劉芳，馬婷婷，汪蕾，江紹偉，肖凌*

(1.協(xié)和武漢紅十字會醫(yī)院急診科，湖北 武漢 430010；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，湖北 武漢 430065)

近些年來，隨著空氣質(zhì)量逐漸惡化，霧霾出現(xiàn)的頻率越來越高，霧霾中含有很多顆粒性污染物，在PM2.5相關(guān)的研究中[1-3]發(fā)現(xiàn)，主要引起肺部的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。運(yùn)用傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)采用中藥預(yù)防是可行的方法。根據(jù)專利“一種清肺潤肺茶的生產(chǎn)方法”(專利號：ZL201410124446.5)生產(chǎn)的清肺潤肺茶霾黃金，主要由清肺潤肺健脾的藥食同源中藥制成，用于對霧霾傷害的預(yù)防，成分包括玉竹、羅漢果、甘草、橘皮、蘆根、薏苡仁、余甘子、百合(按劑量高低排列，具體劑量受專利保護(hù))8味中藥。本試驗(yàn)擬對霾黃金進(jìn)行毒理試驗(yàn)，對霾黃金安全性作進(jìn)一步研究。

羅漢果具有清熱潤肺、利咽開音和滑腸通便作用。蘆根具有清熱瀉火、生津止渴、除煩止嘔作用，但脾胃虛寒者慎服蘆根。百合具有養(yǎng)陰潤燥、清心安神作用，目前幾乎未有相關(guān)毒副作用的報道。甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳的作用。薏苡仁具有利水滲濕、健脾止瀉、排膿解毒的作用，也對癌細(xì)胞有阻止生長和殺傷作用，但消化功能弱者慎食。陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰的作用，急性毒性作用小。余甘子具有生津止咳、清熱涼血、消食健胃的作用，其暫未查到明顯毒理作用。玉竹的有毒成分為鈴蘭苷或苓蘭苷，過量可引起中毒。綜合以上內(nèi)容，我們設(shè)計了急性毒理試驗(yàn)，重點(diǎn)評估霾黃金中藥茶對胃腸功能、肝腎功能及血糖的影響。

試驗(yàn)采用最大耐受法對小鼠進(jìn)行急性毒理試驗(yàn)，通過觀察小鼠在灌胃后的飲食和排泄情況，統(tǒng)計體質(zhì)量變化評估其對胃腸功能的影響；通過檢測小鼠血清的相關(guān)生化指標(biāo)及肝腎病理切片評估其對肝腎功能，檢測血清葡萄糖評估霾黃金中藥茶對血糖的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對象

40只SPF級昆明小鼠購自三峽大學(xué)試驗(yàn)動物中心(動物合格證號：No42010200002114,單位許可證編號：SCXK(鄂) 2017-0012)，日齡為35～37 d。購買后在適宜溫度和濕度下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，40只KM小鼠平均體質(zhì)量為(29.87±1.58)g。

1.2 分組方法

將適應(yīng)性飼養(yǎng)后的40只KM小鼠隨機(jī)編號，然后通過產(chǎn)生1～40之間的隨機(jī)數(shù)的方法先后分為A,B,C,D四組，每組10只。試驗(yàn)期間，參考動物試驗(yàn)通用要求，遵循相關(guān)動物保護(hù)和使用指南，并獲得單位倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 試驗(yàn)試劑與器材

霾黃金(取自商品霾黃金伴侶茶，許可證編號：SC10642011801427，2018/07/15)；離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司，型號：LD5-2A)；生化試劑盒葡萄糖(批號：180851)、肌酐(批號：180651)、總蛋白(批號：180791)、甘油三酯(批號：191041)均來自中生北控生物科技股份有限公司；分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司，型號：723N)。

1.4 試驗(yàn)方法

40只KM小鼠分為A,B,C,D四組，A組為對照組(灌相應(yīng)體積的去離子水)，B,C,D組受試物劑量設(shè)3個劑量組(正常劑量的1倍，10倍，100倍)。

1.4.1 劑量換算

霾黃金一包為的劑量為1.5 g，參考徐叔云教授主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[4]，根據(jù)體表面積換算法，人和小鼠(20 g)間按體表面積折算的等效劑量比值為0.002 5，算得相當(dāng)于小鼠劑量為0.187 5 mg/g。A,B,C,D四組的劑量分別為0，0.187 5，1.875，18.75 mg/g。但100倍正常劑量時溶液呈高度黏稠狀無法進(jìn)行灌胃，所以統(tǒng)一將濃度稀釋50%后分2次灌胃，小鼠灌胃容量為0.015 mL/g，每日灌胃溶液需新鮮配制。

1.4.2 灌胃

用1 mL的注射器配已消毒滅菌的8號灌胃針頭對小鼠進(jìn)行灌胃。各組小鼠灌胃前隔夜停食16 h(不限制飲水)，第1次灌胃結(jié)束后將小鼠放回籠中，間隔4 h后進(jìn)行第2次灌胃，并且每次灌胃前需禁食禁水2 h。每日灌胃結(jié)束后投放飼料和水供小鼠自由飲食，期間并記錄小鼠的死亡情況，觀察小鼠的行為，外觀，對刺激的反應(yīng)，排泄物及分泌物情況，連續(xù)灌胃10日。

