王沙沙，王芳，張涵，侯飛俠，國錦琳

成都中醫(yī)藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與 開發(fā)利用國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

近年來，由于分子鑒定具有準確性高、重現(xiàn)性好等特點，且不受樣品形態(tài)特征、發(fā)育階段、環(huán)境差異等影響的限制，在中藥鑒定領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。《中華人民共和國藥典》已經(jīng)收錄了蘄蛇等藥材的DNA分子鑒定新方法[1]。同時市場需求也推動了DNA分子鑒定的發(fā)展，特別是在快速鑒定真?zhèn)畏矫?，DNA 提取效率成為中藥分子快速鑒定廣泛推廣和應(yīng)用的關(guān)鍵。目前，提取中藥材DNA常用的方法有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[2]、十二烷基硫酸鈉(SDS)法[3]、試劑盒法、高鹽低pH法[4]，以上方法均需用到苯酚、三氯甲烷、異戊醇等有毒的試劑，且操作過程繁瑣、耗時長，無法滿足中藥材快速分子鑒定的要求。

為了達到快速提取DNA的目的，近年來堿裂解法被廣泛應(yīng)用[5]。堿裂解法是一種可以快速提取DNA的有效方法，已被應(yīng)用于中藥生品、炒制品[6]和蟲草DNA[7]的提取。雖然該方法在10 min之內(nèi)就可獲得DNA，但仍需要離心機等專用設(shè)備。2017年報道的濾紙法[8]經(jīng)裂解液裂解動植物、微生物細胞釋放核酸、濾紙吸附核酸、清洗液去除雜質(zhì)、洗脫液洗脫核酸等步驟獲得DNA。該方法可在30 s內(nèi)快速完成DNA的提取和純化，不需要使用有毒試劑和離心機，具有成本低、操作簡單、省時等優(yōu)點。目前還未見使用濾紙法提取中藥材的報道。本實驗研究了不同孔徑的濾紙對DNA提取的影響，提取了不同來源中藥材DNA，探索濾紙法提取中藥材DNA的適應(yīng)性，開發(fā)了一種新型快速的中藥材 DNA提取方法，為中藥材分子鑒定現(xiàn)場運用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

T100TMThermal CyclerPCR擴增儀、GELDOCEQ凝膠成像儀[伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司]；DYY-III-12B核酸電泳儀(北京六一儀器廠)；ND2000微量核酸蛋白測定儀(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 試藥

三羥甲基氨基甲烷[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]；核酸染料(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；瓊脂糖、2×TaqPCR master mix、DL2000 marker、TIANGEN Plant Genmic DNA Kit[天根生化科技(北京)有限公司]；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉、吐溫-20(Tween-20)、三氯甲烷、石蠟均購自成都市科龍化工試劑廠。Whatman 雙圈定性快速濾紙(孔徑80～120 μm)、慢速濾紙(孔徑1～3 μm)；新星定性快速濾紙(孔徑20～25 μm)、慢速濾紙(孔徑10～15 μm)。

33種藥材分別收集于成都中醫(yī)藥大學藥材標本館、成都荷花池中藥材市場及甘孜州康定縣，所有樣品均由成都中醫(yī)藥大學萬德光教授鑒定，憑證標本保存于成都中醫(yī)藥大學中藥材標準化教育部重點實驗室。樣品信息具體見表1。

表1 樣品信息

注：+表示PCR擴增成功，-表示擴增不成功。

2 方法

2.1 濾紙法提取DNA

2.1.1濾紙條的制備 濾紙滅菌烘干后，將濾紙剪裁成長44 mm，寬約2 mm條狀；將該濾紙條長的40 mm浸泡在熔化的石蠟中，另外4 mm不經(jīng)過石蠟處理，最后制成由2 mm× 40 mm蠟浸漬的疏水區(qū)和2 mm×4 mm的核酸結(jié)合區(qū)構(gòu)成的濾紙條備用。

2.1.2DNA 提取 樣品用研缽研磨成粉末后(難磨碎樣品可加液氮)，取50 mg左右迅速轉(zhuǎn)移至500 μL裂解液[20 mmol·L-1Tris(pH 8.0)，25 mmol·L-1NaCl，2.5 mmol·L-1EDTA，0.05% SDS]中，渦旋混勻8 s左右。將制作好的4種不同濾紙的濾紙條核酸結(jié)合區(qū)浸入到粗提液中以結(jié)合核酸，共3次，每次大約3 s。然后，將濾紙條再浸入到1 mL清洗液中[10 mmol·L-1Tris(pH 8.0)，0.1% Tween-20]以去掉雜質(zhì)，清洗3次，每次約3 s，最后把濾紙條浸入到24 μL 滅菌雙蒸水中以洗脫核酸，共3次，每次約3 s，洗脫液作為模板進行后續(xù)的PCR擴增。

