涂丹，張益奇，2，，張燕平，戴志遠(yuǎn)，2

（1.浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310035；2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310035）

羅非魚(yú)是我國(guó)淡水魚(yú)養(yǎng)殖的主要品種之一，2017年產(chǎn)量達(dá)158.46 萬(wàn)噸[1]。目前羅非魚(yú)的加工主要以冷凍魚(yú)片為主，導(dǎo)致大量魚(yú)皮、魚(yú)鱗等下腳料亟待處理[2]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)魚(yú)類(lèi)膠原蛋白的研究熱度逐年增加，主要集中在魚(yú)皮源膠原蛋白[3]、明膠[4]、生物活性肽的提取[5-6]、魚(yú)皮營(yíng)養(yǎng)成分的分析[7]以及魚(yú)皮酶解產(chǎn)物功能特性等方面[8-10]。

膠原蛋白三股螺旋區(qū)域富含潛在的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotension converting enzyme，ACE）抑制活性肽段，但難以被基質(zhì)金屬蛋白酶之外的商品蛋白酶酶解[11]。為了暴露酶切位點(diǎn)，提高酶解效率，促進(jìn)ACE 抑制肽的釋放，通常需要在酶解前對(duì)膠原蛋白進(jìn)行預(yù)處理。膠原ACE 抑制肽制備通常直接以明膠為原料[12]、采用長(zhǎng)時(shí)間熱處理[13]或使用大劑量酸、堿、酶制劑等[14]，但這些處理過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，甚至還會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。汽爆處理是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種綠色、高效的新型物理預(yù)處理方法，該技術(shù)基于短時(shí)間高溫高壓蒸煮，使高壓蒸氣進(jìn)入原料內(nèi)部空隙，然后在極短的時(shí)間內(nèi)爆破釋放，熱能瞬間轉(zhuǎn)化為機(jī)械能從而破壞蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)[15]。前期研究發(fā)現(xiàn)汽爆處理能夠顯著提高魚(yú)皮蛋白質(zhì)的溶出率和酶解效率。汽爆處理通過(guò)改變魚(yú)皮蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其酶解進(jìn)程，因而也就可能會(huì)改變蛋白酶酶解最優(yōu)條件。

目前用于治療高血壓的藥物主要通過(guò)化學(xué)合成，如卡托普利、依那普利等，這些化學(xué)合成藥物降血壓效果雖顯著，但需要長(zhǎng)期服用且會(huì)引起咳嗽、喪失味覺(jué)、腎功能下降等一系列副作用[16]。酶解天然蛋白資源制得的ACE 抑制肽具有安全性高、易吸收、毒副作用小且可長(zhǎng)期使用而備受關(guān)注[17]。本文以羅非魚(yú)魚(yú)皮為原料，以酶解液ACE 抑制率和水解度為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究汽爆處理?xiàng)l件和酶解條件對(duì)羅非魚(yú)魚(yú)皮酶解效率的影響，進(jìn)一步通過(guò)響應(yīng)面法確定了汽爆輔助酶法制備魚(yú)皮降血壓肽的制備工藝，以期為魚(yú)皮生物活性肽的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚(yú)皮：湛江環(huán)球水產(chǎn)有限公司；堿性蛋白酶（alcalase 3.0T，標(biāo)稱(chēng)活力為3.0 AU/g）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；鄰苯二甲醛（o-Phthalaldehyde，OPA）；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）；二硫蘇糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）、馬尿酸（hippuric acid，HA）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate，HHL）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（A6778-.1UN）、抑肽酶、細(xì)胞色素C、碳酸酐酶、桿菌肽等：美國(guó)Sigma 公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：美國(guó) Tedia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

400Y 多功能粉碎機(jī)：永康市鉑歐五金制品有限公司；QBS 200B 汽爆機(jī)：正道生物能源公司；DGG-9123A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DSHZ-300A 旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器：太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Fresco 21 冷凍高速離心機(jī)、EVOLUTION 60S 紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo Fisher 公司；QL-8bb-253旋渦振蕩器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；e2695 高效液相色譜：美國(guó) Waters 公司；K-360 凱氏定氮儀、K-425 快速消解儀：瑞士BUCHI 公司；MLS-3781L 高壓滅菌鍋：日本Panasonic 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 汽爆羅非魚(yú)皮粉的制備

新鮮魚(yú)皮，剪成約5 cm×5 cm 大小，控制料液比0.1 g/mL，于 0.4%NaOH 溶液浸泡 2 h（4 ℃）脫去表面脂肪，流水沖洗3 h，經(jīng)不同汽爆壓力處理一定時(shí)間，烘干，粉碎后冷藏備用。

1.3.2 羅非魚(yú)皮酶解處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的羅非魚(yú)皮于酶反應(yīng)器中→調(diào)節(jié)底物質(zhì)量濃度至0.02 g/mL，55 ℃預(yù)熱10 min→堿性蛋白酶酶解→沸水浴滅酶10 min→8 000 r/min 離心10 min→上清液即為羅非魚(yú)皮酶解液。

