潘 磊 許 杰 楊 帥 陳云松 陳連紅 馬文廣

（玉溪中煙種子有限責(zé)任公司，653100，云南玉溪）

花粉是種子植物的雄配子體，具有豐富的遺傳多樣性，是種質(zhì)保存和交換以及雜交育種的重要材料，其萌發(fā)后傳遞的父本遺傳信息是種子形成的關(guān)鍵，在植物有性繁殖過程中起著重要作用[1]。在煙草雜交種種子的生產(chǎn)過程中，煙株必須經(jīng)過花粉采集、人工授粉才能受精結(jié)實(shí)。高質(zhì)量的花粉是煙草育種成功與否的關(guān)鍵，也是種子產(chǎn)量提升的前提，花粉的質(zhì)量主要以活力來體現(xiàn)[2]?；ǚ刍盍κ侵富ǚ墼谶m宜條件下萌發(fā)的能力。在室溫及自然濕度條件下，煙草花粉的壽命只有15d左右[3]，如何貯藏花粉并保持其活力，是煙草雜交制種工作開展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

1922年，Knowlton[4]發(fā)現(xiàn)-196℃貯存后的金魚草（Antirrhinum majus）花粉仍具有一定的活力?；ǚ鄣蜏刭A藏在20世紀(jì)80年代逐漸興起，日本、美國(guó)、英國(guó)、印度和中國(guó)相繼建立了花粉超低溫保存中心（庫(kù)）[5]。花粉低溫貯藏的植物種類從最初的果樹、農(nóng)作物，逐漸發(fā)展到園林植物、蔬菜、牧草、藥用植物等[6]。低溫貯藏能顯著延長(zhǎng)花粉的壽命。前人研究發(fā)現(xiàn)，水稻[7]、紫菜苔[8]、辣椒[9]、芍藥[10]、番茄[11]等花粉經(jīng)長(zhǎng)期超低溫保存后依然具有較強(qiáng)的生活力，部分植物花粉保存10年以上仍能保持一定的活力[12-13]。目前，花粉貯藏的研究對(duì)象以果蔬及觀賞性花卉為主，主要集中在花粉采集、貯藏前預(yù)處理、化凍方法以及花粉含水量對(duì)貯藏效果的影響方面，然而關(guān)于煙草花粉的貯藏以及不同貯藏方式對(duì)煙草花粉生理生化特性的影響研究較少。本試驗(yàn)研究了經(jīng)過-196℃冷凍、-80℃冷凍和4℃冷藏3種方式保存后煙草花粉的活力變化、形態(tài)和內(nèi)含物差異，為煙草花粉的適宜貯藏溫度選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用3個(gè)不同的煙草類型N. rustica、Maryland 609和云煙85為試驗(yàn)材料。其中，N. rustica為野生煙，Maryland 609為白肋煙，云煙85是目前生產(chǎn)上主要種植的烤煙品種之一。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2017年2月在玉溪中煙種子有限責(zé)任公司西雙版納冬繁基地開展。取N. rustica、Maryland 609和云煙85成熟花朵，剝出花藥于室內(nèi)晾制，待其完全散粉后，以0.2g為一個(gè)單位分裝入2mL凍存管內(nèi)進(jìn)行貯藏，設(shè)置3個(gè)處理：-196℃（液氮）、-80℃（超低溫冰箱）和4℃。期間每月定期取樣檢測(cè)花粉活力，比較不同處理間花粉活力變化的差異。貯藏16個(gè)月后，于2018年6月取樣檢測(cè)花粉形態(tài)及生理指標(biāo)變化。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 花粉活力檢測(cè) 從2017年2月開始，每月定期取樣，通過液體培養(yǎng)基離體萌發(fā)法檢測(cè)花粉活力。培養(yǎng)基配方：10%蔗糖，50mg/L硼酸和50mg/L CaCl2；取500 μ L液體培養(yǎng)基加入2mL離心管中，加入待測(cè)花粉，花粉濃度2.5mg/mL左右，混合均勻后將離心管置于25℃光照培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)1.5h，取 40～50 μ L 滴入凹形載玻片凹槽，于 10×物鏡下進(jìn)行鏡檢，以花粉管長(zhǎng)度超過花粉粒直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)（制3個(gè)片），每個(gè)重復(fù)隨機(jī)觀察3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。

