程睿，杜娟，吳偉，江振洲，張陸勇，黃鑫

(1.中國藥科大學江蘇省新藥篩選重點實驗室，南京 210009；2.中國藥科大學藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，南京 210009；3.中國藥科大學江蘇省藥效研究與評價服務中心，南京 210009；4.廣東藥科大學藥學院新藥篩選與藥效學評價中心，廣州 510006)

研究發(fā)現(xiàn)中藥在體內除了能改變藥物代謝酶的表達和功能外，還能對轉運體起到調節(jié)作用，從而影響其他藥物的體內處置過程[1-2]。肝臟轉運體是肝清除及維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一個重要因素，已有大量文獻報道肝臟轉運體與藥物肝毒性關系密切，因此近年來轉運體在中藥肝毒性的研究中也逐漸受到重視[3-6]。原代肝細胞是研究轉運體攝取實驗的主要體外模型，可以用來預測內、外源性物質在肝臟上的轉運情況。本文通過建立“三明治”培養(yǎng)的大鼠原代肝細胞模型，測定大鼠原代肝細胞上Oct1和Oatp1b2的基因表達以及應用轉運體的已知探針底物雷尼替丁和瑞舒伐他汀評價轉運體的功能，在此模型上分別以維拉帕米及利福平作為Oct1和Oatp1b2的抑制劑研究雷公藤紅素、雷公藤內酯酮、雷公藤內酯甲、甘草次酸、柴胡皂苷D、大黃素、大黃酸7種肝毒性中藥單體對Oct1和Oatp1b2的作用，探討該7種中藥單體引起肝損傷的可能機制，為有毒中藥的肝毒性研究提供思路。

1 材料與方法

1.1動物 實驗動物：Wistar雄性大鼠，體質量200～220 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號碼：SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)溫度為18～23 ℃，濕度為60%～80%，12 h/12 h光照明暗周期。

1.2藥物與試劑 鹽酸雷尼替丁對照品(含量：99.9%，批號：100163-201607)、瑞舒伐他汀鈣對照品(含量：97.6%，批號：101028-201202)、內標醋酸可的松對照品(含量：97.6%，批號：101028-201202)、雷公藤內酯甲對照品(含量：99%，批號：111597-200402)、維拉帕米(含量：98%，批號：100223-200102)、利福平(含量：98.8%，批號：130496-201403)購自中國藥品生物制品檢定所；雷公藤紅素對照品購自廣州牌生物科技(含量：98%)；雷公藤內酯酮對照品購自南京康滿林化工實業(yè)有限公司(含量：98%，批號：20130726)；大黃素對照品購自中國食品藥品檢定研究院(含量：98%，批號：110756-200110)；柴胡皂苷D對照品購自成都思科華生物技術有限公司(含量：98%)；膠原(collagen from calf skin，貨號：C3867)、膠原酶(膠原酶Ⅰ，貨號：C0130)、地塞米松(貨號：D1756)購自Sigma公司；乙酸(色譜純，批號：911273)購自TEDIA COMPANYINC，甲酸(色譜純，貨號：6F2941)購自ROE SCIENTIFIC INC，甲醇、乙腈(色譜純)購自Merck Company。

1.3儀器與設備 Shimadzu LC-20AD泵，SIL-20AC自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20A連接器(島津公司)；AB SciexTM 5500質譜檢測器(AB SCIEX公司)；Thermo TSQ Quantum Ultra液相色譜質譜聯(lián)用儀(Thermo公司)；THERMO LEGEND MICRO21R 高速冷凍離心機(Thermo Scientific 公司)；SPD2010真空旋轉干濃縮儀、Forma -80 ℃超低溫冰箱(Thermo Electron公司)；AE240萬分之一電子分析天平(Mettler Toledo公司)；自動純水機(Thermo Electron公司)；-20 ℃冰箱(青島海爾公司)；V20 Volumetric KF Titrator水分測定儀(METTLER TOLEDO 公司)；XW-80A渦旋混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠)；MX-S混勻儀(北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)。

1.4原代肝細胞的提取與培養(yǎng) 大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠3只，自由飲水與進食。動物適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。實驗前禁食12 h，自由飲水。大鼠腹腔注射20%烏拉坦麻醉，常規(guī)消毒后開腹，分離大鼠下腔靜脈和門靜脈。門靜脈插管，起初以88 r·min-1的流速灌流乙二胺四乙酸(EGTA)緩沖液，幾秒后肝變?yōu)橥咙S色，灌流泵流速改為144 r·min-1。2.5 min后，改灌流0.035%膠原酶溶液，泵流速為88 r·min-1，灌流8～11 min，此時肝變?yōu)榉奂t透明的狀態(tài)，肝表面沁出一層水分，待肝臟局部出現(xiàn)塌陷，按壓后不易恢復結束灌流。灌流結束后剪碎肝臟，收集在0.019%膠原酶溶液中，置于37 ℃搖床搖勻，100目濾網過濾，細胞懸液低速離心(4 ℃，50 g，5 min)后用預冷的William E培養(yǎng)基重懸細胞，相同條件下重復離心兩次清洗細胞。最后一次用William E培養(yǎng)基重懸細胞后，臺盼蘭染色法測定細胞活率，活率達到 85% 以上即可用于實驗。將細胞點入膠原包被的6孔板中，每天換液。