1.3.3 酶解單因素試驗(yàn)

以酶底比、酶解時(shí)間、pH 值和酶解溫度作為考察因素，以酶解液水解度和ACE 抑制率作為考察指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3.1 酶底比（E/S）對(duì)羅非魚(yú)皮酶解效果的影響

在酶解溫度50 ℃、pH 8.0、酶解時(shí)間2 h 條件下，設(shè)定不同的酶底比為：0.1 %、0.2 %、0.5 %、1.0 %和2.0%。

1.3.3.2 酶解時(shí)間對(duì)羅非魚(yú)皮酶解效果的影響

在酶解溫度 50 ℃、pH 8.0、酶底比（E/S）0.5%條件下，設(shè)定不同的酶解時(shí)間：30、60、90、120、180 min。

1.3.3.3 酶解pH 值對(duì)羅非魚(yú)皮酶解效果的影響

在酶解溫度50 ℃、酶底比0.1%、酶解時(shí)間2 h 條件下，設(shè)定不同的 pH 值：7.5、8.0、8.5、9.0 和 9.5。

1.3.3.4 酶解溫度對(duì)羅非魚(yú)皮酶解效果的影響

在pH 8.0、酶底比0.1%、酶解時(shí)間2 h 條件下，設(shè)定不同的酶解溫度：45、50、55、60 和 65 ℃。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)Design-Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken Design 設(shè)計(jì)原理，選取酶解溫度（A）、pH 值（B）和酶底比（C）為 3 個(gè)考察因素，ACE抑制率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定羅非魚(yú)皮最佳酶解工藝條件。試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors of response surface test design

1.3.5 水解度的測(cè)定

采用OPA 法，根據(jù)Nielsen 等[18]方法適當(dāng)修改。配制OPA 試劑（現(xiàn)用現(xiàn)配）：將7.620 g 四硼酸鈉和200 mg SDS 用150 mL 去離子水溶解，待完全溶解后加入4 mL溶有160 mg OPA 的乙醇溶液，混勻后再加入176 mg DTT，定容至 200 mL。

取400 μL 羅非魚(yú)皮酶解液，加入到裝有3 mL OPA 的試管中，混勻后靜置2 min，測(cè)定其在340 nm波長(zhǎng)下的吸光度值。以純水作為空白組，100 mg/L 絲氨酸溶液代替樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算魚(yú)皮酶解液中游離氨基含量，并按照公式計(jì)算水解度（hydrolysis degree，HD）：

1.3.6 ACE 抑制率的測(cè)定

參照Wu 等[19]的方法并略作修改。用0.1 moL/L 硼酸緩沖液（pH 值 8.3，含有 0.3 moL/L NaCl）配制反應(yīng)底物N-馬脲酰組氨酰亮氨酸（N-hippuryl-histidylleucine，HHL，6.5 mmoL/L）和 ACE（100 U/L）。取適量魚(yú)皮酶解液稀釋至40 μL，與25 μL ACE 溶液混合并于振蕩器中混勻，37 ℃水浴保溫10 min，然后加入40 μL HHL 溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，37 ℃水浴繼續(xù)保溫 30 min，最后加入85 μL 1 moL/LHCl 溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)溶液經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后，用于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 分析測(cè)定反應(yīng)中產(chǎn)生的HA 的量。

色譜條件：Waters e2695 HPLC 系統(tǒng)和 UV/Vis 檢測(cè)器，SunFire C18 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。上樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)228 nm，流動(dòng)相為乙腈-0.1%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）水溶液（30∶70，體積比），流速為0.8 mL/min。按照公式計(jì)算ACE 抑制率：

式中：A 為用純水代替酶解物參與反應(yīng)條件下所產(chǎn)生的HA 的量；B 為酶解物參與反應(yīng)的條件下所產(chǎn)生的HA 的量。

1.3.7 酶解液相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定

參照黃丹丹等[20]的方法并略作修改。取適量魚(yú)皮酶解液，經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后上樣分析。色譜條件為：采用Waters2695 HPLC 系統(tǒng)和UV/Vis 檢測(cè)器，TSKgel G2000-SWxl（7.8 mm×300 mm，Tosoh）色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，洗脫液為45%乙腈-55%水溶液（0.1%TFA），流速 0.5 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL。相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為：馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（429 Da）、桿菌肽（1 422 Da）、抑肽酶（6.5 kDa）、細(xì)胞色素 C（12.4 kDa）、碳酸酐酶（29 kDa）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），用Duncan 多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（p<0.05）；應(yīng)用Sigmaplot 12.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、作圖，并用Design Expert 8 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 汽爆處理對(duì)羅非魚(yú)皮酶解效果的影響

酶解條件：酶底比0.1%、酶解時(shí)間2 h、pH 8.0 和酶解溫度50 ℃。在相同酶解條件下，以不汽爆處理為對(duì)照組，考察汽爆處理對(duì)魚(yú)皮酶解產(chǎn)物ACE 抑制率和水解度的影響，如圖1 所示。

