趙訓(xùn)超 徐晶宇 蓋勝男 魏玉磊 許曉萱 丁 冬 劉 夢(mèng) 張今杰 邵文靜

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院/黑龍江省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)栽培技術(shù)與作物種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，163319，黑龍江大慶）

高粱[Sorghum bicolor(L.) Moench]屬于禾本科一年生草本植物，具有很高的光合效率。高粱可以食用、飼用，還可作為工業(yè)原料；高粱籽粒中含有較高的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪酸等[1-2]。高粱是重要的釀酒原料[3-5]。高粱籽粒中脂肪酸可以豐富酒體的香味，其中脂肪酸包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，高粱脂肪酸中不飽和脂肪酸含量在82%左右，不飽和脂肪酸對(duì)人體非常有益[5]。硬脂酰-ACP脫氫酶（SAD）是催化飽和脂肪酸形成不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶，使細(xì)胞膜的流動(dòng)性增強(qiáng)，進(jìn)而可提高農(nóng)作物抗逆能力。因此，對(duì)SAD基因家族的研究有助于提高植物的抗逆能力。

不飽和脂肪酸主要包括油酸、亞油酸和亞麻酸等。高粱不飽和脂肪酸中油酸含量在30%左右，亞油酸和亞麻酸含量在50%左右[5]。油酸是植物和動(dòng)物生物膜中甘油磷脂的主要成分，并且是合成亞油酸的前體，是決定脂肪酸不飽和程度的關(guān)鍵[6]。在植物中，脂肪酸的從頭合成途徑主要發(fā)生在質(zhì)體中，該過(guò)程使用乙酰輔酶A作為底物，并依賴(lài)酰基載體蛋白（ACP）的參與[7]。在脂肪酸合酶復(fù)合物（FAS）的催化下，丙二酰輔酶A與ACP結(jié)合，酰基鏈每個(gè)循環(huán)經(jīng)歷2個(gè)碳原子形式的連續(xù)縮合反應(yīng)，產(chǎn)生 16∶0-ACP和 18∶0-ACP[8]。SAD 催化18∶0-ACP在Δ9位置去飽和作用形成18∶1-ACP，這是調(diào)節(jié)細(xì)胞中不飽和脂肪酸水平的關(guān)鍵步驟[9]。催化得到的18∶1-ACP可以進(jìn)入原核甘油脂途徑，或被水解成游離脂肪酸并輸出到胞質(zhì)溶膠中，進(jìn)而活化成脂酰輔酶A用于三?；视停═AG）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的磷脂合成[10]。

SAD通過(guò)在C9和C10位置插入雙鍵催化飽和脂肪酸脫氫生成不飽和脂肪酸。目前，在擬南芥[11]、大豆[12]、花生[13]、蕓苔[14]、油菜[15]、黃瓜[16]等均克隆到SAD基因。有報(bào)道顯示，不同物種中SAD基因家族在不同發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)量有極大的不同[17-18]。前人[19-20]研究表明，擬南芥和向日葵突變體缺乏SAD基因時(shí)，在擬南芥葉片和向日葵籽粒中均具有較高硬脂酸含量。將馬鈴薯中的SAD基因轉(zhuǎn)入煙草中，同樣發(fā)現(xiàn)葉片和種子中的不飽和脂肪酸含量有明顯增加[21]。在大豆中已鑒定出GmSAD2的3個(gè)等位基因，在發(fā)育中的種子中檢測(cè)到最豐富的GmSADA（Glyma07g32850）和GmSADB（Glyma02g15600）的轉(zhuǎn)錄物；然而，GmSADA和GmSADB之間轉(zhuǎn)錄本豐度的差異并不顯著[22]。前人報(bào)道，增加SAD的表達(dá)可以在一定程度上提高植物的抗凍性[23-24]；轉(zhuǎn)基因煙草SAD基因過(guò)表達(dá)，使硬脂酸（18∶0）被催化為油酸（18∶1），進(jìn)一步產(chǎn)生多不飽和脂肪酸，隨著多不飽和脂肪酸含量的增加，轉(zhuǎn)基因煙草及其種子的抗寒性提高[25]。在38℃熱脅迫條件下，黃瓜SAD基因表達(dá)大部分受到抑制，特別是熱處理6h后，觀察到SAD基因表達(dá)明顯受抑制[26]。