2.2 試劑盒提取DNA

按照TIANGEN Plant Genmic DNA Kit操作說明書進行。

2.3 DNA質(zhì)量分析和電泳檢測

提取的DNA樣品在微量核酸蛋白測定儀上測定樣品的濃度和A260/A280，并采用SPSS 17.0軟件對DNA的濃度和A260/A280進行單因素方差分析。試劑盒提取的樣品取5 μL加1 μL 6×Loading buffer，1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察并保存。

2.4 PCR擴增及電泳

植物類藥材采用ITS2通用引物[9](ITS2F/ITS3R)；動物類藥材除海馬外采用COI通用引物[10](LCO1490/HCO2198)；海馬藥材采用魚類COI通用引物[11](FishF2_t1/VF2_t1、FishR2_t1/FR1d_t1)；真菌類藥材采用真菌ITS通用引物[12](ITS4/ITS5)。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中2×TaqPCR master mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL(25 μmol·L-1)(海馬上下游引物各0.5 μL)，模板DNA 1 μL，滅菌雙蒸水補足至25 μL?？瞻讓φ找詼缇p蒸水代替模板DNA。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴增產(chǎn)物用 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察并保存。本實驗中所用引物和PCR擴增程序見表2，引物由英濰捷基(上海)有份有限責任公司合成，選擇聚丙烯酰胺-凝膠電泳(PAGE)純化。

2.5 PCR擴增效率及測序分析

對擴增成功的樣品進行統(tǒng)計。將成功擴增的PCR產(chǎn)物委托英濰捷基(上海)股份有限責任公司進行序列測定，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，進行相似性比對分析，核實所得產(chǎn)物是否為藥材目標序列。

3 結(jié)果

3.1 不同孔徑濾紙對DNA提取的影響

3.1.1DNA提取的濃度及純度分析 使用1.2項下的4種濾紙對黃柏、紅花、密蒙花、川射干、槐花、金銀花、洋金花、大血藤、太子參9個植物藥進行DNA提取，對樣品的DNA純度及濃度分析，結(jié)果表明，Whatman慢速和新星慢速濾紙?zhí)崛舛认嗖畈淮?，Whatman 快速濾紙的提取濃度和純度最低。但Whatman慢速濾紙的提取濃度是四者中最高的，隨著孔徑的增加，DNA濃度和均純度變低，詳見表3。

表2 PCR擴增引物和程序

表3 不同濾紙?zhí)崛〉腄NA質(zhì)量濃度及純度

3.1.2不同孔徑的濾紙對DNA提取的擴增效率分析 對3.1.1所提取的9個植物藥DNA進行ITS2擴增，研究表明，同一廠家不同孔徑的濾紙擴增效率不同，慢速均比快速濾紙的PCR 擴增效率更高?？讖皆?～3 μm的Whatman慢速濾紙?zhí)崛NA的擴增效率最高，成功擴增7個樣品。結(jié)果見圖1。

3.2 濾紙法提取中藥材DNA的濃度及純度分析

通過本研究3.1項下的結(jié)果可知，Whatman慢速濾紙的提取效果最好，故選擇該種濾紙對所有樣品進行DNA提取和擴增，分別對DNA濃度和純度進行分析。研究表明濾紙法提取的DNA平均質(zhì)量濃度45.42 ng·μL-1，A260/A280為1.61。DNA濃度由大到小為：果實>真菌類>葉類>全草>花類>動物類>根及根莖>皮類，詳見表4。

3.3 濾紙法提取中藥材DNA的PCR擴增效率分析

對Whatman慢速濾紙所提的樣品DNA進行PCR擴增。PCR擴增引物及程序見表2，PCR擴增結(jié)果見表1。利用濾紙法，33種藥材中27種藥材PCR擴增成功，成功率達到81.8%。其中植物類藥材成功20種，占據(jù)植物藥的76.9%，動物類藥材成功7種，占動物藥總數(shù)的100%。PCR擴增結(jié)果見圖2。

3.4 PCR測序結(jié)果分析

PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，序列與原藥材序列相似度達到99%，表明擴增的均是該藥材的序列，說明濾紙法提取到的DNA可成功用于藥材的分子鑒定。

注：A.Whatman 快速濾紙；B.Whatman慢速濾紙；C.新星快速濾紙；D.新星慢速濾紙；M.DL2000 Maker；CK.陰性；1.黃柏；2.紅花；3.密蒙花；4.槐花；5.川射干；6.金銀花；7.洋金花；8.大血藤；9.太子參。圖1 4種濾紙的PCR擴增結(jié)果

表4 Whatman慢速濾紙?zhí)崛〉牟煌N類藥材 DNA濃度及純度

3.5 濾紙法對樣品的選擇性分析

實驗結(jié)果表明，除濾紙孔徑大小對DNA提取效果有影響外，藥材本身的入藥部位對結(jié)果也有影響：5個花類、4個果實類、2個全草類、3個葉子類和7個動物類藥材，PCR擴增均成功；9個根莖類藥材6個擴增成功；3個皮類藥材擴增均失敗。總體擴增效率來看，真菌類、動物藥>植物藥，以上結(jié)果表明，濾紙法對花類、葉子類、全草類、果實類及動物類藥材具有良好的提取效果，可以提取部分根及根莖，但是對于皮類藥材的DNA提取效果不佳。

