張旭，程遠(yuǎn)方，張江霞，宋沛然，張靜

胰腺癌是世界范圍內(nèi)致死率較高的重度惡性消化系統(tǒng)癌癥，病人多早期癥狀較為隱匿，疾病確診時多已處于中晚期，多治療效果不佳，5年生存率不及5%［1］。吉西他濱（Gemcitabin，GEM）是中晚期胰腺癌化療的標(biāo)準(zhǔn)用藥，但隨著化療期延長而逐步耐藥，并具有一定的毒副作用，吉西他濱聯(lián)用卡培他濱、奧沙利鉑、5-FU 順鉑等雖能一定程度改善治療效果，但療效仍不理想［2-3］。因此，尋找一種能夠降低胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱耐藥并提升其抑瘤效果的藥物意義重大。在化療過程中，多藥耐藥基因（multidrug resistance gene-1，MDR-1）是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥和化療失敗的主要因素，MDR-1 編碼的P 糖蛋白（P-gp）過表達(dá)而導(dǎo)致胰腺癌病人對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥［4］。同時，腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移與上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（cpithclial-mcscnchymal，EMT）有著顯著相關(guān)性。大黃素本質(zhì)為蒽醌類提取物，十多張抗腫瘤重要的有效活性成分，多項研究表明其能抑制腫瘤發(fā)展，促進(jìn)腫瘤生長和凋亡［5］。本研究自2018年3月至2019年3月探究吉西他濱聯(lián)合大黃素對胰腺癌SW1990 細(xì)胞增殖與侵襲的影響，并嘗試初步分析聯(lián)合應(yīng)用增強(qiáng)胰腺癌治療效果的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌細(xì)胞株SW1990由美國組織培養(yǎng)庫（ATCC）提供。均培養(yǎng)于含100μg/mL 鏈霉素、100U/mL 青霉素和10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞單層貼壁生長融合70%～80%，胰蛋白酶消化傳代。

1.2 藥品、試劑和儀器 藥品與試劑：胎牛血清、RPMI1640 及胰酶購自美國Gibco 公司；大黃素（emodin），購自美國Sigma 公司，用DMSO 配制成0.2 mol/L，終濃度＜0.1%；吉西他濱購自法國禮來公司；Trizol 和MTT 試劑購自美國Sigma 公司；兔抗人Bcl-2 多克隆抗體及鼠抗人Bax 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；Caspase-3及Survivin 兔抗人單克隆抗體購自美國Abcam 公司；TWIST1、ZEB1、E-cadhcrin、β-actin 單克隆抗體購自美國CST 公司；Transwell 小室模型購自美國康寧公司；RT-PCR 試劑盒由中國吉麻制藥技術(shù)有限公司提供。

儀器：Bio-Plex200 流式細(xì)胞儀及1658001 蛋白印跡電泳儀購自美國Bio-Rad公司，RD-PCR儀由西安天空科技有限公司提供，HH-CP-01W 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱由上海蘭儀實業(yè)有限公司提供。

1.3 細(xì)胞分組與處理 將處于生長對數(shù)期的SW1990 細(xì)胞分為大黃素組、吉西他濱組、大黃素聯(lián)合吉西他濱組及對照組，大黃素組給予40μmol/L 大黃素處理SW1990/Gem 細(xì)胞，吉西他濱組給予20 μmol/L 吉西他濱處理SW1990/Gem 細(xì)胞，聯(lián)合組給予與前等量大黃素和吉西他濱聯(lián)合處理SW1990/Gem 細(xì)胞，對照組給予等量0.1%DMSO溶液。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測 （1）流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。96孔板每孔接種4×103的細(xì)胞過夜培養(yǎng)，細(xì)胞按照1.3分組處理48 h后，采用胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS沖洗2次，加入Binging Buffer重懸細(xì)胞，加入5μL PI 和5μL Annexin V-FITC，室溫避光15 min，于激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長530 nm 上機(jī)檢測，重復(fù)3次，采用Cell quest軟件分析。

（2）流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜糖蛋白（P-gp）陽性率。收集各組胰腺癌細(xì)胞調(diào)至1×107/mL備用，臺盼藍(lán)染色計數(shù)（＞90%～95%），加入工作濃度（1∶50）PE標(biāo)記熒光素抗體，以陰性SW1990 胰腺癌細(xì)胞做對照，室溫孵育20 min，PBS沖洗2次，1 500 r/min離心3 min 棄去上清，PBS 沖洗2 次，加入300 mL PBS 重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測陽性率。

