柳海東 余青蘭 王瑞生 杜德志

（青海大學農(nóng)林科學院/青海省春油菜遺傳改良重點實驗室/國家油菜改良中心青海分中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部春油菜科學觀測實驗站/青海省春油菜工程技術(shù)研究中心，810016，青海西寧）

油菜是世界四大油料作物之一，是我國最主要的油料作物，年種植面積730萬hm2[1]。根據(jù)我國油菜對溫度需求的不同可以分為冬性、半冬性和春性油菜三大生態(tài)類型，春油菜主要分布在甘肅、內(nèi)蒙古、新疆、青海等高海拔、高緯度、無霜期較短的冷涼地區(qū)，年種植面積在66萬hm2左右。我國春油菜區(qū)3種類型[甘藍型B. napusL.，AACC，2n=38；芥菜型油菜B. junceaL.，2n=36；白菜型B.rapa(campestris) L.，2n=20]的油菜都有種植，其中，以甘藍型油菜為主[2-3]。

在作物生產(chǎn)中，有各種生物壓力阻抑著其生長潛力的發(fā)揮，在這些生物壓力中，害蟲嚴重威脅作物生長[4]。油菜整個生育期都有害蟲為害，苗期主要受跳甲（油菜蚤跳甲Psylliodes punctifronsBaly）、油菜黃曲條跳甲[Phyllotreta striolata(F.)]等為害[5]。近年來，隨著油菜種植面積不斷擴大，以及多年來單一使用化學農(nóng)藥防治油菜跳甲，使油菜跳甲對多種殺蟲劑的抗性普遍提高，其發(fā)生與為害越來越嚴重。在南方，跳甲已取代小菜蛾（Plutella xylostellaL.）而上升為蔬菜生產(chǎn)上的頭號害蟲[6]；在春油菜區(qū)，跳甲是油菜苗期常發(fā)性害蟲，主要以油菜蚤跳甲和油菜黃曲條跳甲為主，常造成春油菜大面積減產(chǎn)或毀種重播[7]。鑒于跳甲給油菜、蔬菜生產(chǎn)造成的極大危害，許多學者從生物學、種群動態(tài)及影響因子、空間分布型、植物提取物、天敵和生態(tài)控制等方面對其進行了大量的研究工作。張茂新等[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，黃曲條跳甲在十字花科一季菜生長期內(nèi)與寄主植物生長發(fā)育期密切相關(guān)；在油菜黃曲條跳甲防治方面，目前比較有效的方法是采用生物防治和物理防治，如引入跳甲天敵、輪作、覆地膜、燈光誘殺，根據(jù)黃曲條跳甲趨黃性還可采取黃板誘殺等方法[9-10]。此外，3種植物提取物香茅草精油、香茅草提取液和白千層精油對油菜黃曲條跳甲成蟲具有一定的防效[11]。在黃曲條跳甲種群控制方面，斯氏線蟲可有效控制其幼蟲種群數(shù)量，通過植物次生代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用也可有效控制黃曲條跳甲種群數(shù)量[12-13]。

