肖連冬，王瑩，李慧星

（南陽(yáng)理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473004）

黃酮類(lèi)化合物是在植物中分布非常廣泛的一類(lèi)天然產(chǎn)物[1]，現(xiàn)已確認(rèn)結(jié)構(gòu)的生物黃酮類(lèi)物質(zhì)約有5 000 種[2]。不同結(jié)構(gòu)的黃酮可以作用于身體的不同器官，黃酮作為一種強(qiáng)抗氧化劑，其功效是多種多樣的，不僅可以清除體內(nèi)的氧自由基，還能夠阻止細(xì)胞的衰老和退化，降低癌變的可能性，具有抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抑菌抗病毒、抗輻射等作用[3-6]。洋蔥又名蔥頭、圓蔥、球蔥，作為生活中常見(jiàn)的蔬菜，洋蔥不僅含有豐富的維生素和氨基酸，而且還含有大量黃酮類(lèi)化合物，洋蔥中的黃酮類(lèi)物質(zhì)主要有黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)和花色素類(lèi)，作為洋蔥中重要的活性物質(zhì)，有著廣泛的生理活性作用[7-11]。因此，探索洋蔥黃酮提取方法、條件對(duì)有關(guān)功能食品開(kāi)發(fā)、營(yíng)養(yǎng)保健品生產(chǎn)及醫(yī)藥臨床治療方面有意義重大。

黃酮傳統(tǒng)的提取方法有水浸提法，乙醇浸提法和酶解浸提法等。水浸提法操作最為簡(jiǎn)便，對(duì)環(huán)境影響較小，但效率低，收率低，雜質(zhì)含量高；乙醇溶液浸提法耗時(shí)長(zhǎng)，收率低；酶解法條件溫和，但耗時(shí)長(zhǎng)，成本高[12]；雙水相萃取法，是一種新型液-液萃取技術(shù)，根據(jù)萃取體系性質(zhì)不同，當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于其表面電荷、表面自由能和各種力的作用使其在上下兩相進(jìn)行分配，從而得以分離[13]。其優(yōu)點(diǎn)[14-15]：（1）雙水相萃取兼具提取和純化雙重功效，提取出的產(chǎn)物純度高，雜質(zhì)少；（2）操作條件溫和；（3）界面張力小，利于兩相間物質(zhì)傳質(zhì)；（4）分相時(shí)間短，萃取效率高；（5）操作簡(jiǎn)便，易于工業(yè)化等。因此該方法受到人們極大的關(guān)注，是一種很有發(fā)展前途的萃取方法。本試驗(yàn)采用雙水相萃取法，研究乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系萃取洋蔥黃酮的工藝條件，確定各項(xiàng)主要技術(shù)參數(shù)，以期為洋蔥黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅皮洋蔥：市售；槲皮素（分析標(biāo)準(zhǔn)品）：上海金穗生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S 分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；FW-100 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；TDL·40B 臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9146A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHA-C 水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；721 分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將洋蔥洗凈、切絲，放入干燥箱中50 ℃干燥后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40 目篩。

1.3.2 雙水相相圖的繪制

采用濁點(diǎn)滴定法[16-17]繪制雙水相相圖。參照溶解度大小，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的磷酸氫二鉀溶液。向錐形瓶中加入一定質(zhì)量的磷酸二氫鉀溶液，后滴加無(wú)水乙醇并充分振蕩至溶液渾濁，記下無(wú)水無(wú)醇質(zhì)量，然后滴加蒸餾水至溶液澄清，記錄蒸餾水的質(zhì)量，算出此時(shí)磷酸氫二鉀和乙醇在系統(tǒng)中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即得相圖中的一個(gè)點(diǎn)。重復(fù)上述操作，繪制出相圖。

1.3.3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 mg 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶解定容至25 mL，得到 0.2 mg/mL 的黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取 0、1、2、3、4、5、6 mL 黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，各以50 %乙醇溶液補(bǔ)至6 mL，然后各加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，靜置6 min；再分別加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻，靜置6 min；再加入10 mL 1 mol/L 氫氧化鈉溶液，充分混合后用50%乙醇定容至20 mL，靜置15 min。以0 mL 黃酮標(biāo)準(zhǔn)液試管為空白，在510 mm 下測(cè)定各個(gè)溶液的吸光值，建立標(biāo)準(zhǔn)方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[18-19]。

1.3.4 洋蔥黃酮提取操作

在乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系中，上相為富乙醇相，下相為富鹽相，由于黃酮類(lèi)物質(zhì)極性較小而富集于上相，而極性較大的物質(zhì)如多糖則多富集于下相，從而使洋蔥黃酮得以提取分離。收集上相中黃酮作為產(chǎn)物進(jìn)行研究。具體操作為：配制總質(zhì)量10 g 的雙水相體系，加入一定量洋蔥粉末，恒溫水浴振蕩萃取后，將其轉(zhuǎn)移到離心管，4 000 r/min 離心20 min，測(cè)定上相體積及黃酮含量，計(jì)算出提取率。