1.5 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 96 孔板每孔接種4×103的細(xì)胞過夜培養(yǎng)，細(xì)胞按照1.3分組處理48 h后，棄去上清，加入5 mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO 后震蕩10 min，實驗重復(fù)3 次，每組6 個重復(fù)，測定每孔光密度，計算細(xì)胞存活率。

1.6 Transwell 小室模型檢測胰腺癌細(xì)胞侵襲能力 收集各組胰腺癌細(xì)胞調(diào)至1×105/mL 備用。將60 mg 于4 ℃冷藏過夜的Matrigel 膠取出放置在冰上，與無血清培養(yǎng)基混勻稀釋，取60μL混合液加入Transwell 小室，于37 ℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱孵育2 h，將200μL 預(yù)先備好的胰腺癌細(xì)胞懸液均勻加入Transwell小室底部膜上室面，下室面加入600μL的10%胎牛血清培養(yǎng)基，于37 ℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，取出上室，棄去液體，4%多聚甲醛固定15～20 min，0.1%結(jié)晶紫染色40 min，PBS 沖洗靜置干燥，×100顯微鏡下觀察胰腺癌細(xì)胞穿透數(shù)量。

1.7 qRT-PCR 檢測MDR-1、miRNA-1271及EMT相關(guān)標(biāo)志物（TWIST1、ZEB1、E-cadhcrin）mRNA表達(dá) （1）收集各組胰腺癌細(xì)胞，采用Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA，以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系：RNA 樣本1μL，dNTPs（10 mmol/L）0.8μL，RT primers（1 μmol/L）1.3 μL，5×RT buffer 4 μL，MMLV Reverse TranscriptASC 0.3 μL，總 反 應(yīng) 體 系20 μL，16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃10 min。

（2）RT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 1.33μL，無核酸酶水7.67μL、引物及探針混合物1.0μL、2×通用混合物10 μL，U6 及β-actin 基因作為內(nèi)參，反應(yīng)條件：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40個循環(huán)。

MDR-1 引物，正向：5′-GAATCTGGAGGAACACATGACC - 3′ ，反 向：5′ TCCAATTTTGTCACCAATTCC3′。

miRNA-1271 引 物，正 向：5′-CAGCACTTGGCACCTAGCA - 3′ ；反 向：5′ - TATGGTTGTTCTCCTCTCTGTCTC-3’。

TWIST1 引 物，正 向：5′ - AGCTGAGCAAGATTCAGACCCTCA-3′，反向：5′-CTGCAGCTTGCCATCTTGGAGT-3′。

ZEB1 引 物，正 向：5′ -GCACAACCAAGTGCAGAAGA-3′ ，反 向：5′ -CATTTGCAGATTGAGGCTG-3′。

E-cadhcrin 引物，正向：5′-AAGTGCTGCAGCCAAAGACAGA-3′，反向：5′-AGGTAGACCCACCTCAATCATCCTC-3′。

MDR-1、miRNA-1271、TWIST1、ZEB1及E-cadhcrin 相對表達(dá)量采用2-△△Ct計算，△△Ct＝（待測組目的基因平均Ct 值-待測組內(nèi)參基因平均Ct 值）-（對照組目的基因平均Ct 值-對照組內(nèi)參基因平均Ct值）。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 收集各組胰腺癌細(xì)胞常規(guī)方法提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，10%SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，加入含5%脫脂奶粉Tris 緩沖液封閉2 h，加入Caspase-3、Survivin、TWIST1、ZEB1、E-cadhcrin 抗體孵育過夜，加入二抗孵育2 h，ECL 發(fā)光液顯色。采用Bandscan 5.0 分析條帶灰度值，并計算蛋白的相對表達(dá)量。目的蛋白相對表達(dá)量＝目的條帶灰度值/樣本內(nèi)參灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。觀測資料主要為計量資料，多組間比較采用單因素方差分析+兩兩比較LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素與吉西他濱單獨及聯(lián)合作用對胰腺癌SW1990 細(xì)胞凋亡、增殖及侵襲的影響 聯(lián)合組可顯著抑制胰腺癌SW1990 細(xì)胞增殖和侵襲，SW1990細(xì)胞凋亡率顯著更高，與其他三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡、增殖及侵襲能力比較/