在作物抗蟲育種中，研究昆蟲的寄主選擇是評價和研究作物抗蟲性的一個重要方法，通過對昆蟲寄主選擇的研究，篩選有效的抗性品種作為抗蟲種質(zhì)資源，可運用于作物抗蟲育種之中；抗蟲因子是指導作物抗蟲育種的重要依據(jù)，在抗蟲因子中，植物營養(yǎng)物質(zhì)的含量和防御酶起著非常重要的保護作用[14-15]，植物在昆蟲的取食迫害下，激發(fā)了體內(nèi)的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）等防御蛋白的產(chǎn)生，它們能夠使昆蟲中毒或者營養(yǎng)失調(diào)，這些防御蛋白含有能夠?qū)ν庠瓷矬w造成傷害的自由基，通過防御蛋白間的相互反饋調(diào)節(jié)使自身自由基保持在正常水平，以此提高自身抗蟲性，減少害蟲的進一步為害[16]。對抗病和易感小麥品種進行蚜蟲侵染誘導，發(fā)現(xiàn)PAL、PPO、POD 3種防御性酶活性在不同小麥品種不同發(fā)育階段都出現(xiàn)不同程度的升高，說明這3種酶在小麥抗蚜蟲上具有一定的潛力[17]；PPO與植物抗蟲性有著密切的關(guān)系，其主要作用機制是：催化酚類物質(zhì)氧化為醌，并將一些必需氨基酸烷基化，醌類物質(zhì)能抑制害蟲的消化系統(tǒng)，使其營養(yǎng)失衡。茉莉酸甲酯模擬蟲害取食甘蔗試驗證明，甘蔗在經(jīng)過誘導處理后，產(chǎn)生了大量的PPO[18]。POD是參與植物應對逆境反應過程的關(guān)鍵酶之一，POD通過與部分酚類物質(zhì)結(jié)合，產(chǎn)生苯氧基和氧自由基，進而直接影響植食性昆蟲的取食，或者產(chǎn)生毒素，降低葉片的營養(yǎng)水平及其可食性[18]。SOD主要功能是將植物中過量的氧原子轉(zhuǎn)化為水，有效控制活性氧的損害，避免或減輕蟲害帶來的損傷，從而提高寄主植物的抗蟲性[19]。PAL在苯丙烷類代謝途徑中起著限速的關(guān)鍵作用，其代謝過程可產(chǎn)生酚類物質(zhì)、木質(zhì)素、植保素和阿魏酸等有毒次生物質(zhì)，這些物質(zhì)對植物的生長發(fā)育和防御病蟲害的攻擊有著重要作用[20]，在大麥中，PAL活性對抗蚜蟲起關(guān)鍵作用[21]。

本試驗通過分析油菜苗期田間跳甲為害指數(shù)及4種防御性酶活性，研究不同油菜品種（系）對跳甲的抗性，從中篩選抗跳甲油菜資源，初步探討油菜抗跳甲機制，為油菜抗跳甲育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試的生態(tài)型油菜品種（系）共42個，其中春性品種（系）38個，半冬性品種4個。供試品種（系）全部由青海大學農(nóng)林科學院春油菜研究所提供，詳見表1。

表1 不同油菜品種（系）及來源Table 1 Ecotypes and sources of different rapeseed varieties (lines)

1.2 田間調(diào)查跳甲為害指數(shù)

采用單因素隨機區(qū)組設計，3次重復。每小區(qū)5行，行長2.5m，行距0.3m，每小區(qū)調(diào)查株數(shù)不少于70株。試驗材料于2017年3月28日、2018年3月30日播種于青海省農(nóng)林科學院試驗地，油菜2葉期調(diào)查跳甲為害情況。苗期不施任何農(nóng)藥，土肥水管理按常規(guī)進行。

參照賀春貴等[22]油菜蚤跳甲的為害分級方法，在油菜2葉期，調(diào)查每小區(qū)中間3行跳甲為害情況。為害情況分4級，分別為0級（未受任何損害）、1級（有損害但未形成穿孔）、2級（有洞或葉片缺失介于1/2～1）和3級（1片以上葉片缺失或心葉缺失）。計算為害指數(shù)，為害指數(shù)=（各級值×相應級的株數(shù)的累計值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級數(shù)）×100%。利用DPS（7.05）軟件進行方差分析、卡方聚類及相關(guān)性分析。

1.3 防御性酶活性檢測

PAL、PPO、POD和SOD活性測試盒均由南京建成科技有限公司生產(chǎn)。4種酶吸光值測定及計算方法按試劑盒說明書進行。在2018年油菜出苗生長至2葉期，在田間調(diào)查為害率的同時取樣。

