李金曦，趙吉艷，王均寧，沈仲琪，張義敏，2，董振飛，2*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東省中醫(yī)經(jīng)典名方協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 濟(jì)南 250355)

動(dòng)脈粥樣硬化( atherosclerosis,AS)是心血管系統(tǒng)常見(jiàn)疾病[1],是眾多心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)[2]。流行病學(xué)研究顯示：我國(guó)以動(dòng)脈粥樣硬化為病理基礎(chǔ)的心血管疾病致死、致殘率極高[3]，且呈逐年上升趨勢(shì)[4]。《中國(guó)心血管病報(bào)告2017(概要)》表明，至2017年我國(guó)已有心血管病患者2.9億，死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病[5]。積極推進(jìn)抗AS藥物的藥物研發(fā)及研究其藥理作用機(jī)制, 對(duì)防治AS類疾病具有重要意義[6]。

AS是復(fù)雜的慢性進(jìn)行性疾病，是冠心病的病理基礎(chǔ)，現(xiàn)代臨床中醫(yī)常從“胸痹”論治。仲景在《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》所創(chuàng)的瓜蔞薤白半夏湯即為治療胸痹的經(jīng)典名方，因其治療胸痹病效專力宏，故頗受歷代醫(yī)家之重視。原文曰：“胸痹不得臥，心痛徹背者，栝樓薤白半夏湯主之。”此方瓜蔞實(shí)一枚、薤白三兩、半夏半升、白酒一斗組成，功擅通陽(yáng)散結(jié)，祛痰寬胸，適用于胸痹痰濁結(jié)聚較甚者。

本實(shí)驗(yàn)中使用的Apoe-/-小鼠已成為近幾年研究AS最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[7]，因其體內(nèi)缺乏參與脂蛋白轉(zhuǎn)化代謝的載脂蛋白e基因致使血液中膽固醇堆積而更易形成AS病灶。該模型因其未受物理?yè)p傷干預(yù)，發(fā)病過(guò)程及病變部位與人類十分相似而成為目前研究AS類疾病的極佳動(dòng)物模型[8]。本研究通過(guò)復(fù)制Apoe-/-小鼠AS模型，對(duì)瓜蔞薤白半夏湯調(diào)節(jié)血脂代謝、減小主動(dòng)脈斑塊面積、改善血管內(nèi)皮功能等方面進(jìn)行研究，探討瓜蔞薤白半夏湯抗AS的作用機(jī)制，為該方臨床應(yīng)用提供現(xiàn)代醫(yī)學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

瓜蔞、薤白、清半夏購(gòu)于濟(jì)南建聯(lián)中藥店，許可證號(hào)：魯20160039；糯米酒(酒精度8%)購(gòu)于濟(jì)南大潤(rùn)發(fā)超市，許可證編號(hào)：SC10333021205725。辛伐他汀片，世貿(mào)天階制藥(江蘇)有限責(zé)任公司，H20063015。

1.1.2 動(dòng)物與飼料

32只SPF級(jí)健康雄性Apoe-/-小鼠，8周齡，體質(zhì)量18～22 g和同遺傳背景C57BL/6J小鼠8只，8周齡，體質(zhì)量18～22 g；購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SYXK(魯)20110019；動(dòng)物飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室IVC獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)小鼠籠。高脂飼料由山東解螺旋生物科技有限公司提供 (TP-26300),普通飼料( SCXK魯 20180003)與動(dòng)物墊料均由濟(jì)南朋悅公司提供，均經(jīng)過(guò)高溫滅菌處理。本研究中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)及操作嚴(yán)格遵守國(guó)家動(dòng)物福利倫理與保護(hù)相關(guān)規(guī)定。

1.1.3 主要設(shè)備和器械

電子天平：杭州萬(wàn)特衡器有限公司；移液器：Finnpipette；全自動(dòng)雪花制冰機(jī)：上海政泓實(shí)業(yè)有限公司；立式壓力滅菌器：重慶雅馬拓科技有限公司，SQ510C；高速冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；酶標(biāo)儀：Rayto，RT-6100；電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司，HWS-26型。