表1 各組胰腺癌SW1990細(xì)胞凋亡、增殖及侵襲能力比較/

注：與對照組比較，aP＜0.05；與聯(lián)合組比較，bP＜0.05

組別對照組大黃素組吉西他濱聯(lián)合組F值P值細(xì)胞侵襲/個244.4±9.1 175.3±9.5ab 192.0±8.6ab 105.8±7.8a 13.141 0.000細(xì)胞凋亡/%2.2±1.5 8.3±2.4ab 10.1±3.0ab 26.9±3.7a 14.622 0.000細(xì)胞增殖/%100.0±3.0 80.5±2.8ab 77.6±3.1ab 60.1±2.4a 9.850 0.000

2.2 RT-PCR 檢測MDR-1、miRNA-1271 及EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá) 聯(lián)合組MDR-1 mRNA顯著降低，miRNA-1271 及E-cadhcrin mRNA 顯著升高，且與其他組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各組TWIST1、ZEB1 mRNA 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組MDR-1、miRNA-1271及EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)RT-PCR檢測結(jié)果

表2 各組MDR-1、miRNA-1271及EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)RT-PCR檢測結(jié)果

注：與對照組比較，aP＜0.05；與聯(lián)合組比較，bP＜0.05，MDR-1為多耐藥基因-1，miRNA-1271為微小RNA-1271，EMT為上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

ZEB1 1.0±0.3 1.1±0.5ab 1.0±0.5ab 1.1±0.4a 0.988 0.326組別對照組大黃素組吉西他濱聯(lián)合組F值P值MDR-1 3.6±0.7 2.2±0.3 2.3±0.4 1.3±0.1 20.572 0.000 miRNA-1271 0.3±0.1 1.1±0.3ab 1.0±0.4ab 3.8±0.8a 27.456 0.000 E-cadhcrin 0.6±0.2 1.1±0.4ab 0.9±0.3ab 2.8±0.5a 15.838 0.000 TWIST1 1.1±0.5 1.0±0.5ab 1.0±0.4ab 1.0±0.5a 0.894 0.374

2.3 流式細(xì)胞儀檢測MDR-1編碼的P糖蛋白（P-gp）陽性率 對照組、大黃素組、吉西他濱組與聯(lián)合組P-gp 陽性率分別為（42.6±3.5）%、（28.4±2.9）%、（23.6±1.8）%、（13.3±1.8）%，聯(lián)合組顯著低于其他組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝12.777，P＝0.000）。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組P糖蛋白表達(dá)情況

2.4 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白及EMT 相關(guān)標(biāo)志物蛋白含量 聯(lián)合組可以顯著抑制Bcl-2、Caspase-3 及Survivin 表達(dá)，上調(diào)Bax 表達(dá)，降低Bcl-2/Bax 比值，其效果明顯高于吉西他濱組和大黃素組（P＜0.05）。聯(lián)合組E-cadhcrin 蛋白表達(dá)顯著高于其他組，TWIST1、ZEB1蛋白表達(dá)顯著低于其他組（P＜0.05）。見表3，圖2。

圖2 各組蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結(jié)果：1為對照組，2為大黃素組，3為吉西他濱組，4為聯(lián)合組

3 討論

胰腺位于腹腔深側(cè)，早期胰腺癌癥狀相對不明顯，輕度癥狀容易被忽視，當(dāng)疾病確診時往往處于中晚期而錯失了手術(shù)根除治療的機(jī)會。手術(shù)治療的病人往往遠(yuǎn)期效果不十分理想，容易發(fā)生遠(yuǎn)器官轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。吉西他濱是晚期胰腺癌化療的首選藥物之一，但吉西他濱單一藥物作用不能很好地與胰腺癌病人發(fā)生反應(yīng)，吉西他濱與其他化療藥物合用歲能夠提高腫瘤的治療效果，但伴隨著高藥物毒性，病人的生存率和生存質(zhì)量得不到明顯改善［6］。研究中指出［7］，多數(shù)惡性腫瘤存在不同程度的多藥耐藥。因此，尋找一種毒副作用較小的藥物與吉西他濱聯(lián)用，提升化療對胰腺癌的作用效果，改善病人預(yù)后具有重大意義。大黃素是一種天然的化療輔助藥物，其能夠抑制多種惡性腫瘤疾病進(jìn)展，多項研究顯示［8-10］，大黃素可以增強(qiáng)順鉑、紫杉醇等多種藥物對于惡性腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。本研究對大黃素增強(qiáng)吉西他濱治療胰腺癌的效果并嘗試分析了可能的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，大黃素聯(lián)合吉西他濱可顯著抑制胰腺癌SW1990 細(xì)胞增殖和侵襲，SW1990 細(xì)胞凋亡率顯著更高，與其他三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示，大黃素在不增加吉西他濱劑量的條件下提升了吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞的殺滅效率。細(xì)胞增殖和侵襲能力與細(xì)胞凋亡有著密切關(guān)系，惡性腫瘤細(xì)胞普遍存在細(xì)胞凋亡異常，大黃素聯(lián)合吉西他濱能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而遏制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