1.5逆轉錄定量PCR(qRT-PCR)測定各攝取轉運體的mRNA水平 將提取的大鼠原代肝細胞培養(yǎng)4 h使其貼壁后再將其分別貼壁培養(yǎng)4，8，16，24 h，棄去培養(yǎng)基，加入1 mL Trizol 裂解細胞，提取細胞總RNA，PCR測定Oct1和Oatp1b2轉運體各時間點的mRNA表達水平，各轉運體的引物設計如表1，擴增程序為：95 ℃ 5 min，(95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s)×40 個循環(huán)。擴增后在60～95 ℃分析溶解曲線并用2-ΔΔCt法計算基因表達差異。

表1 目的基因引物序列

1.6原代肝細胞轉運體攝取模型驗證

1.6.1不同孵育時間和探針底物濃度下原代肝細胞對探針底物的攝取能力 用二甲基亞砜分別配制底物雷尼替丁和瑞舒伐他汀的母液，濃度為100 mmol·L-1，William E 培養(yǎng)基稀釋雷尼替丁和瑞舒伐他汀母液，充分混勻，使雷尼替丁的終濃度分別為2，5，10，20，50 μmol·L-1，瑞舒伐他汀的終濃度分別為2，5，10，20 μmol·L-1。棄去細胞培養(yǎng)6孔板中的舊培養(yǎng)基，加入相應濃度的底物，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，孵育完成吸去6孔板中的培養(yǎng)基，按1.9方法進行操作。

用William E 培養(yǎng)基稀釋雷尼替丁和瑞舒伐他汀母液，充分混勻，使其終濃度分別為由探針底物濃度依賴性實驗篩選出的最佳條件。棄去細胞培養(yǎng)6孔板中舊培養(yǎng)基，往其中加入相應濃度的底物，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，分別在給予底物2，5，10，15，30，45，60 min后定點收取細胞樣品，按1.9方法進行操作。

1.6.2抑制劑對探針底物在原代肝細胞上攝取的影響 由探針底物濃度依賴性和時間依賴性實驗結果選擇不同探針底物相應的給藥濃度和時間。分別給予Oct1的抑制劑維拉帕米100 μmol·L-1；Oatp1b2的抑制劑利福平50，100 μmol·L-1。預孵育后給予各轉運體相應的探針底物進行孵育，孵育完成后收取細胞樣品，按1.9方法進行操作。

1.7原代細胞給藥與培養(yǎng) 將肝細胞懸液加入6孔板中，每個孔加入2 mL William E 培養(yǎng)基，使細胞密度約為5.0×106cell·mL-1，6孔板放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。給藥前棄去6孔板中的舊培養(yǎng)基，加入含有受試藥物的培養(yǎng)基，同時設置陽性對照[分別含維拉帕米(雷尼替丁)、利福平(瑞舒伐他汀)]和空白對照(僅加入探針底物)。雷公藤紅素組、雷公藤內酯酮組和雷公藤內酯甲組共孵育15 min，大黃素組、大黃酸組、甘草次酸組和柴胡皂苷D組共孵育30 min后，棄去6孔板中的培養(yǎng)基，加入已用William E 培養(yǎng)基稀釋為相應濃度的雷尼替丁和瑞舒伐他汀，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入雷尼替丁組的細胞共孵育10 min，加入瑞舒伐他汀的孵育15 min。孵育完成吸去板中的培養(yǎng)基，收集細胞樣品并進行檢測。

1.8原代肝細胞蛋白含量測定 在100 μL細胞裂解液中加入100 μL RIPA裂解液，渦旋混勻，冰上放置15 min充分裂解細胞后，4 ℃，12 000×g離心15 min，取上清。96孔板中分別加入20 μL濃度為0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25，0.015 625和0 mg·mL-1的蛋白標準品和20 μL用0.9%氯化鈉溶液或磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋10倍的蛋白樣品后每個孔中繼續(xù)加入二喹啉甲酸混合工作液共200 μL(A液：B液=50：1)，60 ℃條件下反應15 min，于562 nm處檢測吸光度，根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。

