朱娟娟，崇慧峰，胡志軍，吳寶明，潘曉龍，李旭光，唐吉斌

腦血管病是我國成年人致死和致殘的首位原因，《中國腦卒中防治報告2018》概要指出，由于社會老齡化及不健康生活方式的流行，我國腦卒中有爆發(fā)式增長的態(tài)勢，并且呈現(xiàn)出性別和地域差異明顯以及年輕化的趨勢［1］。血液中同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平增高被認(rèn)為是腦卒中發(fā)病的風(fēng)險因素之一［2］，其水平的增高受非遺傳因素和遺傳因素的影響：葉酸缺乏及糖攝入增加是常見的導(dǎo)致Hcy水平增高的非遺傳因素，而5，10-亞甲基四氫葉 酸 還 原 酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）活性下降是導(dǎo)致Hcy水平增高的主要遺傳性因素之一［3］。

MTHFR是Hcy代謝與葉酸代謝中的關(guān)鍵酶，它可催化5，10-亞甲基四氫葉酸使血中Hcy 發(fā)生甲基化，維持其在血中的水平。MTHFR C677T基因多態(tài)性是由第677 位的點(diǎn)突變導(dǎo)致的，突變導(dǎo)致的酶活性下降可引起高Hcy血癥［4］。

目前關(guān)于MTHFR C677T 基因多態(tài)性與腦卒中的關(guān)系越來越引起人們的重視，但由于其基因分布頻率受地域和種族影響［5］，研究結(jié)果尚有爭議，本研究以銅陵地區(qū)腦卒中人群作為研究對象，分析該人群MTHFR C677T基因多態(tài)性分布及Hcy水平，探討腦卒中發(fā)生的風(fēng)險因素并為其個體化防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年10月到2019年4月銅陵市人民醫(yī)院住院的腦卒中病人234 例為研究對象，均為長期居住本地的漢族人。經(jīng)頭顱CT或MRI檢查，符合中華醫(yī)學(xué)會第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議提出的各項腦血管病診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中出血性腦卒中82 例，缺血性腦卒中152 例；男性140 例，女性94例；年齡范圍為23～92歲，年齡69歲，234例病人均進(jìn)行MTHFR C677T基因多態(tài)性檢測，其中227例進(jìn)行了Hcy檢測。選取同時間段無冠心病、高血壓、腦血管病于醫(yī)院其他科室69例住院病人為對照組，其中男性35例，女性34例；年齡范圍為22～88歲，年齡55 歲，69 例對照組均進(jìn)行MTHFR C677T 基因多態(tài)性檢測，其中67例進(jìn)行了Hcy檢測。記錄研究對象身高、體質(zhì)量、有無高血壓史，并計算體質(zhì)量指數(shù)（Body Mass Index，BMI）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 PyroMark Q24 焦磷酸測序儀（德國凱杰公司），高速低溫離心機(jī)（德國赫擔(dān)馳公司），基因擴(kuò)增儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司），全血基因組提取試劑盒及測序反應(yīng)通用試劑盒（長沙三濟(jì)公司），基因擴(kuò)增試劑（日本Takara 公司），擴(kuò)增引物（上海捷瑞生物工程有限公司），全自動生化分析儀（德國西門子公司），Hcy 檢測試劑盒（安徽大千生物工程有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 清晨采集受試者空腹靜脈血標(biāo)本，乙二胺四乙酸二鉀鹽（EDTA dipotassium salt，EDTA-K2）抗凝血2 mL 用于基因測序，未抗凝血2 mL待充分凝固后離心留取血清用于Hcy檢測。

1.3.2 全血基因組DNA 提取 采用柱式法從外周血細(xì)胞中將基因組DNA提取純化，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取后的DNA 可短期保存于2～8 ℃或長期凍存于-20 ℃和-80 ℃。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系含樣本DNA 2 μL、Taq 酶0.5 μL、正向引物和反向引物各1 μL、緩沖液5μL、dNTP 3μL，最后用純水補(bǔ)足總反應(yīng)體系50μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃5 min，94℃25 s，56 ℃25 s，72 ℃25 s，共35 個循環(huán)，72 ℃5 min 后擴(kuò)增產(chǎn)物可進(jìn)行測序。