1.3.2 花粉電鏡照片拍攝 新鮮花藥在空氣中自然干燥散粉后，撒于樣品臺(tái)的兩面膠上，真空噴金后，在Hitachi S-520型掃描電子顯微鏡下觀察并拍攝照片。

1.3.3 花粉游離氨基酸總量測(cè)定 采用總氨基酸（T-AA）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）測(cè)定游離氨基酸總量。

1.3.4 花粉內(nèi)含物測(cè)定 采用硫酸-苯酚法測(cè)定可溶性糖含量；采用酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸含量；采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量；采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

采用DPS 7.05進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD法進(jìn)行多重比較；采用Excel進(jìn)行圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏條件下煙草花粉活力變化

3個(gè)不同類型的煙草參試品種在不同貯藏溫度條件下花粉活力的定期檢測(cè)方差分析結(jié)果如表1所示。從表1數(shù)據(jù)可以看出，經(jīng)-196℃凍存16個(gè)月后的花粉，3個(gè)參試品種N. rustica、Maryland 609和云煙85的活力分別為0.64±0.06、0.65±0.08和0.64±0.07，與貯藏前活力檢測(cè)數(shù)據(jù)0.66±0.04、0.66±0.07和0.64±0.09比較，均無顯著差異；-80℃貯藏條件下，3個(gè)參試品種花粉在貯藏前活力分別為0.65±0.06、0.64±0.12和0.63±0.08，貯藏16個(gè)月后活力分別為0.65±0.09、0.64±0.11和0.64±0.05，可見，-80℃溫度條件下，花粉活力在貯藏16個(gè)月后無顯著變化；而在4℃貯藏條件下，庫(kù)存花粉活力表現(xiàn)出逐月下降的趨勢(shì)。以參試品種N. rustica為例，貯藏前花粉活力為0.65±0.10，經(jīng)4個(gè)月貯藏后花粉活力下降至0.08±0.02，之后的月份未能檢測(cè)到花粉活力。這表明煙草花粉在-196℃和-80℃條件下長(zhǎng)時(shí)間（16月）保存，花粉活力能得到有效保持。

表1 不同貯藏溫度條件下參試煙草品種花粉活力定期檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of pollen vitality of the tested tobacco varieties under different storage temperature conditions

2.2 不同貯藏溫度條件下煙草花粉群體形態(tài)差異

不同貯藏溫度條件下，3個(gè)煙草類型的花粉形態(tài)列于圖1中。從圖1可以看出，經(jīng)-196℃和-80℃溫度條件凍存16個(gè)月后，煙草花粉的形狀規(guī)則，呈長(zhǎng)橢圓形，內(nèi)含物飽滿，外壁清晰，萌發(fā)溝均勻分布。而經(jīng)4℃冷藏16個(gè)月后的花粉則發(fā)生了明顯皺縮，萌發(fā)溝扭曲，花粉形狀不規(guī)則。這表明，-196℃和-80℃溫度條件下保存有利于煙草花粉形態(tài)的保持。

圖1 不同貯藏條件下煙草花粉群體電鏡照片F(xiàn)ig.1 Electron micrograph of tobacco pollen population under the different storage conditions

2.3 不同貯藏溫度條件下煙草花粉可溶性糖含量差異

可溶性糖作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以增加細(xì)胞滲透壓，提高保水能力，還可以降低細(xì)胞質(zhì)冰點(diǎn)，防止細(xì)胞質(zhì)凝膠凝固。分析不同貯藏溫度條件下參試煙草花粉可溶性糖含量差異（表2），以參試品種中野生種N. rustica為例，貯藏16個(gè)月后，-196℃和-80℃貯藏條件下的花粉可溶性糖含量分別為309.276±2.989和286.808±8.476mg/g，差異不顯著；與4℃冰箱中花粉可溶性糖含量158.056±8.484mg/g相比較，差異顯著，可溶性糖含量分別提升95.67%和81.46%。Maruland 609和云煙85的數(shù)據(jù)變化規(guī)律均與N. rustica一致。結(jié)果表明，煙草花粉在-196℃和-80℃條件下保存有利于其可溶性糖含量的保持。

表2 不同貯藏溫度條件下煙草花粉可溶性糖含量Table 2 Soluble sugar content of tobacco pollen under the different storage temperatures mg/g