1.3.1 PAL活性測定 取幼嫩子葉5g，將葉片研磨后按子葉重量（g）∶提取液體積（mL）=1∶9加入45mL提取液，冰水浴勻漿，10 000轉(zhuǎn)/min，4℃離心10min，取上清液待測。

1.3.2 PPO活性測定 取幼嫩子葉5g，將葉片研磨后按子葉重量∶提取液體積（mL）=1∶5加入25mL提取液，冰水浴勻漿，8 000轉(zhuǎn)/min，常溫離心10min，取上清液待測。

1.3.3 POD活性測定 取幼嫩子葉5g，按子葉重量（g）∶勻漿介質(zhì)體積（mL）=1∶9加入45mL勻漿介質(zhì)（磷酸鹽緩沖液：0.1mol/L，pH 7.0～7.4），冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿，3 500轉(zhuǎn)/min，4℃離心10min，取上清液待測。

1.3.4 SOD活性測定 取幼嫩子葉5g，按子葉重量（g）∶生理鹽水體積（mL）=1∶9加入45mL生理鹽水，再剪碎組織，冰水浴制備勻漿，2 500～3 000轉(zhuǎn)/min，4℃離心10min，取上清液待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同油菜品種（系）跳甲為害指數(shù)分析

不同油菜品種（系）跳甲為害指數(shù)的分析結(jié)果（表2）顯示：2017年跳甲為害指數(shù)最低的是青雜2號、青雜12號、嚴小村芥、白芥和大辣芥，為害指數(shù)分別為32.51%、31.65%、35.64%、31.15%和31.00%，與目前春油菜區(qū)主栽品種青雜5號（45.49%）差異極顯著；抗性相對較差的是大黃和青雜7號，為害指數(shù)分別為52.42%和59.29%。2018年對42個油菜品種（系）跳甲為害進行了鑒定，抗性相對較好的有大辣芥、青雜12號、白芥、ZG2017Y和青雜2號，為害指數(shù)分別為25.05%、33.65%、34.00%、35.45%和35.76%，與其余品種（系）為害指數(shù)差異極顯著?？剐暂^差的是144A和39，為害指數(shù)分別為61.06%和54.02%，與其余品種（系）差異極顯著。上述分析結(jié)果表明，青雜2號、青雜12號、白芥和大辣芥在田間苗期具有較強的抗跳甲能力。

表2 不同油菜品種（系）間跳甲為害指數(shù)分析Table 2 Analysis of the hazard index of jumping armor among different rapeseed varieties (lines) %

2.2 不同油菜品種（系）跳甲為害指數(shù)卡方聚類

圖1 2018年不同油菜品種（系）為害指數(shù)卡方距離聚類Fig.1 Chi-square distance clustering for the hazard index of different rapeseed varieties (lines) in 2018

為了進一步分析不同油菜品種（系）抗跳甲差異性，對2018年42個油菜品種（系）的跳甲為害指數(shù)進行卡方聚類分析，結(jié)果（圖1）顯示：在卡方距離為0.41時，42個品種（系）被分為4類；第Ⅰ類包括跳甲為害指數(shù)最高的大黃、青雜7號和青油14號等7個品種（系）；第Ⅱ類包括對照青雜5號，白菜型油菜浩油11號、中雙7號、中雙9號、中雙11號，芥菜型油菜嚴小村芥等28個品種（系）；第Ⅲ類包括144A；第Ⅳ類包括青雜2號、青雜12號、2017ZZY、403R、白芥和大辣芥6個品種（系），這些品種（系）抗跳甲能力強。上述結(jié)果表明，通過跳甲為害指數(shù)卡方距離聚類，可以有效地將不同油菜品種（系）抗跳甲能力區(qū)分開來，其中青雜2號、青雜12號、2017ZZY、403R、白芥、大辣芥6個品種（系）抗跳甲能力最強。

2.3 2018年4種主要防御酶活性

42個油菜品種（系）苗期的PAL活性見圖2，甘藍型油菜青雜2號、青雜12號和芥菜型油菜白芥、大辣芥PAL活性介于20.00～23.00U/g，在所有品種（系）中最高，其中PAL活性最高的為青雜12號（22.75U/g）。甘藍型油菜杜4695和白菜型青油21號PAL活性高于春油菜區(qū)主栽品種青雜5號（圖 2a）。

