李瑩，孫萬仆，安志強(qiáng)，管淑敏

結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在胃腸道腫瘤中排名第三［1］。流行病學(xué)調(diào)查顯示，在中國，結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年增長［2］。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是結(jié)腸癌預(yù)后較差的重要原因［3］。目前，結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，探討結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子單鏈非編碼RNA，長度約為18～25 個核苷酸，參與細(xì)胞的生長、增殖、凋亡等生物學(xué)過程［4］。研究顯示，miR-671-5p 通過直接靶向叉頭框蛋白M1（FOXM1）在乳腺癌中起抑癌基因作用，可作為乳腺癌的新型治療靶標(biāo)［5］。miR-671-5p過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，與其靶向負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖上調(diào)因子（URGCP）表達(dá)有關(guān)［6］。但是，miR-671-5p 對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響還未知。本研究自2018 年1 月至2019 年1月探討了miR-671-5p對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機(jī)制，以期為結(jié)腸癌的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和實驗試劑 結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、SW620、HT29、LOVO 以及人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；胎牛血清和RPMI 1640 培養(yǎng)基，北京索萊寶公司；胰蛋白酶和四甲基噻唑藍(lán)（MTT），美國Sigma 公司；染色盒同源物4（CBX4）抗體，上海鈺博生物科技有限公司；細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶14（MMP-14）抗體，美國Santa Cruz 公司；酪氨酸激酶1（JAK1）、磷酸化JAK1（p-JAK1）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）和磷酸化STAT3（p-STAT3）抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒，美國Invitrogen公司；Trizol 試劑，深圳晶美公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒，F(xiàn)ergma 公司；miR-671-5p模擬物（mimics）、陰性對照和CBX4 過表達(dá)載體，上海吉瑪公司設(shè)計并合成；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組轉(zhuǎn)染 結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480、SW620、HT29、LOVO 以及人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)箱中。每2～3天更換1次新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80%后，0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。以SW480 細(xì)胞為研究對象，分組處理。miR-671-5p組：轉(zhuǎn)染miR-671-5p mimics；miR-NC組：轉(zhuǎn)染miR-671-5p mimics 陰性對照；miR-671-5p+pcDNACBX4組：共轉(zhuǎn)染miR-671-5p mimics與CBX4過表達(dá)載體；miR-671-5p+pcDNA 組：共轉(zhuǎn)染miR-671-5p mimics 與空載體。轉(zhuǎn)染操作過程嚴(yán)格參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后6 h，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-671-5p和CBX4 mRNA 表達(dá) Trizol 試劑提取細(xì)胞中總RNA，紫外分光光度計檢測提取的RNA 純度和濃度，確保RNA溶液260nm/280nm的比值處于1.8～2.0范圍內(nèi)。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計45 個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算miR-671-5p 和CBX4 mRNA 的相對表達(dá)水平。

1.2.3 MTT 檢測細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，調(diào)整濃度為2.5×104個/mL，每孔200μL接種于96孔板中。分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入20μL MTT溶液濃（5 mg/mL），繼續(xù)孵育4 h。吸棄上清液，加入150μL DMSO，充分混勻，于酶聯(lián)免疫分析儀490 nm處測定吸光度值。

1.2.4 細(xì)胞克隆形成實驗 準(zhǔn)備培養(yǎng)皿，將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天。待細(xì)胞形成肉眼可見的克隆時終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)基。PBS 清洗細(xì)胞3 次，加入4%甲醛固定15 min，棄固定液，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，PBS 清洗后晾干，顯微鏡觀察并計數(shù)。