2.4 不同貯藏溫度條件下煙草花粉游離氨基酸總量差異

游離氨基酸既能增加細(xì)胞液的濃度，又能提高原生質(zhì)的保水能力及膠體的穩(wěn)定性。以參試品種N. rustica的花粉游離氨基酸總量檢測(cè)結(jié)果為例（表3），不同貯藏溫度條件下，煙草花粉游離氨基酸總量按貯藏溫度自低而高排列分別為15.817±2.136、24.152±1.395、12.574±0.132 μ mol/mg， 不 同 貯 藏溫度間游離氨基酸含量差異達(dá)到顯著水平。結(jié)果表明，花粉在-80℃條件下保存有利于花粉中游離氨基酸總量的保持。

表3 不同貯藏溫度下煙草花粉游離氨基酸總量Table 3 Total amount of free amino acids in tobacco pollen under the different storage temperatures μ mol/mg

2.5 不同貯藏溫度條件下煙草花粉脯氨酸含量差異

脯氨酸與植物的抗寒性密切相關(guān)。由表4可知，以參試品種N. rustica數(shù)據(jù)為例，-80℃貯藏條件下花粉的脯氨酸含量最高（1.626±0.061mg/g），其次是-196℃（1.596±0.076mg/g），但二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異沒有達(dá)到顯著水平；4℃條件下花粉的脯氨酸含量最低（1.328±0.053mg/g），顯著低于-196℃和-80℃貯藏條件下的花粉。這表明，花粉的液氮保存和-80℃保存有利于保持花粉中的脯氨酸含量。

表4 不同貯藏溫度條件下煙草花粉脯氨酸含量Table 4 Proline content of tobacco pollen under the different storage temperatures mg/g

2.6 不同貯藏溫度條件下煙草花粉可溶性蛋白含量差異

可溶性蛋白具有親水膠體的性質(zhì)，能增強(qiáng)細(xì)胞的持水力，因而在低溫脅迫下，植物體內(nèi)可溶性蛋白含量的升高有利于抗冷性的提高[15]。統(tǒng)計(jì)不同貯藏溫度條件下參試煙草品種花粉可溶性蛋白含量差異（表5），以參試品種N. rustica為例進(jìn)行分析，可以看出-196℃和-80℃貯藏條件下花粉的可溶性蛋白含量（分別為55.216±1.615和53.001±1.605mg/g）沒有顯著性差異，但均顯著高于4℃貯藏條件下花粉的可溶性蛋白含量（42.410±2.072mg/g）。這表明，花粉經(jīng)液氮保存和-80℃保存后，花粉中的可溶性蛋白含量顯著升高。

表5 不同貯藏溫度條件下煙草花粉可溶性蛋白含量Table 5 Soluble protein content of tobacco pollen under the different storage temperatures mg/g

2.7 不同貯藏溫度條件下煙草花粉SOD活性差異

SOD是植物體內(nèi)普遍存在的一種清除超氧陰離子自由基的酶，能夠?qū)⒊蹶庪x子自由基催化轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，維持體內(nèi)活性氧代謝平衡，從而保護(hù)膜結(jié)構(gòu)[16]。由表6可知，不同貯藏溫度條件下3種類型煙草花粉SOD活性為-80℃＞-196℃＞4℃，彼此間差異均達(dá)到顯著水平。在-80℃條件下貯藏的煙草花粉SOD活性高于-196℃條件下貯藏的花粉，可能是由于未經(jīng)速凍的花粉在-80℃環(huán)境中降溫時(shí)間長(zhǎng)于液氮-196℃，逆境脅迫導(dǎo)致SOD活性有所上升。4℃貯藏條件下花粉SOD活性最低，可能是因?yàn)橘A藏時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致SOD活性下降。

表6 不同貯藏溫度條件下煙草花粉SOD活性Table 6 Tobacco pollen SOD activity under the different storage temperatures U/g

