曲亮璠，鄭雅元，曹琳琳，朱敬華，王祥河，4，

（1.天津市工業(yè)微生物研究所有限公司，天津 300462；2.天津量信檢驗認證技術(shù)有限公司，天津 300462；3.天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司，天津 300462；4.天津市工業(yè)微生物企業(yè)重點實驗室，天津 300462）

中國是世界上啤酒生產(chǎn)量最大的國家。啤酒糟是麥芽、啤酒花等釀酒原料經(jīng)過糖化、糊化等一系列工藝后，通過壓濾所殘留的固體物質(zhì)[1-2]，資源豐富且價格低廉。據(jù)文獻報道，啤酒糟中蛋白質(zhì)含量高達20%～30%[3]。由于啤酒糟結(jié)構(gòu)特殊，啤酒糟蛋白被周圍纖維素緊緊包埋住，二者緊密結(jié)合，采用堿提取法[4]、醇提取法[5]、醇-堿提取法[6]、酶提取法[7]直接對其進行處理，粗蛋白的提取率和純度都較低。針對啤酒糟的結(jié)構(gòu)特征，首先將纖維素分解成糖類，再對其中含量較高的蛋白質(zhì)以及多肽等物質(zhì)進行提取、分離、純化，可實現(xiàn)啤酒糟的高效利用。

本文采用纖維素酶處理啤酒糟，水解啤酒糟中的纖維素，通過正交試驗確立了酶解的最佳工藝條件，為廢棄啤酒糟中蛋白質(zhì)的開發(fā)與功能性多肽的制備奠定理論基礎(chǔ)，以期為啤酒加工副產(chǎn)物—啤酒糟的廣泛應用提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒糟來源：雪花啤酒廠。

鹽酸：天津市風船化學試劑科技有限公司；亞甲藍：天津大茂化學試劑廠；酒石酸鉀鈉：天津市科密歐化學試劑有限公司；氫氧化鈉：天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀：天津津科精細化工研究所；上述試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AE200 分析天平、Seven Multi pH 計：梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：上海力辰儀器科技有限公司；GZX-9146 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；FW80 微型高速萬能試樣粉碎機：河北巨輪貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 啤酒糟預處理

將新鮮的啤酒糟原料置于70 ℃烘箱內(nèi)鼓風烘干，將干燥好的樣品用微型高速萬能試樣粉碎機粉碎，再將其過80 目篩儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 還原糖含量測定方法

參照GB 5009.7-2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》直接滴定法測定啤酒糟酶解液中還原糖的含量[8]。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 料液比對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響

準確稱取啤酒糟干粉5.0 g 于6 個250 mL 的三角瓶中，纖維素酶添加量為2.0%，反應初始pH6.0，設(shè)定料液比分別為 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL），溫度50 ℃，在磁力攪拌下酶解4 h，測定啤酒糟酶解液中還原糖的含量。

1.3.3.2 酶解時間對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響

準確稱取啤酒糟干粉5.0 g 于6 個250 mL 的三角瓶中，纖維素酶添加量為2.0%，反應初始pH6.0，料液比 1∶25（g/mL），溫度 50 ℃，在磁力攪拌下分別酶解2、3、4、5、6、7 h，測定啤酒糟酶解液中還原糖的含量。

1.3.3.3 初始pH 值對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響

準確稱取啤酒糟干粉5.0 g 于5 個250 mL 的三角瓶中，纖維素酶添加量為2.0%，設(shè)定反應初始pH 值分別為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，料液比 1∶25（g/mL），溫度50 ℃，在磁力攪拌下酶解4 h，測定啤酒糟酶解液中還原糖的含量。

1.3.3.4 酶解溫度對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響

準確稱取啤酒糟干粉5.0 g 于5 個250 mL 的三角瓶中，纖維素酶添加量為2.0%，反應初始pH6.0，料液比 1∶25（g/mL），將反應溫度分別設(shè)定為 45、50、55、60、65 ℃，在磁力攪拌下酶解4 h，測定啤酒糟酶解液中還原糖的含量。

1.3.3.5 纖維素酶添加量對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響

準確稱取啤酒糟干粉5.0 g 于7 個250 mL 的三角瓶中，設(shè)定纖維素酶添加量分別為0.25 %、0.5 %、1.0 %、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，反應初始pH6.0，料液比 1∶25（g/mL），溫度 50 ℃，在磁力攪拌下酶解 4 h，測定啤酒糟酶解液中還原糖的含量。

1.3.4 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取pH 值、纖維素酶添加量、酶解時間3 個因素，以啤酒糟酶解液中還原糖的含量為指標進行三因素三水平的正交試驗，正交因素與水平見表1。

表1 正交因素與水平表Table 1 Orthogonal experimental factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響

料液比對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響如圖1 所示。

料液比從 1∶15（g/mL）增加到 1∶40（g/mL），酶解液中還原糖的含量為別為 174.22、175.76、174.50、180.10、174.9、182.01 mg。不同料液比條件對酶解過程中產(chǎn)生還原糖的總量不存在顯著性影響。綜合考慮經(jīng)濟因素以及還原糖滴定試驗的便捷性因素，將纖維素酶酶解啤酒糟的料液比定為 1∶25（g/mL）。

2.1.2 酶解時間對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響

酶解時間對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響如圖2 所示。

圖1 料液比對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響Fig.1 Effect of feed liquid-ratio on reducing sugar content in enzymolysis solution of brewer's spent grains