1.9液相色譜-質譜/質譜聯(lián)用法測定肝細胞攝取量

1.9.1細胞樣品收集與前處理 預冷的PBS清洗細胞3次后，每孔加入200 μL預冷的三蒸水，冰上放置15 min。用細胞刮刀收集細胞并將收集的細胞放置于超聲儀中30 min使其裂解。然后把分離的細胞置于-80 ℃冰箱反復凍融3次，徹底裂解細胞，渦旋混勻細胞裂解液。取細胞裂解液100 μL，加入70%乙腈(三蒸水：乙腈=3：7)配制的含IS(醋酸可的松，50 ng·mL-1)的沉淀劑 1 mL，渦旋3～5 min，4 ℃，13 300 r·min-1離心10 min，吸取上清液0.8 mL再次在4 ℃，13 300 r·min-1條件下離心10 min，取部分上清液進樣。

1.9.2色譜和質譜條件 雷尼替丁色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)；柱溫：40 ℃；進樣室溫度：4 ℃，進樣體積：2 μL；流動相：A：水相：5 mmol·L-1醋酸銨(含0.05%甲酸)；B：有機相：甲醇(含5 mmol·L-1醋酸銨和0.05%甲酸)，洗脫梯度：0 min，A：B 90/10(V/V)；0.8 min，A：B 45/55(V/V)；1.6 min，A：B 10/90(V/V)；4.5 min，A：B 90/10(V/V)；4.5～7 min，A：B 90/10(V/V)；流速：0.45 mL·min-1。質譜條件：電噴霧離子源(electroprag ion source,ESI)；正離子掃描；多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoning,MRM)；檢測離子：雷尼替?。簃/z315～176.2，醋酸可的松：m/z403.3～163.1。

瑞舒伐他汀色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(3.0 mm×150 mm，3.5 μm)；柱溫：40 ℃；進樣室溫度：4 ℃；進樣體積：5 μL；流動相組成：A：水相：0.03%乙酸；B：有機相：甲醇，洗脫梯度：0 min，A：B 85/15(V/V)；1 min，A：B 10/90(V/V)；4.5 min，A：B 10/90(V/V)；5.5～8.5 min，A：B 85/15(V/V)；流速：0.35 mL·min-1。質譜條件：電噴霧離子源(ESI)；正離子掃描；檢測方式：選擇反應監(jiān)測(SRM)；檢測離子：瑞舒伐他?。簃/z482.2～258.1，醋酸可的松：m/z403.3～163.1。

2 結果

2.1大鼠原代肝細胞模型Oct1和Oatp1b2的mRNA表達 應用qRT-PCR檢測各攝取轉運體在大鼠原代培養(yǎng)肝細胞上的表達水平，圖1顯示隨培養(yǎng)時間的延長，大鼠原代肝細胞上Oct1和Oatp1b2的mRNA表達水平逐漸下調。4 h時，各轉運體的mRNA表達水平最高，8 h與4 h相比有明顯差異，且8 h后轉運體的mRNA表達水平極顯著性下調。綜合結果可知，原代肝細胞上該兩種轉運體的mRNA表達水平隨著培養(yǎng)時間延長逐漸下調，提示給藥時間應定于貼壁完成后的4 h前后，實驗應在4 h內完成。

①與4 h組比較，P<0.01。

①Compared with 4 h group，P<0.01.

2.2大鼠原代肝細胞轉運體攝取模型驗證

2.2.1不同孵育時間和探針底物濃度對大鼠原代肝細胞攝取功能的影響 轉運體介導的肝細胞攝取是呈現(xiàn)底物濃度和時間依賴性的。因此，在不同濃度和孵育時間下篩查最適當的底物濃度和孵育時間是驗證轉運體攝取模型的重要一步。由兩個探針底物在不同孵育時間(圖2)和不同探針底物濃度下的肝攝取曲線(圖3)可見：雷尼替丁和瑞舒伐他汀的攝取在15 min和20 min時趨于飽和，分別選取飽和的前一個時間點作為探針底物的給藥時間，即10和15 min。當雷尼替丁濃度在10 μmol·L-1以下時，Oct1對其攝取較快，之后攝取變慢，所以實驗選擇雷尼替丁的給藥濃度是5 μmol·L-1；瑞舒伐他汀(Oatp1b2探針底物)的攝取濃度轉折點為10 μmol·L-1，以此作為其給藥濃度。