2.8 不同貯藏溫度條件下煙草花粉MDA含量差異

MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物之一，其濃度在一定程度上代表了膜脂過氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)傷害程度，是最常用的膜脂過氧化指標(biāo)[16]。分析表7中列出的數(shù)據(jù)，以參試品種N. rustica為例，-196℃和-80℃中花粉的MDA含量分別為2.205±0.092和2.250±0.168 μ mol/g，兩者無顯著差異，而4℃條件下花粉的MDA含量為8.134±0.349 μ mol/g，與-196℃和-80℃貯藏條件下的花粉MDA含量呈顯著差異。這一結(jié)果表明煙草花粉于-196℃和-80℃條件下貯藏能夠減少M(fèi)DA的積累。

表7 不同貯藏溫度條件下煙草花粉MDA含量Table 7 MDA content of tobacco pollen at the different storage temperatures μ mol/g

3 討論

低溫貯藏可以有效降低花粉呼吸強(qiáng)度和酶活性，以延緩花粉的衰老進(jìn)程，且溫度越低，花粉保存效果越好[17-18]。隨著貯藏時(shí)間的推移，花粉活力不斷降低，研究花粉低溫貯藏的相關(guān)技術(shù)及機(jī)理特性對(duì)花粉種質(zhì)資源保存、雜交育種等具有重要意義。

在低溫狀態(tài)下，花粉細(xì)胞新陳代謝基本停止[19]，因此，低溫保存成為保持花粉活力行之有效的措施之一[20-21]。趙嬋璞等[22]研究發(fā)現(xiàn)，-80℃貯藏條件可使有斑百合花粉活力保持2年以上。Ganeshan等[5]發(fā)現(xiàn)保存5年的葡萄花粉活力基本不變，但與新鮮花粉相比，其授粉后結(jié)實(shí)能力存在差異。Rajasekharan等[23]對(duì)超低溫保存枸桔花粉的研究結(jié)果表明，超低溫對(duì)花粉活力影響不顯著。有關(guān)花粉在液氮中保存的最長(zhǎng)期限、花粉活力是否隨保存時(shí)間的增加而發(fā)生變化等問題還有待繼續(xù)追蹤檢測(cè)。在本研究中，4℃條件下貯藏的花粉經(jīng)5個(gè)月后已經(jīng)檢測(cè)不到花粉活力，而經(jīng)-196℃和-80℃凍存16個(gè)月的花粉，其活力在貯藏前后無顯著變化。結(jié)果表明，-196℃和-80℃對(duì)煙草花粉的貯藏有利，然而上述條件下，煙草花粉的最長(zhǎng)貯藏時(shí)間還有待繼續(xù)監(jiān)測(cè)。

目前，關(guān)于花粉形態(tài)的研究多集中在花粉形態(tài)特征與親緣關(guān)系相關(guān)性以及植物形態(tài)學(xué)分類上[24-26]，而有關(guān)花粉凍存后形態(tài)變化的研究較少。在本研究中，經(jīng)-196℃和-80℃凍存16個(gè)月后煙草花粉形狀規(guī)則，呈長(zhǎng)橢圓形，內(nèi)含物飽滿，外壁清晰，萌發(fā)溝均勻分布；而經(jīng)4℃冷藏16個(gè)月后的花粉則發(fā)生了明顯的皺縮，萌發(fā)溝扭曲，花粉形狀不規(guī)則。這與花粉活力的測(cè)定結(jié)果相對(duì)應(yīng)，表明-196℃和-80℃對(duì)煙草花粉形態(tài)和活力的保持有利，而4℃冷藏中花粉發(fā)生皺縮、變形和扭曲，很可能是花粉內(nèi)含物（糖、蛋白和氨基酸）經(jīng)代謝消耗的結(jié)果。