式中：Vt為上相體積，mL；Ct為上相黃酮濃度，mg/mL；M 為加入的洋蔥粉末的質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

以上相黃酮提取率為主要指標(biāo)，分別考察不同因素對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響。

乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定：在磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18 %，加料量為 0.5 g，40 ℃提取 20 min 條件下，考察雙水相體系中不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（36%、38%、40%、42%、44%）對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響。

磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定：在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 %，加料量為 0.5 g，40 ℃提取 20 min 條件下，考察雙水相體系中不同磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)（16%、18%、20%、22%、24%）對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響。

加料量確定：在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%，磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，40 ℃提取20 min 條件下，考察不同洋蔥粉加量（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 g）對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響。

提取溫度確定：在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%，磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18 %，加入0.5 g 洋蔥粉，提取時(shí)間20 min 條件下，考察不同溫度（30、40、50、60、70 ℃）對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響。

提取時(shí)間確定：確定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%，磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%，加料量為0.5 g，考察40 ℃下提取不同時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響。

1.3.6 乙醇/磷酸氫二鉀體系提取洋蔥黃酮的Box-Behnken 試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇加料量（A）、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）3 個(gè)因素作為變量，以洋蔥黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定黃酮提取的最佳條件。提取溫度選擇50 ℃，時(shí)間選擇30 min。Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以不同含量的槲皮素在波長(zhǎng)510 nm 處的吸光值A(chǔ)510nm為縱坐標(biāo)，以槲皮素含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of quercetin

由圖1 可知，在槲皮素含量0～1.2 mg 范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性回歸方程為y=0.478 4x-0.007 2，R2=0.999 5。結(jié)果表明，槲皮素含量與吸光值呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2 雙水相體系相圖繪制

利用濁點(diǎn)滴定法繪制乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系相圖見(jiàn)圖2。

根據(jù)相圖，在兩相區(qū)內(nèi)選擇數(shù)據(jù)進(jìn)行洋蔥黃酮提取試驗(yàn)。

圖2 乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系相圖Fig.2 Phase diagram of EtOH/K2HPO4 aqueous two-phase system

2.3 洋蔥黃酮提取的單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響

乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)洋蔥黃酮提取的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)洋蔥黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol mass fraction on extraction rate of onion flavonoids

乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)大小直接影響雙水相體系組成，從而影響黃酮萃取效果。由圖3 可知，在磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定的情況下，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黃酮提取率逐漸增加，在42%時(shí)達(dá)到最高，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加黃酮提取率顯著降低。其原因是當(dāng)乙醇濃度較低時(shí)不利于黃酮的浸出，隨著體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，使上相中乙醇濃度增加，有利于黃酮浸出，同時(shí)上相體積逐漸增大[20]，下相體積相對(duì)減小，總提取率增大。隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的持續(xù)增加，上相的極性減小，一些脂溶性有機(jī)物的溶出量也會(huì)增加，抑制了總黃酮的浸出。

2.3.2 磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的磷酸氫二鉀對(duì)洋蔥黃酮提取影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)高低對(duì)雙水相體系組成有影響，從而影響對(duì)洋蔥黃酮萃取效果。由圖4 可見(jiàn)，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定的情況下，隨著磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，黃酮提取率先升后降，當(dāng)磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%時(shí)提取率最高。這可能是由于當(dāng)磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加時(shí)，體系中水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相應(yīng)變小，同時(shí)鹽對(duì)水的爭(zhēng)奪量也增加，上相乙醇濃度相對(duì)增加，對(duì)黃酮的浸取能力增大，但鹽的增加會(huì)導(dǎo)致下相的體積增大，相比減小[21]，過(guò)多影響體系整體的萃取能力，從而導(dǎo)致提取率的下降。

2.3.3 加料量對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響

加料量對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)洋蔥黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ammonium dipotassium hydrogen phosphate mass fraction on extraction rate of onion flavonoids

圖5 加料量對(duì)洋蔥黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of feed quantity on extraction rate of onion flavonoids

由圖5 可知，加料量在0.1 g 時(shí)黃酮提取率較低，在0.3 g 時(shí)提取率達(dá)最高，然后隨著加料量的繼續(xù)增加，黃酮提取率逐步降低。其原因可能來(lái)自于兩方面的作用，其一是在雙水相體系質(zhì)量一定情況下，隨著加料量增加溶劑滲透并擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的速度以及黃酮化合物向溶劑中擴(kuò)散的速度小，所以提取率下降；其二是干洋蔥粉的加入會(huì)吸收雙水相中的部分水分，使乙醇濃度有所提高，所以當(dāng)加料量特別少時(shí)，提取率也較低。上述結(jié)果為兩者綜合影響的結(jié)果。