PPO活性測定結(jié)果（圖2b）顯示，青雜12號、嚴小村芥、白芥和大辣芥PPO活性達到120.00～128.00U/g，顯著高于其他品種（系），其中白芥和大辣芥PPO活性分別達到125.41和127.61U/g。此外，還有10個品種（系）PPO活性介于70.00～110.00U/g，高于春油菜區(qū)主栽品種青雜5號，在這些品種（系）中，只有2017ZZY為白菜型油菜，其余9個全為甘藍型油菜（圖2b）。

由POD活性測定結(jié)果（圖2c）可知，42個品種（系）中有27個高于青雜5號，其中青雜2號、青雜12號、白芥和大辣芥POD活性達120.00～130.00U/g，顯著高于春油菜區(qū)主栽品種青雜5號POD活性（95.00U/g），青雜12號最高（128.86U/g），比青雜5號高35.6%。

SOD活性測定結(jié)果（圖2d）顯示，青雜12號、白芥和大辣芥活性較高，分別為2 163.99、2 024.24和2 098.23U/g，顯著高于其他品種（系）；此外，還有25個品種（系）SOD活性介于1 800.00～2 000.00 U/g，與春油菜區(qū)主栽品種青雜5號達到顯著水平。

從以上結(jié)果可以看出，甘藍型油菜青雜12號、芥菜型油菜白芥和大辣芥苗期4種防御性酶活性在所有供試材料中最高，在抗跳甲育種中，可以重點考慮用這3個材料作為選育親本。

2.4 4種主要防御酶活性與跳甲為害指數(shù)相關(guān)性分析

圖2 2018年不同油菜品種（系）苗期4種防御性酶活性檢測結(jié)果Fig.2 The results of four defense enzyme activities in different rapeseed varieties (lines) at seedling stage in 2018

從42份不同甘藍型油菜品種（系）2018年跳甲為害指數(shù)與4種主要防御酶活性相關(guān)性分析（表3）可知，2018年跳甲為害指數(shù)與4種主要防御酶活性呈極顯著負相關(guān)，4種主要防御酶活性之間呈極顯著正相關(guān)。以上相關(guān)性結(jié)果表明，油菜苗期防御性酶活性與跳甲為害程度是相互抑制的，而主要防御酶活性之間是互相促進的作用。

3 討論

目前，跳甲對油菜苗期的為害程度衡量指標最常用的是田間為害指數(shù)。本研究通過對42個油菜品種（系）田間跳甲為害指數(shù)和4種主要防御酶活性檢測，從跳甲為害指數(shù)田間調(diào)查結(jié)果可以看出，青雜2號、青雜12號、嚴小村芥、白芥和大辣芥在2年中跳甲為害指數(shù)都在30.00%左右，與其他品種（系）相比都較低；甘藍型油菜跳甲為害指數(shù)顯著高于白菜型油菜和芥菜型油菜，而芥菜型油菜為害指數(shù)最低，主要原因可能有以下幾個方面：一是本研究選用的甘藍型油菜均為雙低品種（系），而白菜型和芥菜型均為雙高品種（系），甘藍型品種芥酸、硫甙含量較低，口感好，跳甲喜食；二是甘藍型油菜品種（系）與其他兩種類型相比，防御性酶活性較高的品種（系）為害指數(shù)較低；此外，油菜葉片刺毛對跳甲可能具有一定的防御作用，本研究所選用的幾個白菜型油菜和芥菜型油菜品種（系）葉表面刺毛多于甘藍型油菜品種（系）。

表3 2018年供試材料4種防御酶活性與為害指數(shù)相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficient between hazard index and the activities of four defense enzymes in 2018