1.1.4 主要試劑

小鼠氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)ELISA試劑盒(晶美公司，JM-02354M2);小鼠一氧化氮(NO)ELISA試劑盒(晶美公司，JM-02938M1);小鼠內(nèi)皮素1(ET-1)ELISA試劑盒(晶美公司，JM-02844M2);小鼠血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)ELISA試劑盒(晶美公司，JM-02490M1)。

1.1.5 中藥制備

瓜蔞薤白半夏湯原方換算如下：瓜蔞實(shí)(搗碎)30 g，薤白45 g，半夏60 g。以上為成人每日所需用藥劑量，按小鼠體表系數(shù)9.1折算得等效劑量。瓜蔞4.55 g/kg,薤白6.825 g/kg,半夏9.1 g/kg。

1.2 方法

1.2.1 模型制備

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，Apoe-/-小鼠給予高脂飼料飼養(yǎng)，自由飲水，持續(xù)時(shí)間12周。

1.2.2 分組及給藥

12周末造模結(jié)束，Apoe-/-小鼠隨機(jī)分為GXBD組、辛伐他汀組、模型對(duì)照組，每組各8只，持續(xù)高脂飲食。C57BL/6J小鼠設(shè)為空白對(duì)照組，普通飼料喂養(yǎng)。按體質(zhì)量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)10周。

1.2.3 動(dòng)物組織采集與處理

取材前夜動(dòng)物禁食不禁水，麻醉后固定，剪開(kāi)腹部，進(jìn)行下腔靜脈取血靜置2 h，3 000 r/min，低溫高速離心15 min，取上清，置于-80 ℃保存。取血后剪開(kāi)胸腔，剪去胸骨，暴露心臟，自主動(dòng)脈根部至髂總動(dòng)脈分支處完整分離主動(dòng)脈，完整取出主動(dòng)脈，置于PBS緩沖液洗凈血液，并分離凈多余脂肪組織及纖維組織后置于4%多聚甲醛固定。

1.2.4 血清指標(biāo)

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C)水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清NO、ET-1、AngⅡ、OX-LDL的濃度。

1.2.5 組織病理分析

主動(dòng)脈油紅O染色，觀察小鼠主動(dòng)脈內(nèi)脂質(zhì)沉積及斑塊面積，測(cè)量主動(dòng)脈斑塊面積(PA)和管腔面積(LA)，計(jì)算斑塊面積與管腔面積之比(PA/LA)。主動(dòng)脈HE染色切片，觀察主動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)的病理改變。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠主動(dòng)脈油紅O染色

油紅O染色能特異性地使組織和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)以及脂蛋白等染色，呈紅色部位說(shuō)明存在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。如圖2所示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠PA/LA顯著增加(P<0.01); 與模型對(duì)照組相比, GXBD組的PA/LA顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖1、圖2。

2.2 主動(dòng)脈橫截面HE染色

圖3A：正常對(duì)照組,血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列規(guī)則，各層分界清晰，血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)完整，未見(jiàn)明顯炎癥，未見(jiàn)AS斑塊形成。圖3B：模型對(duì)照組,血管內(nèi)膜增厚，動(dòng)脈血管管腔出現(xiàn)粥樣硬化斑塊，血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)紊亂，排列不規(guī)則，有散在泡沫細(xì)胞和炎癥細(xì)胞。圖3C：GXBD組,血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、分界清晰、排列規(guī)則；血管腔內(nèi)可見(jiàn)少量脫落的細(xì)胞。圖3D：辛伐他汀組,血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、分界清晰、排列規(guī)則；血管腔內(nèi)可見(jiàn)較多脫落的細(xì)胞(黑色箭頭)，并伴有單個(gè)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 主動(dòng)脈油紅O染色

圖2 斑塊面積/管腔總面積(PA/LA)