1.2.5 Transwell 檢測細(xì)胞遷移和侵襲 細(xì)胞遷移實驗：各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用不含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整濃度為2.5×105個/毫升。取100μL細(xì)胞懸液加入Transwell 上室，下室加入500 μL 含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后，4%多聚甲醛固定15 min，棉簽擦去上室細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡觀察。隨機(jī)選取5 個視野計數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗：首先將Matrigel基質(zhì)膠與RPMI 1640培養(yǎng)基以1∶8的比例稀釋，鋪設(shè)于Transwell上室，自然晾干。然后加入100μL 細(xì)胞懸液，剩余操作同細(xì)胞遷移實驗。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白水平 RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，收集上清液，BCA法測定蛋白含量。取30μL蛋白溶液，加入適量上樣緩沖液，沸水中煮沸5 min，行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)至聚偏乙烯二氟膜（PVEF），5%脫脂牛奶孵育1 h。TBST洗膜后，加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日，TBST 洗膜后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。TBST 再次洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光試劑ECL，避光顯影，Quantity One軟件分析圖像。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-671-5p和CBX4 之間靶向關(guān)系 starBase 在線軟線預(yù)測顯示，CBX4的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）中含有miR-671-5p的結(jié)合位點。PCR 擴(kuò)增含有miR-671-5p 結(jié)合位點的CBX4 的3’UTR，構(gòu)建CBX4 的3’UTR 的野生型（WT）質(zhì)粒。利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點突變后，構(gòu)建AKR1B10 的3’UTR 的突變型（MUT）質(zhì)粒。SW480細(xì)胞調(diào)整濃度為2.5×105個/mL，接種于24孔板中。待細(xì)胞融合至60%時，分別將AKR1B10 的3’UTR的WT、MUT質(zhì)粒與miR-671-5p mimics、陰性對照共轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6 h，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h 后，收集細(xì)胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒，測定每組的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS.22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-671-5p與CBX4 mRNA水平 與人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 比，結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、SW620、HT29 和LOVO 中miR-671-5p水平顯著降低（F＝71.671，P＝0.000，P＜0.01），CBX4 mRNA 水平顯著升高（F＝218.744，P＝0.000，P＜0.01）。由于結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞中miR-671-5p表達(dá)水平最低，CBX4 mRNA 水平最高，因此，選取SW480細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。見表1。

表1 結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-671-5p與CBX4mRNA水平/（，n＝9）

表1 結(jié)腸癌細(xì)胞系中miR-671-5p與CBX4mRNA水平/（，n＝9）

注：與NCM460細(xì)胞比，aP＜0.05；CBX4為染色盒同源物4

組別NCM460 SW480 SW620 HT29 LOVO CBX4 mRNA 1.01±0.08 2.52±0.16a 1.42±0.11a 2.11±0.13a 1.71±0.10a miR-671-5p 1.00±0.07 0.32±0.10a 0.71±0.11a 0.43±0.10a 0.51±0.09a

2.2 miR-671-5p過表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖的影響miR-671-5p組miR-671-5p水平顯著高于miR-NC組（t＝49.846，P＝0.000，P＜0.01），表明miR-671-5p mimics 轉(zhuǎn)染成功，SW480 細(xì)胞中miR-671-5p 過表達(dá)。與miR-NC 組比，miR-671-5p 組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h 后 的OD 值（t24h＝7.374，t48h＝8.028，t72h＝14.877，P 均＝0.000，P＜0.01）、克隆形成率（t＝12.208，P＝0.000，P＜0.01）及CyclinD1 蛋白水平顯著降低（t＝9.283，P＝0.000，P＜0.01），p21蛋白水平顯著升高（t＝6.801，P＝0.000，P＜0.01）。見表2。

2.3 miR-671-5p過表達(dá)對SW480細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 與miR-NC 組比，miR-671-5p 組遷移（t＝6.613，P＝0.000，P＜0.01）和侵襲細(xì)胞數(shù)（t＝10.265，P＝0.000，P＜0.01）、MMP-9（t＝7.547，P＝0.000，P＜0.01）和MMP-14 蛋白水平顯著降低（t＝7.867，P＝0.000，P＜0.01）。見表3。

表3 miR-671-5p過表達(dá)對SW480細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響/（，n＝9）

表3 miR-671-5p過表達(dá)對SW480細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響/（，n＝9）

注：與miR-NC 組比，aP＜0.05；MMP-9 為基質(zhì)金屬蛋白酶9，MMP-14為基質(zhì)金屬蛋白酶14

MMP-14 0.72±0.11 0.70±0.09 0.43±0.05a組別空白對照組miR-NC組miR-671-5p組遷移細(xì)胞數(shù)135±13.25 130±15.49 80±16.57a侵襲細(xì)胞數(shù)122±10.52 125±13.56 67±10.17a MMP-9 1.03±0.15 1.01±0.16 0.56±0.08a