植食性昆蟲首先是通過視覺和嗅覺尋找合適的植物，并成功定位植物，再開始取食植物組織獲得營養(yǎng)物質(zhì)滿足自身發(fā)育[23]。昆蟲對植物的侵害是一種依附生存，昆蟲需要從植物體內(nèi)汲取營養(yǎng)物質(zhì)，比如一些糖類和蛋白質(zhì)，來維持自身的生長發(fā)育，而植物為防御受到侵害通過調(diào)節(jié)自身營養(yǎng)物質(zhì)含量來改變昆蟲對寄主植物的選擇，植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的含量往往與抗蟲性有很大關(guān)系，尤其是一些可溶性糖和可溶性蛋白含量與抗蟲性有很大關(guān)系[14，24]。化學殺蟲劑的使用在保護作物生長的同時也帶來一系列副作用，因此，從植物與昆蟲的關(guān)系著手，研究植物的抗蟲機制，對防治害蟲有一定的幫助。同時，鑒定和篩選一些抗蟲基因型，利用植物固有能力來抵御害蟲侵害，減少實際生產(chǎn)中化學農(nóng)藥的使用。

防御酶PAL、PPO、POD和SOD是寄主植物防御害蟲的主要生化指標，在植物抗病和抗蟲中起著重要的作用。PAL是目前研究最多的防御性酶之一，主要原因是當植物受到外界刺激時，其在特定組織中的PAL含量會在短時間內(nèi)發(fā)生顯著波動。在高等植物中，PAL是苯丙基代謝的第一酶，對調(diào)節(jié)植物酚類物質(zhì)的積累發(fā)揮著重要的作用，而酚類物質(zhì)在植物抗病中的作用已經(jīng)被證實[25]。POD和SOD是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的主要酶，逆境條件下植物體內(nèi)自由基會增多，導致植物體膜的結(jié)構(gòu)和透性發(fā)生改變，POD和SOD能通過彼此調(diào)節(jié)作用維持植物體內(nèi)自由基的平衡，從而減輕逆境對植物的傷害[19]。PPO是植物形成抗菌物質(zhì)的主要酶，可以促進植物形成木質(zhì)素，有利于修復損傷的細胞壁形成防御壁[26]。

也有研究表明，油菜中防御性酶PPO和SOD的活性與油菜對黃寬條跳甲抗性關(guān)系不明顯[14]，但通過對水稻抗蟲性研究表明，植物在受到害蟲迫害時，這4種防御酶活性升高[26-27]。本研究結(jié)果也顯示不同抗性油菜品種（系）間PAL、PPO、POD和SOD活性差異明顯，并且不同油菜品種（系）跳甲為害指數(shù)與4種防御酶活性呈極顯著負相關(guān)，說明抗跳甲能力越強的品種（系）這4種酶活性越強。從本研究結(jié)果可以看出，甘藍型油菜青雜12號、芥菜型油菜大辣芥和白芥2年大田鑒定中跳甲為害指數(shù)最低，苗期4種防御性酶活性最高，是抗跳甲育種的理想材料。前期研究結(jié)果表明，芥菜型油菜跳甲抗性顯著高于甘藍型和白菜型[28]，本研究中共有6個芥菜型參試材料，其中有4個材料的跳甲為害指數(shù)顯著低于大多數(shù)甘藍型和白菜型品種（系），4種防御酶活性也高于其他供試品種（系），進一步說明芥菜型油菜具有較強的抗跳甲能力。此外，目前研究中4種防御酶活性之間也呈極顯著正相關(guān)，這4種酶之間如何相互影響和互作機制目前尚不清楚，還需進一步研究。

4 結(jié)論

通過對42個油菜品種（系）田間跳甲為害指數(shù)分析及4種防御性酶活性檢測，篩選出春油菜區(qū)抗跳甲能力最強的品種為甘藍型油菜品種青雜12號、芥菜型油菜品種大辣芥和白芥，這3個品種可以作為后期抗跳甲新品種選育的親本。同時得出，芥菜型油菜抗跳甲能力較強。