2.2.2抑制劑對探針底物在原代肝細胞上攝取的影響 加入探針底物的抑制劑觀察底物攝取量的變化是驗證原代肝細胞攝取模型是否成功的關鍵一步。因此分別選擇Oct1和Oatp1b2的抑制劑維拉帕米和利福平進行模型驗證。由圖4可見，給予維拉帕米100 μmol·L-1時，Oct1對雷尼替丁的攝取顯著下調；給予利福平50，100 μmol·L-1時，Oatp1b2對瑞舒伐他汀的攝取下調且一定程度上呈現(xiàn)濃度依賴性。

2.3中藥單體對Oct1探針底物雷尼替丁攝取的影響 陽性對照組維拉帕米在給藥濃度為100 μmol·L-1時，Oct1對雷尼替丁的攝取顯著下調。與空白對照組比較，雷公藤紅素、甘草次酸和柴胡皂苷D 3組中雷尼替丁的攝取水平顯著下調；雷公藤內酯酮的低濃度(50 μmol·L-1)組中Oct1對雷尼替丁的攝取上調；而雷公藤內酯甲、大黃素、大黃酸和高濃度雷公藤內酯酮組(100 μmol·L-1)中雷尼替丁的攝取沒有明顯變化，見圖5。

2.4中藥單體對Oatp1b2介導的瑞舒伐他汀攝取的影響 陽性對照利福平在100 μmol·L-1時，Oatp1b2對瑞舒伐他汀的攝取顯著下調。與空白對照組比較，雷公藤紅素、高濃度大黃酸(10 μmol·L-1)、甘草次酸和柴胡皂苷D各組瑞舒伐他汀的攝取水平顯著下調；雷公藤內酯酮、雷公藤內酯甲、大黃素和低濃度大黃酸對Oatp1b2介導的瑞舒伐他汀的攝取無顯著影響，見圖6。

①與對照組比較，P<0.01。

①Compared with control group，P<0.01.

3 討論

近年來中藥致肝損傷的事件不斷增加，已成為制約中藥發(fā)展的重要因素[7]。轉運體是一種功能性跨膜蛋白，在藥物的吸收、分布、消除及內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維護中起著重要的作用[8-9]。肝臟上的轉運體包括SLC家族和ABC家族[9]，其中SLC類轉運體成員主要有：有機陽離子轉運體(organic cation transporter，OCTs)、有機陰離子轉運體(organic anion transporter，OATs)和有機陰離子轉運多肽(organic anion transporting polypeptide，OATPs)等。OCTs和OATPs都是位于血管側膜的攝取型轉運體，負責將外源性和內源性物質轉入肝臟中，如膽汁酸結合物、多巴胺等[10]。本實驗選擇的Oct1和Oatp1b2是大鼠肝臟上Octs和Oatps的主要成員，參與介導多種物質在大鼠肝臟中的轉運和消除[11]。

①與對照組比較，P<0.01。

①與對照組比較，P<0.01；②與對照組比較，P<0.05。

“三明治”培養(yǎng)的大鼠原代肝細胞模型是一種可以模擬體內肝細胞環(huán)境并能用于評價肝細胞攝取和外排功能的體外模型[12-13]。本文利用Selgen兩步膠原酶灌注法建立了大鼠肝原代模型，應用qRT-PCR技術和各轉運體的已知探針底物，從基因表達和攝取功能兩方面對建立的原代肝細胞模型上兩種轉運體的表達和功能進行了表征。結果表明，所考察的轉運體在肝細胞上的表達受時間和底物濃度等因素的影響，由此提示，在利用大鼠肝原代細胞模型評價轉運體對藥物的處置時需要注意細胞培養(yǎng)時間和底物濃度等因素。另外，筆者也同時考察了24 h～4 d時間段中各轉運體的基因表達情況，發(fā)現(xiàn)Oct1和Oatp1b2的mRNA在分離培養(yǎng)后的24 h～4 d中保持在一個極低值，這與文獻報道基本相符。本實驗利用建立的大鼠肝原代細胞模型，從Oct1和Oatp1b2兩種轉運體的功能活性方面初步探討了7種肝毒性中藥單體的毒性機制。結果表明，雷公藤紅素、甘草次酸、柴胡皂苷D組、大黃酸組和雷公藤內酯酮組中的一種或兩種底物的攝取量與對照組相比存在顯著差異。因此，推測該幾種單體的肝毒性可能與Oct1和Oatp1b2有關。

綜上所述，本實驗結果表明，考察的7種肝毒性中藥單體能對Oct1和Oatp1b2中的一種或兩種產生影響，多數為對其攝取能力的抑制作用?？赏茰y這7種肝毒性中藥單體的肝臟損傷機制可能是通過下調或上調肝臟Oct1和Oatp1b2的攝取功能來實現(xiàn)的。這些結果可能為這7種中藥單體的肝毒性和肝處置研究奠定了初步基礎，并進一步為肝毒性中藥的體內研究提供思路。