王思琪，傅晶依，丁修慶，劉佳鑫，趙珺

（長(zhǎng)春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022）

甜瓜因其味甘，性寒，具有清熱解暑，除濕止渴、利尿的功效，在我國(guó)廣受消費(fèi)者喜愛(ài)，產(chǎn)量巨大。甜瓜籽即甜瓜的種子，據(jù)研究表明[1]，甜瓜籽中含有37.12%脂肪、24.08%蛋白質(zhì)、24.50%糖類(lèi)，0.01%維生素E 和一定量的礦物質(zhì)，特別是鉀、鎂、磷[2]。但目前對(duì)甜瓜籽的利用極少，在一定程度上存在著浪費(fèi)。研究發(fā)現(xiàn)，甜瓜籽蛋白質(zhì)中多肽含量較高，氨基酸種類(lèi)齊全，其中，賴(lài)氨酸的含量最高，含硫氨基酸次之，且通過(guò)酶水解可以有效改善蛋白的功能性質(zhì)[7]，而目前國(guó)內(nèi)外對(duì)甜瓜籽多肽的研究較少。

多肽是通過(guò)動(dòng)植物蛋白酸解、酶解或微生物發(fā)酵獲得的生物活性多肽，是由氨基酸組成的小分子物質(zhì)[3-4]。研究表明，多肽具有抗氧化、抗病毒、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等眾多生理活性。此外，多肽還有易溶于水、易吸收、無(wú)毒副作用等特點(diǎn)[5-6]，近年來(lái)，受到了國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。

本研究采用雙酶協(xié)同酶解法從甜瓜籽中提取多肽，并進(jìn)行條件優(yōu)化，為甜瓜籽的高效利用及其高值化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

甜瓜籽：天一種業(yè)提供；NaOH、HCl、甲醛：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。堿性蛋白酶（8 U/g）、胰蛋白酶（2.5 U/g）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯水浴鍋（HH-S2）、電子天平（PL203）：金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；臺(tái)式高速離心機(jī)（H-2050R-1）、pH計(jì)（PHS-25）：長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)有限公司；精密定時(shí)電動(dòng)攪拌器（JJ-1）：金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脫脂甜瓜籽粉的制備

將500 g 甜瓜籽干燥至恒重后粉碎為粉末，用正己烷浸泡24 h 脫脂，將脫脂甜瓜籽粉末于50 ℃烘干，然后過(guò)80 目篩，得到脫脂甜瓜籽粉，存于室內(nèi)陰涼干燥處備用[1]。

1.3.2 雙酶法制備甜瓜籽多肽

取脫脂甜瓜籽粉加入蒸餾水，在90℃下變性10min，冷卻至25 ℃后同時(shí)加入胰蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，期間設(shè)定底物濃度、加酶量、酶的質(zhì)量比、酶解溫度、酶解pH 值、酶解時(shí)間。酶解結(jié)束后在90 ℃高溫下滅酶10 min，最后5 000 r/min 離心20 min，獲得多肽水解液。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

影響水解度的因素有很多[8]，本試驗(yàn)著重研究底物濃度、加酶量、酶的質(zhì)量比、酶解溫度、酶解pH 值、酶解時(shí)間等條件下對(duì)水解度的影響。單因素試驗(yàn)因素和水平如表1 所示。

表1 單因素試驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels in the single factor design

1.3.4 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，得出pH 值、溫度、加酶量這3 種因素對(duì)水解度的影響顯著，因此利用Design-Expert8.5 軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，以水解度為響應(yīng)值，以pH 值、溫度、加酶量為因變量，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平如表2 所示。

1.3.5 水解度的測(cè)定

取多肽水解上清液8.0 mL，置于燒杯中，加入60 mL 蒸餾水，加氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 值至8.2，再加入10 mL 中性甲醛溶液（pH 值為 8.1），用 0.1 mol/L 的NaOH 溶液滴定至pH 值為9.2，記錄消耗NaOH 溶液的體積V（mL）。同時(shí)取未酶解的相同濃度甜瓜籽肽液8.0mL，按上述方法做空白試驗(yàn)，記錄所消耗的NaOH溶液體積V0（mL）。水解度計(jì)算公式如下：

DH/%=C×（V-V0）×0.014/N×100

式中：C 為 NaOH 溶液濃度，mol/L；V 為酶解液消耗 NaOH 溶液體積，mL；V0為未酶解液消耗 NaOH 溶液體積，mL；0.014 為氮毫克適當(dāng)量；N 為底物樣品中總氮含量[9]。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and levels in the response surface design

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 底物濃度對(duì)水解度的影響

底物濃度對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 底物濃度對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis

由圖1 可知，在加酶量為3 %、酶解時(shí)間為150 min、酶解溫度為 50 ℃、酶解 pH 值為 7.5，酶比為5∶5（質(zhì)量比）時(shí)。隨著底物濃度由2%逐漸增大到3%時(shí)，水解度逐漸增高，達(dá)到最大值10.94%，隨著底物濃度的繼續(xù)增加，水解度呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)楦邼舛鹊牡孜飳?duì)反應(yīng)速率起著抑制作用[10]。底物濃度過(guò)高時(shí)，高濃度蛋白質(zhì)分散在體系中，束縛了體系中水的流動(dòng)性，限制了酶分子擴(kuò)散，從而減小了酶與底物接觸的可能性，導(dǎo)致反應(yīng)的水解度下降，而當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)低時(shí)，會(huì)減少蛋白酶和底物的碰撞機(jī)率[11]，使水解反應(yīng)受到抑制，因此，最佳的底物濃度為3%。

2.1.2 加酶量對(duì)水解度的影響

加酶量對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on the degree of hydrolysis

由圖2 可知，在底物濃度為3%、酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為150 min、酶解pH 值為7.5，酶比為5∶5（質(zhì)量比）時(shí)。隨著加酶量由2%增加到4%時(shí)，水解度達(dá)到了最大值11.45%，當(dāng)加酶量大于4%時(shí)，水解度降低呈平穩(wěn)趨勢(shì)。這是因?yàn)楫?dāng)酶與底物作用位點(diǎn)達(dá)到了一個(gè)飽和點(diǎn)[12]，增加酶的用量使底物濃度降低，減少酶與底物結(jié)合的機(jī)會(huì)，所以，繼續(xù)添加酶對(duì)于水解度的影響不大。從酶解效果及成本的角度綜合考慮，4%為最佳加酶量。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the degree of hydrolysis

由圖3 可知，在底物濃度為3%、加酶量為4%、酶解溫度為 50 ℃、酶解 pH 值為 7.5，酶比為 5∶5（質(zhì)量比）時(shí)。反應(yīng)時(shí)間由60 min 延長(zhǎng)到180 min，水解度不斷升高，180 min 時(shí)達(dá)到最大值12.24%，但當(dāng)反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)后，水解度呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)榇蠓肿拥牡鞍踪|(zhì)在復(fù)合酶的作用下，首先水解成多肽[13]，但是隨著時(shí)間延長(zhǎng)，更多肽鏈進(jìn)一步被水解為游離氨基酸，導(dǎo)致多肽含量下降，多肽水解度趨于下降[14]。綜合考慮，180 min為最佳的酶解時(shí)間。

2.1.4 酶解溫度對(duì)水解度的影響

酶解溫度對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

由圖4 可以看出，在底物濃度為3 %、加酶量為4 %、酶解時(shí)間為180 min、酶解pH 值為7.5、酶比為5∶5（質(zhì)量比）時(shí)。當(dāng)溫度由 40 ℃升至 50 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最高值12.68%。當(dāng)溫度持續(xù)升高時(shí)，水解度開(kāi)始降低。這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高，酶失去了活性，酶解效果下降，導(dǎo)致水解度降低[15]。因此確定50 ℃為最佳的酶解溫度。

2.1.5 酶解pH 值對(duì)水解度的影響

酶解pH 值對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖5。

圖5 酶解pH 值對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of pH on the degree of hydrolysis

由圖5 可以看出，在底物濃度為3 %、加酶量為4 %、酶解時(shí)間為180 min、酶解溫度為50 ℃、酶比為5∶5（質(zhì)量比）時(shí)。隨著體系 pH 值由 7.0 增大至 8.0，水解度達(dá)到最大值13.40%。隨著pH 值持續(xù)增加，水解度呈下降趨勢(shì)。原因是繼續(xù)增大pH 值會(huì)使溶液呈堿性，導(dǎo)致酶失活[16]，酶解速率下降，因此制備的最佳pH值為8。

2.1.6 酶的質(zhì)量比對(duì)水解度的影響

酶的質(zhì)量比對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖6。

圖6 酶的質(zhì)量比對(duì)水解度的影響Fig.6 Effect of enzyme mass ratio on the degree of hydrolysis