1.3.4 基因測序 通過PyroMark Q24MDx系統(tǒng)采用焦磷酸測序法測定MTHFR C677T位點(diǎn)，確定各樣本基因型。

1.3.5 Hcy檢測 酶循環(huán)法檢測血清Hcy水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，定性資料的描述使用百分比，統(tǒng)計推斷使用χ2檢驗(yàn)，定量資料不服從正態(tài)分布時，統(tǒng)計描述使用中位數(shù)和四分位數(shù)間距，三樣本之間的比較使用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，兩樣本之間的比較使用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，組間兩兩比較時校正后的檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05/3＝0.017，同時以Hcy 為因變量進(jìn)行多元線性回歸分析，評價基因型、性別、年齡、BMI等對Hcy水平的影響。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR C677T 基因型檢測結(jié)果分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)焦磷酸測序后，儀器測得峰高與檢測位點(diǎn)結(jié)合模板的堿基數(shù)量成正比，經(jīng)軟件處理后自動轉(zhuǎn)化為序列信息，確定該樣本攜帶的基因型。見圖1。

圖1 MTHFR C677T基因測序結(jié)果分析圖：A為野生純合型（CC），B為雜合突變型（CT），C為純合突變型（TT）

2.2 MTHFR C677T 基因型頻率及等位基因頻率 如表1所示，本研究中腦卒中組MTHFR C677T的野生純合基因型（CC）、雜合突變型基因型（CT）和純合突變型基因型（TT）的分布頻率分別為31.2%、48.7%和20.1%，腦卒中組TT 基因型頻率高于對照組TT基因型頻率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而CC、CT 基因型頻率在兩組中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；腦卒中組和對照組T等位基因分布頻率分別為44.4%和33.3%，腦卒中組T等位基因分布頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。如表2 所示，在腦卒中組中，不同性別的病人MTHFR C677T基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 MTHFR C677T 基因型及等位基因的分布頻率/例（%）

表2 MTHFR C677T 基因型在不同性別腦卒中病人中的分布頻率/例（%）

2.3 MTHFR C677T 基因型與Hcy 水平的相關(guān)性 如表3 所示，在腦卒中組中，TT 基因型病人的Hcy 水平高于CC 基因型和CT 基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而對照組三種不同基因型之間Hcy 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。將腦卒中組和對照組同種基因型的Hcy 水平進(jìn)行比較，可以看出腦卒中組Hcy 水平均增高，其中TT 基因型的Hcy水平在兩組間有差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 MTHFR C677T 基因型與血清Hcy水平的關(guān)系/（μmol/L）

2.4 Hcy水平與其他變量的多元線性回歸 以Hcy為因變量，MTHFR C677T 不同基因型、性別、年齡、有無高血壓史和BMI 為自變量進(jìn)行的多元逐步分析結(jié)果顯示，僅基因型、性別、高血壓史與Hcy 存在顯著的線性關(guān)聯(lián)，回歸結(jié)果見表4，當(dāng)基因型由野生型（CC）向雜合突變（CT）及純合突變（TT）的轉(zhuǎn)化時，Hcy水平也會隨之增加，男性和有高血壓的病人Hcy水平也會增加。

表4 影響同型半胱氨酸水平的多元線性回歸分析

3 討論

腦卒中具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)［6］，可造成個人及國家的大量醫(yī)療支出，如能采取有效的措施早期干預(yù)其發(fā)病的危險因素，可顯著降低致殘率和致死率。

血液中高濃度的Hcy 會干擾血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，導(dǎo)致凝血和纖溶系統(tǒng)異常，使機(jī)體處于血栓前狀態(tài)，也可作用于內(nèi)皮細(xì)胞，使血管收縮，血壓上升，促使動脈粥樣硬化形成，增加腦血管病的發(fā)生風(fēng)險［4］。有研究認(rèn)為高Hcy血癥是獨(dú)立于高脂血癥、高血壓、糖尿病、吸煙和年齡之外，引發(fā)心血管疾病的一個獨(dú)立的危險因素［7］。但也有文獻(xiàn)指出目前國外的許多心血管疾病指南均未把高Hcy血癥作為心血管病的危險因素，并不贊同高Hcy血癥是心腦血管疾病的獨(dú)立危險因素的說法［8］?？傮w來說，國內(nèi)的大多研究認(rèn)為高Hcy血癥是影響高血壓病人心血管病預(yù)后的重要危險因素［9］。降低血中Hcy水平可有效減低腦卒中的發(fā)病風(fēng)險且改善急性腦梗死病人預(yù)后［10-11］。