2.3.4 提取溫度對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響

提取溫度對(duì)洋蔥黃酮提取的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 提取溫度對(duì)洋蔥黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction rate of onion flavonoids

由圖6 可知，提取溫度為50 ℃時(shí)提取率最高，隨著溫度的升高，提取率不斷下降，這是因?yàn)橐掖际軣釙r(shí)易揮發(fā)，使得雙水相系統(tǒng)萃取能力下降，從而影響提取率。因此優(yōu)化試驗(yàn)選取最佳提取溫度為50 ℃。

2.3.5 提取時(shí)間對(duì)洋蔥黃酮提取效果的影響

提取時(shí)間對(duì)洋蔥黃酮的影響結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 提取時(shí)間對(duì)洋蔥黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of extraction time on extraction rate of onion flavonoids

由圖7 可見(jiàn)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮提取率先升后降，在提取時(shí)間為30 min 時(shí)達(dá)到最大。原因可能是提取初期，洋蔥黃酮隨時(shí)間增加不斷浸出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮的浸出率逐漸達(dá)到最大。如果繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，乙醇揮發(fā)量增加，會(huì)引起總黃酮提取效果下降。同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間提取還可能造成黃酮類(lèi)化合物的內(nèi)部分子結(jié)構(gòu)的破壞[22]，使得黃酮提取率隨之而降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，選擇當(dāng)超聲提取時(shí)間為30 min 時(shí)，黃酮提取率最高。因此在進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)時(shí)，選取提取時(shí)間為30 min。

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面試驗(yàn)分析

雙水相體系提取洋蔥黃酮的Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

利用Minitab 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所得回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸系數(shù)顯著性分析Table 3 Significance analysis of regression coefficients

由表3 可知，自變量A、B、C 3 個(gè)因素對(duì)黃酮提取率的影響大小關(guān)系為A＞B＞C，即：加料量＞乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)；其中加料量（A）對(duì)結(jié)果達(dá)到極顯著水平，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）則達(dá)到顯著水平；加料量、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)的曲面效應(yīng)（A2、B2、C2）對(duì)結(jié)果有極顯著影響；加料量和磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)的交互作用（AC）對(duì)提取率有顯著影響。各因素回歸擬合后得到回歸方程：Y=5.304 17-0.353 975A-0.137 613B-0.022 762 5C-0.590 758A2-0.786 333B2-1.157 98C2+0.046 875AB+0.196 525AC+0.116 35BC。

模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 模型方差分析Table 4 Variance analysis of model

根據(jù)表4 回歸模型方差分析結(jié)果，模型P＜0.000 1，表明該二次方程模型具有高度的顯著性；失擬P=0.183＞0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著；該模型決定系數(shù)R2=0.990 6，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.973 8，說(shuō)明模型擬合度較好，可用該模型預(yù)測(cè)黃酮在不同工藝條件下的提取率。經(jīng)過(guò)軟件分析可知，3 個(gè)因素的極點(diǎn)值對(duì)應(yīng)最優(yōu)水平分別為：A=-0.313 1，B=-0.107 7，C=-0.042 0，即當(dāng)加料量為0.24 g、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.78%、磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.92%時(shí)洋蔥黃酮提取率最高，在最優(yōu)條件下雙水相萃取洋蔥黃酮，理論最高提取率達(dá)到5.367%?？紤]到實(shí)際操作及因素對(duì)結(jié)果影響大小，加料量取0.24 g，將乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)整為41.8 %，磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)整為22 %，在50 ℃下提取30 min，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，該驗(yàn)證試驗(yàn)的提取率平均值為5.321 9%，接近預(yù)測(cè)值，表明本響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)合理可行，該回歸方程能夠反映各因素與黃酮提取率的影響。

3 結(jié)論

本研究利用雙水相萃取法提取洋蔥黃酮，考察了乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加料量、提取溫度和時(shí)間對(duì)洋蔥黃酮提取率的影響。通過(guò)采用響應(yīng)面試驗(yàn)分析優(yōu)化了洋蔥黃酮的提取條件，得到洋蔥黃酮最佳提取工藝參數(shù)為：加料量為0.24 g，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)41.8%，磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)22%，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為30 min，此條件下洋蔥黃酮的提取率達(dá)5.32%。試驗(yàn)利用乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系提取洋蔥黃酮具有浸出率高、節(jié)約時(shí)間、提取效率高、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，可為洋蔥黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。