2.4 miR-671-5p 靶基因的生物學(xué)方法預(yù)測及其靶基因驗證 預(yù)測結(jié)果顯示，CBX4 的3’UTR 中含有與miR-671-5p 互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖1。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-671-5p mimics 可降低共轉(zhuǎn)染CBX4-WT的SW480細(xì)胞的熒光素酶活性（t＝22.278，P＝0.000，P＜0.01），而 對 共 轉(zhuǎn) 染CBX4-MUT 的SW480 細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著影響（t＝0.633，P＝0.536），表明miR-671-5p 可與CBX4的3’UTR靶向結(jié)合，見表4。與miR-NC組比，miR-671-5p組CBX4蛋白水平顯著降低（t＝11.051，P＝0.000，P＜0.01）；與anti-miR-NC 組比，anti-miR-671-5p 組CBX4 蛋白水平顯著升高（t＝8.904，P＝0.000，P＜0.01），進(jìn)一步說明miR-671-5p 負(fù)調(diào)控CBX4表達(dá)，見圖2。

圖1 CBX4的3’UTR中含有與miR-671-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表2 miR-671-5p過表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖的影響/（，n＝9）

表2 miR-671-5p過表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖的影響/（，n＝9）

注：與miR-NC組比，aP＜0.05；CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1

組別空白對照組miR-NC組miR-671-5p組p21 0.53±0.11 0.55±0.13 1.00±0.15a miR-671-5p 1.01±0.03 1.00±0.05 3.16±0.12a細(xì)胞活性（OD 490 nm）24 h 0.45±0.10 0.41±0.08 0.20±0.03a 48 h 1.03±0.11 1.01±0.09 0.65±0.10a 72 h 1.45±0.12 1.42±0.13 0.71±0.06a克隆形成率/%1.03±0.11 1.01±0.08 0.52±0.09a CyclinD1 1.01±0.03 0.98±0.11 0.52±0.10a

圖2 miR-671-5p負(fù)向調(diào)控CBX4表達(dá)

表4 miR-671-5p靶基因雙熒光素酶報告實驗/（，n＝9）

表4 miR-671-5p靶基因雙熒光素酶報告實驗/（，n＝9）

組別miR-NC組miR-671-5p組t值P值CBX4-WT 1.03±0.05 0.45±0.06 22.278 0.000 CBX4-MUT 1.08±0.09 1.05±0.11 0.633 0.536

2.5 CBX4 過表達(dá)降低了miR-671-5p 過表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響 與miR-671-5p+pcDNA 組比，miR-671-5p+pcDNA-CBX4 組細(xì)胞培 養(yǎng)24、48、72 h 后 的OD 值（t24h＝15.809，t48h＝3.475，t72h＝2.672，P＝0.000，P＜0.01）、遷 移（t＝3.730，P＝0.000，P＜0.01）和侵襲細(xì)胞數(shù)（t＝8.970，P＝0.000，P＜0.01）及CyclinD1（t＝11.735，P＝0.000，P＜0.01）和MMP-9（t＝9.487，P＝0.000，P＜0.01）蛋白水平顯著升高，見表5。

2.6 CBX4 過表達(dá)降低了miR-671-5p 過表達(dá)對SW480 細(xì)胞JAK1/STAT3 信號通路的影響 與miR-NC組比，miR-671-5p組p-JAK1（t＝11.947，P＝0.000，P＜0.01）和p-STAT3 蛋白水平顯著降低（t＝7.075，P＝0.000，P＜0.01）。與miR-671-5p+pcDNA組比，miR-671-5p+pcDNA-CBX4 組p-JAK1（t＝9.338，P＝0.000，P＜0.01）和p-STAT3 蛋白水平（t＝9.775，P＝0.000，P＜0.01）顯著升高。見表6。

3 討論

miRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶mRNA 翻譯或降解mRNA 調(diào)控基因的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，探討腫瘤中異常表達(dá)的miRNA及其對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響可為腫瘤的靶向治療提供新思路［7］。研究顯示，miR-663a、miR-15b-5p、miR-211等多種miRNA 參與調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程，與結(jié)腸癌的發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)［8-10］。miR-671-5p基因定位于7q36.1，參與腎細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、上皮樣肉瘤等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［11-13］。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、SW620、HT29和LOVO中miR-671-5p表達(dá)水平顯著低于人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460，提示miR-671-5p 參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。轉(zhuǎn)染miR-671-5p mimics 至SW480 細(xì)胞，結(jié)果顯示，miR-671-5p 過表達(dá)可抑制SW480細(xì)胞增殖、克隆形成以及遷移和侵襲，提示miR-671-5p可作為結(jié)腸癌治療的新靶點。