MTHFR 是影響血中Hcy 水平的主要遺傳性因素之一，它是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶［12］，MTHFR C677T是目前研究最多的基因多態(tài)位點(diǎn)，由于第677位的堿基胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）置換導(dǎo)致，導(dǎo)致其編碼產(chǎn)物由丙氨酸被纈氨酸替代，從而影響酶的活性。這種點(diǎn)突變可產(chǎn)生三種基因型，分別是野生純合型CC，雜合突變型CT，純合突變型TT，CT型的酶活性是CC 型的65%，TT 型的活性僅為CC 型的30%［13］。目前，MTHFR C677T基因多態(tài)性與腦卒中相關(guān)性的研究很多：Li 等［14］指出中國人群MTHFR C677T 基因多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病相關(guān)，可能是由于其影響血中Hcy 水平所致；Zhao 等［15］認(rèn)為在中國高血壓病人中，MTHFR C677T基因型和葉酸補(bǔ)充與Hcy 對第一次卒中的影響密切相關(guān)，而且葉酸干預(yù)能顯著降低CC和CT基因型病人由高Hcy導(dǎo)致的卒中風(fēng)險，提示可根據(jù)個體遺傳背景和營養(yǎng)狀況對腦卒中進(jìn)行防治；張露等［16］卻認(rèn)為MTHFR C677T 基因突變可能與缺血性腦卒中無關(guān)；王超等［17］的研究也表明MTHFR C677T 基因在腦卒中組和健康人群組中的分布沒有差異。造成研究結(jié)果差異的原因可能是由于研究樣本量和分析方法不同導(dǎo)致，也有可能是研究人群具有不同遺傳背景和營養(yǎng)狀況導(dǎo)致，據(jù)報道中國人群具有較高的MTHFR C677T的突變頻率［13］，且由于飲食烹飪習(xí)慣的原因?qū)е麓蟛糠种袊赡耆耍ㄓ绕湓诒狈剑┤~酸攝入較低［1］，會導(dǎo)致較高的Hcy水平和腦卒中發(fā)病風(fēng)險。

本研究中安徽銅陵地區(qū)腦卒中人群MTHFR C677T突變的T等位基因頻率為45.1%，低于黑龍江地區(qū)［17］，高于廣州地區(qū)［18］，說明該基因有一定的地域特點(diǎn)。腦卒中組MTHFR C677T 突變基因T 的頻率高于對照組，提示在銅陵地區(qū)腦卒中可能與MTHFR C677T基因多態(tài)性相關(guān)。有報道指出MTHFR C677T 基因多態(tài)分布有性別差異［19］，但本研究中并未體現(xiàn)。在將腦卒中組和對照組進(jìn)行同種基因型Hcy 水平的比較時發(fā)現(xiàn)，腦卒中組均具有較高的Hcy水平，尤其TT基因型Hcy水平增高差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示當(dāng)TT基因型和高Hcy的同時存在時腦卒中有較高的發(fā)病風(fēng)險。腦卒中組三種基因型中TT基因型的Hcy水平高于其他兩種基因型，可能是由于純合突變的基因?qū)е旅富钚悦黠@下降所致。對影響Hcy水平的其他因素進(jìn)行多元線性回歸結(jié)果顯示，除了MTHFR C677T 的基因型，性別及高血壓史也會對Hcy 水平造成一定影響，這也就解釋了對照組三種基因型之間Hcy 水平無明顯差異的原因，除了MTHFR C677T基因多態(tài)性，Hcy水平還可能受性別和血壓情況等多種因素的影響。由于本研究是回顧性研究，研究對象葉酸攝取情況無法獲得，因此進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本量并對病人葉酸攝取情況進(jìn)行問卷調(diào)查是我們接下來要做的工作。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，銅陵地區(qū)腦卒中病人具有較高的MTHFR C677T基因的突變頻率和Hcy水平，可能是腦卒中發(fā)病的風(fēng)險因素。進(jìn)行MTHFR C677T基因多態(tài)性和Hcy水平的檢測有助于篩選腦卒中高危人群，并有望根據(jù)基因型及Hcy水平進(jìn)行不同劑量的葉酸補(bǔ)充，即個體化地指導(dǎo)腦卒中的一級預(yù)防和藥物治療，可極大地減輕病人和社會的負(fù)擔(dān)。