2.3 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)Apoe-/-敲除小鼠血脂的影響

AS的發(fā)生是由于脂質(zhì)聚集在血管壁，伴隨復(fù)合糖類積聚、纖維增生和鈣質(zhì)沉著，因此調(diào)節(jié)和減少脂質(zhì)聚集對(duì)于抗AS有著重要意義[9]。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清中的TC、TG、LDL-C水平較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，HDLC明顯降低(P<0.01)，GXBD組TC、LDL-C水平較模型組顯著降低(P<0.01)，TG有降低趨勢(shì)(P>0.05)，HDL-C水平較模型組升高(P<0.05)，見(jiàn)表1，圖4～7。

注：A正常對(duì)照組；B模型對(duì)照組；C GXBD組；D辛伐他汀組圖3 主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變 HE染色(HE×200)

2.4 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)Apoe-/-小鼠血清NO、ET-1、ox-LDL、AngⅡ的檢測(cè)

與空白組比較，模型組NO濃度顯著降低(P<0.01)，給藥干預(yù)后，瓜蔞薤白半夏湯組NO表達(dá)量相對(duì)模型組顯著升高(P<0.01)，模型組ET-1與空白組相比顯著升高，中藥組顯著降低(P<0.01)，可以說(shuō)明瓜蔞薤白半夏湯干預(yù)能升高血清NO的表達(dá)，減少ET-1的表達(dá)，能夠有效的改善血管收縮舒張功能的紊亂。模型組AngⅡ與空白組比較顯著升高(P<0.01)，中藥組AngⅡ表達(dá)量相對(duì)模型組有顯著降低(P<0.01)，模型組ox-LDL與空白組相比顯著升高，中藥組顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明瓜蔞薤白半夏湯的干預(yù)能夠減輕氧化損傷，緩解血管平滑肌緊張，有效改善血管收縮舒張功能的紊亂,見(jiàn)表2,圖8～11。

表1 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)小鼠血脂水平的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

表2 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)血清NO、ET-1、ox-LDL、AngⅡ的影響

注：與空白組相比，**P<0.01；與模型組相比，▲▲P<0.01

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖4 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)TC的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖5 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)TG的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖6 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)HDLC的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖7 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)LDLC的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖8 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)血清NO的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖9 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)血清ET-1的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖10 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)血清AngⅡ的影響

注：與空白組相比，**P<0.01;與模型組相比，▲▲P<0.01圖11 瓜蔞薤白半夏湯對(duì)血清ox-LDL的影響

3 討論

《內(nèi)經(jīng)》云：“脈不通則血不流?！敝嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為“心主血脈”，AS的發(fā)生主要由于心主血脈功能的失調(diào)，血脈不通，脈體失養(yǎng)所致。若心陽(yáng)不振，導(dǎo)致血液運(yùn)行失去動(dòng)力，從而發(fā)生氣滯血瘀，使血行遲滯，血脈痹阻。本研究采用Apoe-/-小鼠采用高脂飲食喂養(yǎng)12周，發(fā)病機(jī)理為過(guò)食肥甘厚膩，阻礙脾胃，運(yùn)化不利，痰濁內(nèi)生，結(jié)聚脈絡(luò)，阻滯血脈，血脈通行受阻致病。