注：M.DL2000 marker；CK.陰性對照；1.連翹；2.番瀉葉；3.大青葉；4.太子參；5.甘草；6.麻黃；7.金銀花；8.密蒙花；9.大血藤；10.廣藿香；11.槐米；12.洋金花；13.槐花；14.南沙參；15.淫羊藿；16.黃芪；17.蒼耳；18.蓮子心；19.紅花；20.藁本；21.金錢白花蛇；22.僵蠶；23.海盤車；24.刺猬皮；25.冬蟲夏草；26.大海馬；27.刺海馬。圖2 Whatman慢速濾紙的PCR擴增結(jié)果

3.6 濾紙法未擴增成功的原因分析

對于本研究中未成功的6種植物藥，采用試劑盒法提取其DNA，測定DNA濃度和純度，PCR擴增其ITS2序列。結(jié)果顯示試劑盒提取的DNA質(zhì)量濃度為(15.92±0.75) ng·μL-1，純度為(1.76±0.14)。DNA提取和PCR結(jié)果見圖3，DNA提取均未檢測到條帶，PCR擴增僅合歡皮擴增成功。濾紙法未擴增成功的大部分樣品，試劑盒也并未擴增成功，且試劑盒提取的濃度也較低，分析失敗的原因是樣品本身存放時間久，DNA降解嚴重。

注：A.DNA電泳；B.PCR擴增；M.DL2000 Maker；CK.陰性；1.川射干；2.肉桂；3.合歡皮；4.黃柏；5.高良姜；6.首烏藤。圖3 天根植物試劑盒DNA提取和PCR擴增結(jié)果

4 討論

本研究通過對探索4種不同孔徑大小的濾紙對DNA提取的影響，發(fā)現(xiàn)孔徑最小的Whatman慢速濾紙較其他孔徑的濾紙相比，對樣品DNA的提取濃度最高，提取純度較好，PCR擴增效率最高，DNA提取濃度表現(xiàn)出與孔徑大小成反比的現(xiàn)象，即孔徑越小，濃度越高。因為孔徑太大時，有些DNA分子會透過濾紙，吸附較少，當孔徑小的時候，DNA會被濾紙吸附得更多，因此濃度越高。

本研究對植物不同入藥部位對DNA提取的影響開展研究，擴增效率：花類、果實、葉子類、全草>根及根莖>皮類，PCR擴增結(jié)果與DNA提取質(zhì)量的分析結(jié)果表現(xiàn)出一致性。真菌類、動物類總體擴增效率高于植物類，其原因可能是植物類多糖、多酚含量多，部分次級代謝產(chǎn)物具有抑制 PCR反應(yīng)的效果，而動物不含植物多糖，成分較為單一[13-14]。研究表明濾紙法提取DNA的效果受藥材入藥部位的影響，適合花類、全草類、葉類、果實類、部分根莖類及動物類、真菌類藥材DNA的提取。

本研究表明濾紙法可在30 s內(nèi)成功提取部分藥材DNA，說明該方法在中藥材DNA提取方面有一定的適用性。本研究探索了濾紙法提取失敗的原因，皮類藥材，高良姜、首烏藤等根莖類藥材濾紙法均未擴增成功，試劑盒提取也僅有合歡皮擴增成功，且試劑盒提取濃度較低，這表示實驗樣品本身的DNA較少，原因可能是藥材儲藏太久導致DNA嚴重降解造成的。推測濾紙法對于皮類藥材、含多糖多酚的藥材和經(jīng)過長期儲存、炮制加工的樣品提取效果不佳，因其僅通過裂解、吸附、清洗雜質(zhì)和洗脫4個簡單步驟獲得DNA，并未經(jīng)過水浴、去糖去酚等步驟，皮類藥材木質(zhì)化程度較高，富含纖維，加工后的樣品DNA降解更是嚴重。

本研究發(fā)現(xiàn)濾紙法所提的DNA濃度較低，一是因為本研究中所用樣品均為干藥材，DNA含量本身較少；二是因為濾紙條的核酸結(jié)合區(qū)域有限，只能結(jié)合樣品中裂解的部分DNA，并不能吸附的所有的DNA。濾紙法提取的樣品A260/A280<1.8，存在蛋白質(zhì)的污染，因為濾紙也可吸附蛋白質(zhì)等分子，清洗雜質(zhì)時間較短，蛋白質(zhì)等分子還存在核酸結(jié)合區(qū)，最后洗脫核酸時也會洗脫一些蛋白質(zhì)分子。

濾紙法可實現(xiàn)在沒有專業(yè)設(shè)備或者專業(yè)人員的情況下，在30 s內(nèi)提取樣品DNA，消除了對于樣品提取的專業(yè)實驗室的需求，比任何現(xiàn)有其他技術(shù)更加簡單、快速和低成本，適用于現(xiàn)場快檢。該方法可用于部分藥材DNA的快速提取，在中藥材分子鑒別快檢方面具有較大應(yīng)用價值。