圖2 酶解時間對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響Fig.2 Effect of enzymolysis time on reducing sugar content in enzymolysis solution of brewer's spent grains

由圖2 可知，在反應初始時期，還原糖含量隨酶與底物作用時間的延長而增加，且增長速度較快；酶解4 h 以后，還原糖濃度的曲線逐漸趨于平緩，變化不再明顯。當纖維素酶與啤酒糟作用時間從2 h 延長至7 h，酶解液中還原糖的含量分別為 2.33、2.63、2.82、2.87、2.90、2.90 mg/mL。這可能是由于在酶解反應進行的初期，啤酒糟纖維素濃度較高，纖維素酶與底物的結(jié)合更為充分，隨著反應的持續(xù)進行，受到產(chǎn)物抑制、纖維素酶活相對下降等因素的影響，底物濃度也逐漸趨于穩(wěn)定，溶液中還原糖的含量不再有明顯的變化[9]。因此，將纖維素酶酶解啤酒糟的酶解時間定為4 h。

2.1.3 反應初始pH 值對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響

反應初始pH 值對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響如圖3 所示。

圖3 反應初始pH 值對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響Fig.3 Effect of initial pH value on reducing sugar content in enzymolysis solution of brewer's spent grains

還原糖含量在pH 值4.0～8.0 范圍內(nèi)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當酶解環(huán)境的 pH 值分別為 4、5、6、7、8時，酶解液中還原糖的含量為別為2.93、2.98、2.79、2.65、2.65 mg/mL。不同pH 值環(huán)境下，酶蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象發(fā)生變化，其側(cè)鏈上的氨基酸基團處于不同的解離狀態(tài)，表現(xiàn)出不同的酶活性[10]。在啤酒糟酶解過程中，要控制反應的pH 值，使酶活性中心表現(xiàn)出最大催化活力，提高反應效率，縮短反應時間。因此，將纖維素酶酶解啤酒糟酶解反應的初始pH 值定為5。

2.1.4 酶解溫度對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響

酶解溫度對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響如圖4 所示。

在45 ℃～65 ℃范圍內(nèi)，還原糖含量隨著反應體系溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當溫度為45、50、55、60、65 ℃時，還原糖含量分別為 1.63、2.92、2.72、2.25、2.05 mg/mL。酶在起催化作用時，需要一個特殊的靶向位點才能與目標底物相結(jié)合。溫度將影響蛋白酶分子的空間構(gòu)象以及這些位點的活性高低。通常在較低溫度，酶活力較小，催化速率較低。在低溫下，隨反應溫度的逐漸上升，酶活力也逐漸升高。但反應溫度過高會導致纖維素酶的穩(wěn)定性不佳，影響酶和底物的結(jié)合，最終使酶解液中還原糖濃度下降[11]。因此，將纖維素酶酶解啤酒糟的酶解溫度定為50 ℃。

2.1.5 纖維素酶添加量對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響

纖維素酶添加量對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響如圖5 所示。

圖5 纖維素酶添加量對啤酒糟酶解液中還原糖含量的影響Fig.5 Effect of cellulase addition on reducing sugar content in enzymolysis solution of brewer's spent grains

當纖維素酶的添加量為0.25 %、0.50 %、0.75 %、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時，酶解液中的還原糖含量分別為 1.34、1.59、2.19、2.62、2.98、3.19、3.17 mg/mL。還原糖含量隨著纖維素酶添加量的增加而增加，當添加量超過2.0%時，上升趨勢漸緩，最終達到平衡。酶添加量較少時，纖維素酶為決定性因素；酶添加量較多時，底物含量為決定性因素，此時持續(xù)增加纖維素酶不能提高還原糖含量[12-14]。綜合考慮經(jīng)濟因素以及試驗結(jié)果，將纖維素酶的最適添加量定為2.0%。

2.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取酶添加量（1.5 %、2.0 %、2.5%）、pH 值（4、5、6）、酶解時間（3、4、5 h）3 個條件，采用三因素三水平的正交試驗對纖維素酶酶解啤酒糟的試驗條件進行優(yōu)化。正交試驗結(jié)果如表2 所示，正交試驗方差分析結(jié)果如表3 所示。

通過正交試驗表中的極差值可以看出各因素對纖維素酶酶解作用影響的大小順序為B＞A＞C，即酶添加量＞pH 值＞反應時間。以酶解液中還原糖含量為主要考核指標進行方差分析與極差分析，得到工藝的最佳組合為A3B3C2，因此纖維素酶酶解啤酒糟的最佳條件為：pH6.0，加酶量2.5%，酶解時間4 h。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交試驗方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of orthogonal experiment

3 結(jié)論

在纖維素酶處理啤酒糟的試驗中，酶解時間、反應初始pH 值、酶解溫度和酶添加量對酶解液中還原糖的含量有一定影響，不同料液比對酶解液中還原糖含量的影響不顯著。選取pH 值、酶添加量、酶解時間三個條件，以還原糖含量為指標，通過三因素三水平的正交試驗優(yōu)化纖維素酶酶解啤酒糟工藝，試驗結(jié)果表明，最佳工藝條件為初始pH6.0，酶添加量2.5%，酶解時間4 h。在此條件下，酶解液中的還原糖含量為3.65 mg/mL。