研究表明，瓜蔞薤白半夏湯的現(xiàn)代藥理學(xué)作用機(jī)制主要表現(xiàn)為再灌注時(shí)對(duì)心肌損傷的保護(hù)，抑制血小板聚集[10]、抗心肌缺血[11]等方面，現(xiàn)代臨床中，該方在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的治療中療效顯著。AS被認(rèn)為是動(dòng)脈壁的慢性炎癥性疾病[12]，內(nèi)皮功能的障礙是AS發(fā)生的初始步驟[13]，研究顯示，該方可通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制氧化應(yīng)激，減輕炎癥反應(yīng)等多種機(jī)制有效抑制動(dòng)脈血管內(nèi)皮的損傷。在血管內(nèi)皮受到損傷后，內(nèi)皮屏障功能減弱，從而引起脂質(zhì)浸潤(rùn)增加，白細(xì)胞黏附遷移、NO生物活性減低、平滑肌細(xì)胞增殖、斑塊的不穩(wěn)定性增加，引起血栓的形成[14]。血管收縮因子主要包括內(nèi)皮素(ET)、血管緊張素(Ang)、血栓素(TXA)等，ET-1由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌，是NO的反向調(diào)節(jié)物質(zhì)，ET-1水平與AS嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，內(nèi)皮損傷或ET釋放增加，會(huì)增強(qiáng)血管收縮，促進(jìn)平滑肌增生，致使斑塊形成和擴(kuò)大，引起血管重塑障礙。血管舒張因子主要包括一氧化氮(NO)，前列腺素(PGI)等。據(jù)1980年，F(xiàn)urchgott和Zawadzki的首次報(bào)道證實(shí)了內(nèi)性NO作為天然血管保護(hù)因子和抗動(dòng)脈粥樣硬化分子具有重要的病理生理學(xué)意義[15]。內(nèi)皮細(xì)胞依賴性的血管收縮舒張功能是目前公認(rèn)的內(nèi)皮功能障礙評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[16]，內(nèi)皮功能障礙是導(dǎo)致AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，因此，本研究認(rèn)為對(duì)內(nèi)皮功能紊亂進(jìn)行有效干預(yù)和改善成為防治AS的重要環(huán)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)方案的確定立足于血管收縮與舒張功能的紊亂是AS發(fā)生的重要因素，動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致AS發(fā)生的主要條件，NO的產(chǎn)生減少引起的內(nèi)皮舒張功能減弱是血管內(nèi)皮功能紊亂的直接原因，通過(guò)檢測(cè)NO、ET-1系統(tǒng)的平衡，及AngⅡ、ox-LDL的表達(dá)，試圖進(jìn)一步揭示瓜蔞薤白半夏湯對(duì)動(dòng)脈血管內(nèi)皮的保護(hù)功能，抑制AS發(fā)展的機(jī)制。

本研究以Apoe-/-小鼠給予高脂飲食飼養(yǎng)復(fù)刻AS模型，探討了瓜蔞薤白半夏湯在調(diào)節(jié)血脂水平，調(diào)節(jié)主動(dòng)脈斑塊面積，以及調(diào)節(jié)血清NO、ET-1、ox-LDL、AngⅡ方面的作用。研究結(jié)果顯示，GXBD組小鼠血清TC、TG、LDL-C與模型組相比明顯下降(P<0.05)，HDL-C水平明顯升高(P<0.05)，說(shuō)明瓜蔞薤白半夏湯可以較好的改善小鼠血脂水平。油紅O染色顯示瓜蔞薤白半夏湯能明顯減小主動(dòng)脈斑塊面積；HE染色結(jié)果顯示瓜蔞薤白半夏湯組血管平滑肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、分界清晰、排列規(guī)則，說(shuō)明瓜蔞薤白半夏湯能有效抑制小鼠動(dòng)脈AS的形成與發(fā)展。瓜蔞薤白半夏湯組血清NO的表達(dá)較模型組顯著升高(P<0.05)，ET-1、ox-LDL、AngⅡ較模型組顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明瓜蔞薤白半夏湯能夠有效保護(hù)血管內(nèi)皮、減輕氧化損傷，緩解血管平滑肌緊張，改善血管收縮舒張功能紊亂，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能障礙。以上研究結(jié)果表明，瓜萎薤白半夏湯給藥干預(yù)10周能夠顯著抑制高脂飲食12周誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化小鼠主動(dòng)脈斑塊的發(fā)展，其調(diào)節(jié)血脂水平，升高血清NO濃度，抑制血清ET-1、ox-LDL、AngⅡ表達(dá)的作用，可能是其防治AS的部分機(jī)制。