由圖6 可以看出，在底物濃度為3 %、加酶量為4 %、酶解時(shí)間為180 min、酶解溫度為50 ℃、酶解pH值為8 時(shí)。隨著胰蛋白酶用量逐漸增大時(shí)，水解度也隨之增大，當(dāng)胰蛋白酶和堿性蛋白酶的質(zhì)量比為6∶4時(shí)，水解度為13.78%，達(dá)到最大值。當(dāng)胰蛋白酶用量持續(xù)增大時(shí)，水解度開(kāi)始下降，這是因?yàn)榈鞍酌笇?duì)所作用的反應(yīng)底物有嚴(yán)格的選擇性，一種蛋白酶僅能作用于蛋白質(zhì)分子中特定的肽鍵，而不能作用于所有的肽鍵，繼續(xù)增加胰蛋白酶的量不會(huì)對(duì)水解度產(chǎn)生影響。因此，最適的胰蛋白酶和堿性蛋白酶質(zhì)量比為6∶4。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 8.5 軟件的中心組合設(shè)計(jì)[17]，以pH 值、溫度和加酶量為響應(yīng)變量，水解度為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表3 所示，對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，建立提取工藝參數(shù)回歸模型?；貧w方程為：

Y=14.07+0.628 1A+0.355 7B+0.913 2C-0.181 2AB-0.343 7AC-0.431 2BC-0.747 6A2-0.938 5B2-0.793 5C

表3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Center combined design and experimental results

續(xù)表3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Continue table 3 Center combined design and experimental results

優(yōu)化后方差分析表見(jiàn)表4。

表4 優(yōu)化后方差分析表Table 4 Variance analysis after optimization

由表4 可知，二次回歸模型的F 值為22.2，P＜0.000 1，表明模型達(dá)到了極顯著水平；失擬項(xiàng)P =0.111 7＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)差異不顯著，試驗(yàn)無(wú)失擬因素存在，能充分反映實(shí)際情況，回歸模型是適合的；通過(guò)對(duì)模型的可信度進(jìn)行分析，決定系數(shù)R2為0.952 3，說(shuō)明方程擬合度良好。試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男Ｕ禂?shù)為R2Adj為0.909 5，試驗(yàn)結(jié)果有90.95%受試驗(yàn)結(jié)果的影響，因此此結(jié)果可靠。根據(jù)方差分析表中的F 值可得，影響水解度因素的主次順序?yàn)榧用噶浚緋H 值＞溫度，即加酶量對(duì)水解度的影響最大，pH 值次之，最后是溫度。由回歸方程和方差分析還可知，模型中一次項(xiàng)pH 值、加酶量對(duì)水解度的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；模型中交互項(xiàng)溫度和加酶量對(duì)水解度的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）；模型中二次項(xiàng) A2、B2、C2對(duì)水解度的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

水解度的等高線圖與響應(yīng)面3D 圖譜見(jiàn)圖7～圖9。

圖7 溫度和pH 值對(duì)水解度影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.7 Contour diagram and response surface diagram of the influence of temperature and pH on the degree of hydrolysis

圖8 加酶量和pH 值對(duì)水解度影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.8 Contour diagram and response surface diagram of the influence of enzyme amount and pH on the degree of hydrolysis

圖9 加酶量和溫度對(duì)水解度影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.9 Contour diagram and response surface diagram of the influence of enzyme amount and temperature on the degree of hydrolysis

響應(yīng)面坡度越陡峭，說(shuō)明試驗(yàn)條件的改變對(duì)響應(yīng)值越顯著[18-19]，該因素對(duì)水解度的影響越大；反之，則表明因素對(duì)水解度的影響越小[20-21]。由圖可知溫度與加酶量的交互作用對(duì)水解度的影響較大，其次為pH值和加酶量的交互作用，而pH 值與溫度的交互作用最不顯著。

優(yōu)化所得的最佳工藝為：pH 值為8、酶解溫度為50 ℃、加酶量為4%，在此條件下的預(yù)測(cè)值為13.77%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，對(duì)模型優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證。在pH 值為8、酶解溫度為50 ℃、加酶量為4%的條件下進(jìn)行3 次試驗(yàn)。因?yàn)樵囼?yàn)可能存在著誤差，得到的平均水解度為13.85%，與預(yù)測(cè)值相差極小。因此說(shuō)明此模型能較好的預(yù)測(cè)水解度，此優(yōu)化工藝條件可靠。

3 結(jié)論

以甜瓜籽為原料，探究從甜瓜籽中提取多肽的最佳工藝研究，分別研究了底物濃度、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH 值、雙酶質(zhì)量比對(duì)水解度的影響。通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得到了在底物濃度為3%、加酶量為4%、酶解時(shí)間為180 min、酶解溫度為50 ℃、pH 值為 8、雙酶質(zhì)量比為 6∶4 的工藝條件下，水解度達(dá)到最大值13.85%。此試驗(yàn)為甜瓜籽的開(kāi)發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)，為企業(yè)創(chuàng)造社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益提供了途徑，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。