目前，SAD基因家族已在擬南芥、水稻、可可等作物中被鑒定。本研究對(duì)SbSAD基因家族進(jìn)行鑒定并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)SbSAD基因家族蛋白特性、進(jìn)化關(guān)系、不同發(fā)育階段表達(dá)、染色體定位、保守基序、二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)及對(duì)啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析，為進(jìn)一步克隆和鑒定SbSADs基因的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

2018年10月，在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生物技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行SbSAD基因家族的篩選及相關(guān)分析。

1.2 SbSADs基因的鑒定

擬南芥SADs基因序列數(shù)據(jù)來(lái)自TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.arabidopsis.org/），為鑒定候選的高粱SADs基因，使用模式植物擬南芥蛋白質(zhì)序列分別在 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#）中進(jìn)行Blastp序列比對(duì)，選取E＜e-10，氨基酸數(shù)大于200的序列。利用Pfam（http：//pfam.xfam.org/）進(jìn)一步確定高粱的候選基因。

1.3 SbSADs蛋白的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域分析

利用在線(xiàn)軟件分析SbSADs蛋白性質(zhì)Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）；利用MEME（http：//meme-suite.org/）分析SbSADs基因的保守基序。

1.4 SbSADs系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與高粱不同發(fā)育階段SbSADs表達(dá)量分析

利用MAGE 7.0軟件對(duì)高粱、玉米、水稻和擬南芥的SADs蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，利用鄰接算法且Bootstrap重復(fù)設(shè)置為1000。利用Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#）數(shù)據(jù)庫(kù)篩選高粱不同發(fā)育階段SbSADs表達(dá)量數(shù)據(jù)，表達(dá)量用每百萬(wàn)測(cè)得序列中比對(duì)到某一基因每千堿基長(zhǎng)度的片段數(shù)目（fragments per kilobase per million reads，F(xiàn)PKM）表示。

1.5 SbSADs基因的結(jié)構(gòu)與染色體定位分析

利用 GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）在線(xiàn)軟件分析SbSADs基因結(jié)構(gòu)；利用RCircos軟件繪制SbSADs基因在染色體上的位置圖譜。

1.6 SbSADs蛋白結(jié)構(gòu)與SbSADs啟動(dòng)子順式元件分析

利用 NPSA-PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線(xiàn)網(wǎng)站預(yù)測(cè)SbSADs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Swiss Model（http：//swissmodel.expasy.org/）在線(xiàn)網(wǎng)站預(yù)測(cè)SbSADs蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)?；蛏嫌? 000bp的啟動(dòng)子序列來(lái)自Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)，將其提交到Place（https：//sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?lang=en&pj=640&ac tion=page&page=newplace）網(wǎng)站進(jìn)行逆境相關(guān)的順式元件分析。

1.7 SbSADs在種子發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

從NCBI SRA（Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得SbSADs基因在種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量。將高粱BTx623種植在溫室（28℃白天/26℃夜晚，10h光周期），選取發(fā)育5和10d的種子并迅速在液氮中冷凍，提取種子總RNA，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在NCBI中的登錄號(hào)為SRP008505和SRP008469。

2 結(jié)果與分析

2.1 SbSAD基因家族蛋白特性分析

以擬南芥蛋白序列作為比對(duì)序列進(jìn)行同源序列比對(duì)，共鑒定出11個(gè)SbSADs基因。表1顯示，SbSADs的編碼區(qū)為 1 134～1 290bp；SbSADs蛋白的氨基酸數(shù)為377～449；在SbSAD基因家族中，分子量最大為48.0kDa，最小為39.8kDa；等電點(diǎn)為5.26～8.76。

表1 高粱SbSADs蛋白特性分析Table 1 Analysis of protein characterization of SbSADs in sorghum

2.2 SbSAD基因家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及高粱不同發(fā)育階段SbSADs表達(dá)量分析

為明確SbSAD基因家族蛋白進(jìn)化關(guān)系，選取擬南芥、水稻、玉米和高粱SAD蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖1可知，根據(jù)植物的單子葉和雙子葉親緣關(guān)系對(duì)SbSADs進(jìn)行分類(lèi)，11個(gè)SbSADs被分為3個(gè)亞族，其中亞族I含有水稻、高粱和玉米3個(gè)物種SADs；亞族II僅含有擬南芥SADs；亞族III含有水稻、高粱和玉米3個(gè)物種SADs；由此表明，SbSADs與單子葉植物玉米和水稻存在著密切的同源關(guān)系。