1.4.3 取材

摘眼球取血：于第14日對小鼠禁食24 h后，采用摘取眼球的方法對小鼠進(jìn)行采血。將采集的血液置于干燥的EP管內(nèi)，靜止0.5 h后3 500 r/min離心10 min(離心力為2 100 g,離心半徑約15 cm)，吸取每管的上層血清于新的干燥EP管內(nèi)，貼好標(biāo)簽，于4 ℃冰箱內(nèi)保存。

小鼠肝腎取材：眼球取血后的小鼠立刻進(jìn)行解剖，取小鼠的肝臟和腎臟，取得的臟器置于裝有組織固定液(4%多聚甲醛)的EP管內(nèi)固定保存，外送石蠟包埋。

1.4.4 病理切片制作

取回的石蠟包埋好的臟器固定于切片機(jī)上切成5～8 μm的薄片，切下的薄片展于40 ℃水浴并用鑷子將蠟片分離開，選擇最佳的薄片，置于載玻片上放入37 ℃烤片機(jī)中24 h晾干[5]。晾干后的切片進(jìn)行HE染色，最后封片并加蓋蓋玻片，在顯微鏡下進(jìn)行鏡下觀察。

1.4.5 指標(biāo)測定

生化指標(biāo)的檢測：用分光光度分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線法對取好的小鼠血清進(jìn)行生化指標(biāo)的測定。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

本試驗(yàn)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，運(yùn)用的統(tǒng)計學(xué)軟件為SPSS 23.0。

2 結(jié)果

2.1 灌胃后小鼠體質(zhì)量飲食行為記錄

第1天，第7天和第14天的平均體質(zhì)量記錄見表1，從數(shù)據(jù)和結(jié)果中看出各組小鼠的體質(zhì)量持續(xù)增長，且試驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

試驗(yàn)期間未見小鼠死亡。灌胃期間小鼠的進(jìn)食進(jìn)水及行動應(yīng)激能力并無異常，觀察小鼠排泄物，可見D組小鼠大便顏色略深，其余性狀并無異常。

表1 灌胃期間小鼠體質(zhì)量表

2.2 生化指標(biāo)測定結(jié)果

取得的小鼠血清均為黃色透明，新鮮無溶血。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法求得葡萄糖，總蛋白，肌酐，甘油三酯的相應(yīng)濃度，對每組的各項(xiàng)生化指標(biāo)的平均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)計算及差異分析見表2。

表2 小鼠血清生化指標(biāo)

從表中可看出試驗(yàn)組B,C,D組的葡萄糖，總蛋白，肌酐，甘油三酯測量值與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 組織病理學(xué)

小鼠肝，腎HE染色的片子在正置顯微鏡下進(jìn)行組織形態(tài)觀察，拍攝的圖片見圖1，圖2。從病理切片染色結(jié)果可看出與對照組A組相比，試驗(yàn)組B,C,D組小鼠的肝腎并未出現(xiàn)炎癥改變、細(xì)胞水腫、脂肪變性等急性毒理改變。

圖1 小鼠肝臟石蠟切片HE染色(從左到右分別為A,B,C,D組，×400)

圖2 小鼠腎臟石蠟切片HE染色(從左到右分別為A,B,C,D組，×400)

3 討論

近年來大氣污染問題日益嚴(yán)重，霧霾天氣及其主要成分 PM2.5成為危害人體健康的重要元兇，在相關(guān)研究中，霧霾可通過影響肺組織ATP的產(chǎn)生和免疫功能來引起肺功能的損傷[6-7]。霾黃金中藥茶是一種清肺潤肺中藥茶，在研究其對霧霾損傷的防護(hù)作用之前做了此次急性毒理試驗(yàn)。

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)傳統(tǒng)方法可分為霍恩氏法，寇氏法[8]。但本試驗(yàn)為中藥保健茶，測LD50較為困難，故參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-12]，本試驗(yàn)采用最大耐受法對小鼠進(jìn)行急性毒理試驗(yàn)，灌胃劑量分別設(shè)為正常劑量的1倍，10倍和100倍。由于該產(chǎn)品10 d為1周期，故對小鼠連續(xù)灌胃10 d。根據(jù)GB 15193.1-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品安全性毒理學(xué)評價程序，動物毒性試驗(yàn)結(jié)果外推到人的不確定系數(shù)通常為100，本試驗(yàn)中最大劑量組為正常劑量的100倍。

霾黃金中藥茶為八種藥食同源中藥進(jìn)行配伍制備，其主要功效是清肺潤肺健脾。急性毒理試驗(yàn)主要涉及其對小鼠胃腸和肝腎功能影響進(jìn)行評估。鑒于霾黃金茶口感回甘，本試驗(yàn)亦對試驗(yàn)小鼠血糖進(jìn)行評估。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的小鼠在連續(xù)灌胃后體質(zhì)量，飲食，行為和排泄情況等均無異常，胃腸功能正常；試驗(yàn)組小鼠血清總蛋白、肌酐、甘油三酯與對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，HE染色的病理切片分析，未見試驗(yàn)組小鼠的肝腎發(fā)生病理學(xué)改變，表明霾黃金中藥茶對肝腎功能無影響。試驗(yàn)組小鼠血清葡萄糖與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，顯示其對血糖無影響。綜上，潤肺清肺中藥茶霾黃金不影響小鼠胃腸功能、肝腎功能及血糖，不引起急性毒理改變，使用安全。