化療后獲得性耐藥是惡性腫瘤治療效果不佳的重要原因［11］。本研究采用RT-PCR檢測MDR-1基因水平和編碼蛋白P-gp 水平，并通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3 及Survivin 水平。結(jié)果顯示，吉西他濱聯(lián)合大黃素組MDR-1 mRNA、P-gp、Bcl-2、Caspase-3及Survivin 表達(dá)顯著降低，Bax 表達(dá)顯著升高，與其他幾組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。研究顯示［12-13］，大黃素能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（ROS），從而導(dǎo)致Bax 表達(dá)升高，Bcl-2 表達(dá)降低，導(dǎo)致線粒體Cytochrome C 大量釋放進(jìn)入胞質(zhì)，激活Caspase3 活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2 和Bax 表達(dá)異常輸尿管是導(dǎo)致吉西他濱耐藥的關(guān)鍵因素，NF-kB 能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3等細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，進(jìn)而一直腫瘤細(xì)胞凋亡。Survivin是NF-kB的下游蛋白，其能抑制Caspase 酶的活性從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，在胰腺正常導(dǎo)管中機(jī)會不表達(dá)，在胰腺上皮內(nèi)瘤或胰腺導(dǎo)管腺癌中表達(dá)明顯上升。研究顯示［14］，吉西他濱等化療藥物作用于腫瘤細(xì)胞容易激活NF-kB 途徑，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對于吉西他濱治療不敏感。因此，本研究推測大黃素能夠通過降低NF-kB 活性，進(jìn)而增強(qiáng)吉西他濱對于胰腺癌的敏感性，并上調(diào)Bax 表達(dá)，下調(diào)Bcl-2/Bax比值，促進(jìn)胰腺癌腫瘤細(xì)胞凋亡。

人miR-1271 定位于ARL10 基因的第2 內(nèi)含子區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)，miR-1271 在多種惡性腫瘤中低表達(dá)，上調(diào)miR-1271 可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲，并抑制TWIST1、ZEB1、FOXQ1等蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮抑制癌癥發(fā)展的作用［15］。miRNA 除了參與癌

表3 各組腫瘤組織凋亡相關(guān)蛋白及EMT相關(guān)標(biāo)志物蛋白質(zhì)免疫印跡檢測結(jié)果/xˉ±s

細(xì)胞凋亡，還參與抑制EMT，EMT 是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要病理機(jī)制。E-cadhcrin、TWIST1、ZEB1 是腫瘤細(xì)胞EMT 進(jìn)程發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，研究顯示［16］TWIST1、ZEB1可作為胰腺癌惡性程度的重要指示指標(biāo)。本研究中，在吉西他濱大黃素作用下，miRNA-1271 及E-cadhcrin mRNA顯著升高，同時，聯(lián)合組E-cadhcrin蛋白表達(dá)顯著高于其他組，TWIST1、ZEB1蛋白表達(dá)顯著低于其他組（P＜0.05）。大黃素可以通過調(diào)節(jié)多種信號抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲，研究發(fā)現(xiàn)［17］大黃素可以調(diào)節(jié)miR-1271 表達(dá)抑制惡性腫瘤的惡性生物學(xué)行為。因此，大黃素不僅可以增強(qiáng)吉西他濱對于胰腺癌細(xì)胞的藥效，還可以提高miRNA-1271水平，抑制胰腺癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲遷移能力的效果。