圖1 水稻、玉米、擬南芥和高粱SADs蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系Fig.1 Phylogenetic relationships of SAD proteins from rice, maize, Arabidopsis and sorghum

另外，利用高粱不同發(fā)育階段SbSADs的表達(dá)情況來(lái)進(jìn)一步表征SbSADs系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。圖2為SbSAD6和SbSAD9在高粱的不同發(fā)育階段的表達(dá)情況；其中SbSAD9在開(kāi)花期和幼嫩期的表達(dá)量較高，SbSAD6在成熟期比在開(kāi)花期表達(dá)量高。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與不同組織部位發(fā)育階段SbSADs的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明，亞族I基因在不同發(fā)育階段均有表達(dá)（圖2）。

圖2 SbSAD基因家族在高粱不同發(fā)育階段不同組織中的表達(dá)量Fig.2 The expression profile of SbSADs gene family at different developmental stages and tissues in sorghum

2.3 SbSADs基因結(jié)構(gòu)分析

利用 GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）在線(xiàn)軟件分析SbSAD基因家族內(nèi)含子和外顯子的數(shù)目，結(jié)果如圖3所示，在SbSAD基因家族中，SbSAD8的外顯子數(shù)最多，含有6個(gè)外顯子；SbSAD2、SbSAD4和SbSAD11均僅含有1個(gè)外顯子；其他基因含有2～3個(gè)外顯子。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，SbSAD6和SbSAD9的基因結(jié)構(gòu)高度相似，表明SbSAD基因家族在每個(gè)亞族相對(duì)保守。

圖3 高粱SbSAD基因家族結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Genetic structure analysis of SbSAD gene family in sorghum

2.4 SbSADs蛋白保守基序分析

利用MEME（http：//meme-suite.org/）在線(xiàn)分析軟件預(yù)測(cè)SbSADs蛋白的保守基序，如圖4所示，共鑒定到10個(gè)保守基序，其中SbSAD5、SbSAD6、SbSAD7和SbSAD9含有保守基序最多，含有10個(gè)保守基序；SbSAD8含有保守基序最少，僅含有3個(gè)保守基序；其余SbSADs含有8～9個(gè)保守基序。由此表明，SbSADs中保守基序相似度較高，同源關(guān)系較近，功能相對(duì)保守。

圖4 SbSADs蛋白保守基序分析Fig.4 Conserved motif analysis of SbSADs protein

2.5 SbSAD基因家族染色體定位分析

SbSAD基因家族染色體定位如圖5所示，SbSAD基因家族不均勻地分布在高粱的7條染色體上，SbSAD基因家族在高粱1號(hào)染色體上定位最多，含有SbSAD1、SbSAD2和SbSAD3基因；SbSAD4、SbSAD9、SbSAD10和SbSAD11分別定位在高粱2、6、7和10號(hào)染色體上；SbSAD5和SbSAD6定位在高粱3號(hào)染色體上；SbSAD7和SbSAD8定位在高粱4號(hào)染色體上；其中SbSAD5和SbSAD6基因及SbSAD7和SbSAD8基因在高粱染色體上位置相近。

2.6 SbSADs蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)SbSADs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸數(shù)目進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，氨基酸α-螺旋比例介于40.58%～59.27%，無(wú)規(guī)則卷曲比例介于22.68%～38.73%，延長(zhǎng)鏈的比例在7.56%～14.32%，β-折疊的比例為6.37%～12.03%。由此可知，SbSADs蛋白均以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)（表2，圖6A）。對(duì)SbSADs蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析顯示，除SbSAD8外，其余SbSADs的蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似（圖6B）。

圖5 SbSADs基因的染色體分布Fig.5 Chromosomal location of SbSADs

表2 SbSADs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)目和比例Table 2 Amino acid number and percentage of secondary structure of SbSADs protein

2.7 SbSADs啟動(dòng)子與逆境相關(guān)順式作用元件分析

圖6 SbSADs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(B)的預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.6 Prediction results of secondary structure (A) and tertiary structure (B) of SbSADs protein