表6 CBX4過表達(dá)降低了miR-671-5p過表達(dá)對SW480細(xì)胞JAK1/STAT3信號通路的影響（，n＝9）

表6 CBX4過表達(dá)降低了miR-671-5p過表達(dá)對SW480細(xì)胞JAK1/STAT3信號通路的影響（，n＝9）

注：與miR-NC組比，aP＜0.05；與miR-671-5p+pcDNA組比，bP＜0.05；CBX4為染色盒同源物4

JAK1 0.86±0.05 0.87±0.10 0.82±0.13 p-JAK1 0.84±0.09 0.43±0.05a 0.41±0.06 STAT3 0.88±0.15 0.91±0.11 0.93±0.10 p-STAT3 0.81±0.13 0.45±0.08a 0.47±0.06組別miR-NC組miR-671-5p組miR-671-5p+pcDNA組miR-671-5p+pcDNA-CBX4組0.83±0.08 0.80±0.11b 0.89±0.09 0.85±0.10b

CBX4 是作為多梳蛋白家族（PcG）成員之一。研究顯示，CBX4 在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，miR-129-5p 靶向CBX4 表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖［14］。miR-195 通過靶向CBX4 表達(dá)抑制肝細(xì)胞癌HepG2 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力［15］。目前，CBX4 對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響還未知。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌細(xì)胞中CBX4 表達(dá)水平升高，提示CBX4 作為促癌基因參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示，CBX4 的3’UTR中含有與miR-671-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，提示miR-671-5p可能調(diào)控CBX4表達(dá)。雙熒光素酶實驗證實了miR-671-5p 可與CBX4 的3’UTR 靶向結(jié)合。同時，上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中miR-671-5p水平，CBX4蛋白表達(dá)降低，而下調(diào)miR-671-5p水平后CBX4 蛋白表達(dá)升高，進(jìn)一步說明miR-671-5p 負(fù)調(diào)控CBX4 表達(dá)。研究顯示，CBX4 過表達(dá)降低了miR-671-5p過表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，提示miR-671-5p 通過下調(diào)CBX4 表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

表5 CBX4過表達(dá)降低miR-671-5p過表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響（，n＝9）

表5 CBX4過表達(dá)降低miR-671-5p過表達(dá)對SW480細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響（，n＝9）

注：與miR-NC組相比，aP＜0.05；與miR-671-5p+pcDNA組相比，bP＜0.05；CBX4為染色盒同源物4，CyclinD1為細(xì)胞周期蛋白D1，MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9

MMP-9 1.05±0.12 0.50±0.10a 0.48±0.09 0.98±0.13b組別miR-NC組miR-671-5p組miR-671-5p+pcDNA組miR-671-5p+pcDNA-CBX4組細(xì)胞活性（OD 490 nm）24 h 0.40±0.05 0.21±0.02a 0.20±0.03 0.39±0.02b 48 h 1.06±0.08 0.66±0.11a 0.67±0.13 0.86±0.10b 72 h 1.45±0.16 0.73±0.08a 0.75±0.10 1.10±0.58b遷移細(xì)胞數(shù)132±16.36 82±15.85a 85±16.35 113±15.49b侵襲細(xì)胞數(shù)128±11.58 69±12.48a 70±11.31 116±10.43b CyclinD1 1.03±0.05 0.43±0.05a 0.45±0.07 0.96±0.11b

JAK/STAT 信號通路主要由酪氨酸激酶相關(guān)受體、酪氨酸激酶JAK 和轉(zhuǎn)錄因子STAT 三個成分組成，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程［16］。當(dāng)細(xì)胞因子與相應(yīng)受體結(jié)合后，受體二聚化，導(dǎo)致與受體偶聯(lián)的JAK磷酸化而被激活JAK。JAK活化后進(jìn)而將與受體偶聯(lián)的STAT磷酸化［17］。磷酸化的STAT形成二聚體從受體上釋放下來，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究顯示，直腸癌細(xì)胞和組織中STAT3 異?；罨?8］。本研究結(jié)果顯示，miR-671-5p過表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞中p-JAK1與p-STAT3蛋白水平顯著降低，表明miR-671-5p過表達(dá)抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞JAK1/STAT3 信號通路的激活。CBX4 過表達(dá)降低了miR-671-5p 過表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞中JAK1/STAT3信號通路的抑制作用，提示miR-671-5p通過下調(diào)CBX4 表達(dá)影響JAK1/STAT3 信號通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，過表達(dá)miR-671-5p可能通過靶向負(fù)調(diào)控CBX4 表達(dá)進(jìn)而抑制JAK1/STAT3 信號通路的活性降低結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，是結(jié)腸癌分子靶向治療的潛在靶點。