)胞饑餓12 h 后，加入Ang Ⅱ等藥物（設(shè)立組別空白組，Ang Ⅱ，3-MA+Ang Ⅱ，Rap+AngⅡ組），作用24 h 后，取細(xì)胞標(biāo)本做免疫熒光，用抗體LC3（Abcam 公司），Anti-actin antibody（密理博公司）檢測自噬小體［10］，自噬小體的數(shù)目和自噬水平呈正相關(guān)。如圖4，可見Ang Ⅱ能促進(jìn)自噬小體數(shù)目的增多，3-MA 能對Ang Ⅱ的影響起到抑制作用，Rap 能對Ang Ⅱ的影響起到疊加作用，驗(yàn)證了蛋白質(zhì)免疫印跡的結(jié)果。

圖3 Ang Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞自噬的發(fā)生，且被自噬抑制劑抑制，被自噬促進(jìn)劑疊加：A為蛋白質(zhì)免疫印跡圖像，B為統(tǒng)計直方圖

圖4 自噬抑制劑（3-MA）和雷帕霉素（Rap）對血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）引起的自噬小體數(shù)目變化的影響：A為空白組，B為Ang Ⅱ，C為3-MA+Ang Ⅱ，D為Rap+Ang Ⅱ

2.4 Ang Ⅱ通過AT1 受體誘導(dǎo)LC-3Ⅱ表達(dá)量增多 那么Ang Ⅱ是通過什么誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生呢？我們知道它下游的主要受體是AT1 受體［14-16］，那么這個自噬的發(fā)生是否也是通過AT1受體，通過設(shè)計以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。設(shè)立組別為空白組、Ang Ⅱ、ARB、ARB+Ang Ⅱ組，Ang Ⅱ濃度采用10-7mol/L，作用時間為24 h 后，檢測自噬程度的變化，結(jié)果如圖5，將空白組灰度值定為1，則Ang Ⅱ組，ARB 組，ARB+Ang Ⅱ組分別為3.25，0.82，0.62?？梢夾RB+Ang Ⅱ組比Ang Ⅱ組的LC-3Ⅱ表達(dá)量少，即ARB對Ang Ⅱ（作用濃度和時間為10-7mol/L，24 h）引起的LC-3Ⅱ表達(dá)量增多起到抑制作用，即抑制了AT1受體也抑制了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的自噬，說明Ang Ⅱ通過AT1受體誘導(dǎo)自噬發(fā)生。

圖5 Ang Ⅱ通過AT1受體誘導(dǎo)LC-3Ⅱ表達(dá)量增多：A為蛋白質(zhì)免疫印跡圖像，B為統(tǒng)計直方圖

同時通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這一結(jié)果，取培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞以1×105/mm2傳代到24 孔板中，將24 孔板中生長面積達(dá)70%～80%的血管平滑肌細(xì)胞饑餓12 h 后，加入Ang Ⅱ等藥物（設(shè)立組別空白組，Ang Ⅱ，ARB+Ang Ⅱ組），作用24 h后，取細(xì)胞標(biāo)本做免疫熒光，用抗體LC3 Ⅱ（Abcam公司），Anti-actin antibody（密理博公司）檢測自噬小體［10］。如圖6?？梢夾ng Ⅱ能促進(jìn)自噬小體數(shù)目的增多，ARB 能對Ang Ⅱ的影響起到抑制作用，說明Ang Ⅱ通過AT1 受體誘導(dǎo)自噬發(fā)生，驗(yàn)證了蛋白質(zhì)免疫印跡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖6 血管緊張素Ⅱ受體抑制劑（ARB）對血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）引起的自噬小體數(shù)目變化的影響：A為空白組，B為Ang Ⅱ，C為Rap+Ang Ⅱ

3 討論

這樣我們得出結(jié)論Ang Ⅱ能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生自噬，且呈現(xiàn)一定的時間依賴性和濃度依賴性。抑制AT1受體能夠抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的VSMC的自噬，說明這種影響是通過AT1 受體發(fā)揮作用的。由此可以猜想Ang Ⅱ是通過AT1 受體影響了下游信號通路，最終促進(jìn)了自噬的發(fā)生，即Ang Ⅱ通過AT1受體誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生自噬。

之前已有人證實(shí)Ang Ⅱ能夠促進(jìn)腎臟足細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞自噬的發(fā)生［17-18］，我們的研究證實(shí)AngⅡ在血管平滑肌細(xì)胞中也能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，通過檢測自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ和自噬小體兩種方法證實(shí)Ang誘導(dǎo)VSMC自噬的發(fā)生并且呈現(xiàn)一定的時間依賴性和濃度依賴性。在Ang Ⅱ作用濃度為10-7mol/L，作用時間為24 h 時，達(dá)到最佳誘導(dǎo)效果。對于自噬在心血管疾病中的發(fā)生機(jī)制，有文獻(xiàn)報道Ang Ⅱ促進(jìn)線粒體ROS 的增多伴隨著自噬的增強(qiáng)［18］，而研究報道，Ang Ⅱ通過AT1 受體進(jìn)而激活NADPH氧化酶最終導(dǎo)致ROS的增多［19-20］，我們的研究證實(shí)了Ang Ⅱ是通過AT1 受體而導(dǎo)致自噬的發(fā)生，暗示Ang Ⅱ、AT1 受體、ROS 和自噬發(fā)生之間可能存在一個信號通路，這個信號通路的闡明將有助于我們進(jìn)一步了解自噬的發(fā)生及調(diào)控機(jī)制。

這項(xiàng)研究提供了Ang Ⅱ能夠誘導(dǎo)自噬發(fā)生的依據(jù)，并且闡明了其中的可能機(jī)制。自噬是一把雙刃劍，適度自噬能夠清除體內(nèi)垃圾，過度自噬可能造成機(jī)體損傷［21］，已有報道證明Ang Ⅱ能夠誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞鈣化［22］，及動脈粥樣硬化［23-25］，如果能夠?qū)ng Ⅱ誘導(dǎo)的自噬同平滑肌細(xì)胞鈣化及動脈粥樣硬化聯(lián)系起來，將自噬作為調(diào)節(jié)治療平滑肌細(xì)胞鈣化及動脈粥樣硬化的靶點(diǎn)，將具有更為重要的意義。