細(xì)胞學(xué)和酶學(xué)研究表明，植物種質(zhì)在超低溫條件下遺傳性穩(wěn)定，貯存期較長(zhǎng)[27]。在低溫逆境脅迫條件下，植物體內(nèi)可溶性蛋白和可溶性糖含量提高并維持在一定水平有利于植物抗寒性的提高[15，28-29]。研究[28，30]表明，可溶性蛋白在植物組織受到環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)增加，其親水性極強(qiáng)，能夠增強(qiáng)細(xì)胞的持水力，可以減輕因原生質(zhì)結(jié)冰而造成的細(xì)胞傷害。同樣，可溶性糖含量增加也可提高植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，同時(shí)降低細(xì)胞原生質(zhì)的凝固點(diǎn)，增強(qiáng)抗凍能力，維持細(xì)胞膜在低溫條件下的正常功能。通常情況下，植物體內(nèi)的游離氨基酸維持在一個(gè)較低的水平，而在低溫脅迫下，游離氨基酸大量積累，增加細(xì)胞液濃度，提高原生質(zhì)的保水能力和膠體的穩(wěn)定性[6]。在游離氨基酸中，脯氨酸與植物抗寒性密切相關(guān)。脯氨酸的疏水吡咯環(huán)與蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)結(jié)合，而親水基團(tuán)分布于表面，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的可溶性。在0℃條件下貯存10d的番茄花粉脯氨酸含量明顯提高，而在-196℃溫度下貯存的花粉脯氨酸含量沒有明顯變化[11]。表明在-196℃條件下，細(xì)胞內(nèi)所有代謝活動(dòng)基本停止，從而保持花粉具有較高活力。0℃條件下保存的花粉，其脯氨酸含量明顯增加，這可能是花粉對(duì)低溫的一種適應(yīng)性反應(yīng)，也可能是受害的標(biāo)志[31]。在本研究中，貯藏16個(gè)月后，-196℃和-80℃貯藏條件下的花粉可溶性糖和可溶性蛋白含量差異均不顯著，但都顯著高于4℃條件下的花粉。不同貯藏溫度下煙草花粉游離氨基酸和脯氨酸含量均表現(xiàn)出-80℃＞-196℃＞4℃的規(guī)律，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因初步推測(cè)為低溫凍存的花粉自然解凍時(shí)間較長(zhǎng)，在此過程中生成并積累了游離氨基酸和脯氨酸。該推測(cè)在后續(xù)工作中將設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行探究。

植物遭受低溫傷害時(shí)，細(xì)胞膜產(chǎn)生龜裂，膜的通透性增大，膜結(jié)合酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致植物細(xì)胞生理代謝變化和功能紊亂[30]。SOD對(duì)生物體內(nèi)自由基的清除具有極其重要的意義，通過測(cè)定SOD活性水平高低可檢測(cè)生物體衰老與死亡狀態(tài)特征[32-33]。MDA含量的高低可以在一定程度上代表膜受傷害的程度[16]。在本研究中，不同貯藏條件下煙草花粉SOD活性表現(xiàn)為-80℃＞-196℃＞4℃，而4℃貯藏條件下花粉中MDA含量顯著高于-196℃和-80℃貯藏條件下的花粉。-80℃貯藏條件下花粉中SOD活性高于-196℃貯藏條件下的花粉，主要是由于花粉在-80℃環(huán)境下的降溫過程更長(zhǎng)，導(dǎo)致SOD活性有所上升。而4℃中SOD活性最低，主要是因?yàn)樵撡A藏溫度條件下花粉細(xì)胞生理活動(dòng)仍在繼續(xù)，導(dǎo)致細(xì)胞衰老死亡，表現(xiàn)為SOD活性下降?？偠灾?，與4℃貯藏條件相比，煙草花粉在-196℃和-80℃條件下貯藏能夠保持較強(qiáng)的氧自由基清除能力，有害物質(zhì)的積累相對(duì)較少。

花粉經(jīng)低溫凍存后能否保持其育性，是低溫凍存技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的關(guān)鍵。劉燕等[34]對(duì)梅花花粉進(jìn)行超低溫保存（-196℃），授粉結(jié)果表明超低溫保存后的花粉仍具有授粉結(jié)實(shí)能力，座果率高于新鮮花粉。在煙草方面類似的報(bào)道較少，不同溫度貯藏對(duì)煙草花粉田間授粉質(zhì)量的影響，是下一步需要繼續(xù)研究的內(nèi)容。

4 結(jié)論

煙草花粉在-196℃和-80℃保存16個(gè)月后，仍然保持著高活力，花粉形態(tài)無顯著變化；在4℃保存的花粉在保存5個(gè)月之后喪失活力，花粉粒形態(tài)發(fā)生皺縮和畸形。煙草花粉在-196℃和-80℃條件下保存，其可溶性糖、可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸含量和SOD活性5項(xiàng)指標(biāo)均高于4℃條件下花粉，煙草花粉通過提高細(xì)胞的保水能力、膠體的穩(wěn)定性以及清除氧自由基的能力來應(yīng)對(duì)低溫脅迫。