溫度脅迫影響植物細(xì)胞膜的流動(dòng)性，當(dāng)植物遭受低溫時(shí)，細(xì)胞膜流動(dòng)性升高，抗寒能力增強(qiáng)；當(dāng)植物遭受高溫時(shí)，細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低。在SbSADs啟動(dòng)子區(qū)查找有關(guān)低溫和高溫等非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件并進(jìn)行分析。在SbSAD基因家族中，當(dāng)植物遭受低溫脅迫時(shí)，SbSADs基因的順式作用元件數(shù)量均較多；與其他基因相比，SbSAD1、SbSAD2、SbSAD5和SbSAD9順式作用元件數(shù)量較多；而當(dāng)植物遭受高溫脅迫時(shí)，SbSADs基因的順式作用元件數(shù)量均較少；與其他基因相比，SbSAD3和SbSAD10順式作用元件數(shù)較多（圖 7）。

圖7 SbSADs基因啟動(dòng)子逆境相關(guān)順式作用元件數(shù)量分布Fig.7 Distribution of cis-elements in SbSADs gene promoters

2.8 SbSADs在高粱種子發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析

高粱籽粒中有較高含量的脂肪酸，其中不飽和脂肪酸含量占脂肪酸含量的82%左右。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得高粱種子發(fā)育時(shí)期SbSADs表達(dá)量數(shù)據(jù)，探究高粱種子發(fā)育時(shí)期SbSADs表達(dá)情況。如圖8所示，從種子發(fā)育時(shí)期SbSADs的表達(dá)量數(shù)據(jù)中共發(fā)現(xiàn)4個(gè)SbSADs基因表達(dá)，其中SbSAD1和SbSAD5在種子發(fā)育5d時(shí)表達(dá)量較高；在種子發(fā)育10d時(shí)僅有SbSAD5有較高的表達(dá)量，其余基因表達(dá)量均較低。綜上表明，SbSAD5在種子發(fā)育時(shí)期有較高的表達(dá)量。

圖8 SbSADs在種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)Fig.8 Expression of SbSADs gene at different development days of seeds

3 討論

目前，高等植物中SAD是唯一確定的可溶性脂肪酸脫氫酶，高粱SAD將硬脂酸脫氫插入1個(gè)雙鍵，生成油酸，油酸是形成多不飽和脂肪酸的前體，決定多不飽和脂肪酸的含量[16，27]。SAD基因家族已在玉米[28]、棉花[29]等多種作物中報(bào)道。至今SbSAD基因家族仍未有報(bào)道，因此本研究對(duì)SbSAD基因家族進(jìn)行鑒定及生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步研究SbSADs功能提供理論基礎(chǔ)。

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，SbSAD基因家族被分為3個(gè)亞族，亞族I僅含SbSAD6和SbSAD9基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)SbSAD6和SbSAD9在高粱不同發(fā)育階段有表達(dá)。前人研究發(fā)現(xiàn)，在玉米中SAD基因家族被分為2個(gè)亞族，其中1個(gè)亞族在玉米不同發(fā)育階段表達(dá)量較高[28]；在棉花SAD基因家族中發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)亞族在不同階段的表達(dá)量也均較高，并且其中1個(gè)亞族基因在棉花中扮演重要角色[29]。本研究與前人的研究結(jié)果一致，表明SbSAD6和SbSAD9在高粱不同發(fā)育階段以及合成油酸過(guò)程中扮演重要角色。

SAD基因家族參與細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的合成，同時(shí)影響細(xì)胞膜流動(dòng)性及其耐受能力。前人研究表明，缺失SAD基因的擬南芥突變體在葉片中含有較高的硬脂酸[19]；在擬南芥中，AtSSI2在調(diào)節(jié)擬南芥葉片中油酸（18∶1）含量方面扮演重要角色[11]；在玉米中，當(dāng)ZmSAD基因表達(dá)下調(diào)時(shí)，會(huì)增加玉米葉片中硬脂酸的含量[30]；在擬南芥中SAD基因家族已被鑒定并進(jìn)行活性分析，發(fā)現(xiàn)在SAD基因家族中，僅有1個(gè)AtSAD基因活性較高[11]。本研究通過(guò)分析SbSAD基因家族在高粱不同組織部位發(fā)育階段的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)SbSAD6和SbSAD9在高粱不同發(fā)育階段均有表達(dá)，由此可知SbSAD6和SbSAD9基因在高粱組織發(fā)育階段扮演重要角色。

4 結(jié)論

本研究共鑒定到11個(gè)SbSADs基因。對(duì)SbSAD基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SbSAD6和SbSAD9在高粱發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。