圖1 汽爆壓力和保壓時(shí)間對(duì)魚(yú)皮酶解產(chǎn)物ACE 抑制率和水解度的影響Fig.1 Effect of steam explosion treatment on ACE inhibition rate and hydrolysis degree of fish skin hydrolysate

由圖1A 可知，與對(duì)照組相比，汽爆處理后魚(yú)皮酶解液的ACE 抑制率和水解度都顯著增大（p＜0.05），而不同汽爆壓力間魚(yú)皮酶解液ACE 抑制率無(wú)明顯差異（p＞0.05）。綜合考慮汽爆樣品的均一性及水解度情況，選擇0.6 MPa 作為汽爆處理壓力。

由圖1B 可知，隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度不斷升高（p＜0.05），而ACE 抑制率呈先升高后降低趨勢(shì)，當(dāng)保壓時(shí)間為0.5 min 時(shí)達(dá)到最高（79.88%），比未處理組提高了27.14%，此時(shí)水解度比未處理組提高了1.8 倍。這可能是因?yàn)槠^(guò)程中，高溫高壓處理以及飽和水蒸汽瞬間泄壓產(chǎn)生的機(jī)械剪切力破壞了魚(yú)皮膠原蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)，使得富含潛在ACE 抑制活性肽段的疏水區(qū)域暴露，有利于蛋白酶水解及ACE 抑制肽段的釋放。然而，過(guò)長(zhǎng)的保壓時(shí)間可能會(huì)使已經(jīng)生成的降血壓活性肽重新聚集或過(guò)度水解，從而導(dǎo)致ACE 抑制率下降[21-22]。因此，選擇汽爆壓力0.6 MPa，保壓時(shí)間0.5 min 進(jìn)行后續(xù)的酶解參數(shù)優(yōu)化。

2.2 酶解參數(shù)的選擇

酶底比、酶解時(shí)間、pH 值和酶解溫度對(duì)羅非魚(yú)皮酶解液ACE 抑制率和水解度的影響如圖2 所示。

圖2 酶底比、酶解時(shí)間、pH 值和酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物ACE 抑制率和水解度的影響Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on ACE inhibition rate and hydrolysis degree of enzymatic hydrolysate

由圖2A 可知，隨著加酶量的增大，水解度不斷升高（p＜0.05），而ACE 抑制率呈先升高再降低的趨勢(shì)，在酶底比為1%時(shí)ACE 抑制率達(dá)到最大值（92.25%）。黃嘉成等[23]用沙丁魚(yú)制備降血壓活性肽時(shí)也發(fā)現(xiàn)水解度過(guò)高反而使ACE 抑制率降低，可能是因?yàn)榧用噶吭酱螅舛仍酱?，同時(shí)釋放的ACE 抑制肽越多；然而加酶量過(guò)多時(shí)，酶分子與底物結(jié)合達(dá)到飽和狀態(tài)，對(duì)酶解液ACE 抑制活性影響減弱[24]。故選用1%作為最適酶底比。

由圖2B 可知，羅非魚(yú)皮酶解液ACE 抑制率隨酶解時(shí)間延長(zhǎng)不斷升高（p＜0.05），120 min 時(shí)達(dá)到最高值（86.23%），進(jìn)一步延長(zhǎng)酶解時(shí)間，酶解液ACE 抑制率變化不明顯（p＞0.05），水解度則隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)不斷上升。酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一些釋放的活性肽段可能在蛋白酶作用下進(jìn)一步水解。故選用120 min 作為羅非魚(yú)皮的最佳酶解時(shí)間。

由圖2C 可知，隨著酶解體系pH 值增大，羅非魚(yú)皮酶解液ACE 抑制率和水解度都逐漸增加，且均在pH 8.5 時(shí)達(dá)到最高值，繼續(xù)增大pH 值，ACE 抑制率和水解度均呈直線下降。在不同pH 值條件下，蛋白質(zhì)的解離狀態(tài)不同，與蛋白酶的接觸位點(diǎn)也不同，進(jìn)而使得魚(yú)皮酶解產(chǎn)物不同[24-25]。故選用8.5 作為最適pH 值。

由圖2D 可知，酶解產(chǎn)物ACE 抑制率和水解度隨酶解溫度的升高也呈先上升后降低的趨勢(shì)，且均在酶解溫度55℃時(shí)達(dá)到最高值。這可能是因?yàn)槊糠N蛋白酶都有其最適溫度范圍，超過(guò)最適溫度后，酶開(kāi)始變性，使得酶解效率降低[26]。綜合以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定汽爆輔助酶解法制備魚(yú)皮降血壓肽的較佳工藝參數(shù)為：汽爆壓力0.6 MPa、保壓時(shí)間1 min、酶底比1%、酶解時(shí)間 2 h、酶解 pH 值 8.5、酶解溫度 55 ℃、pH 8.5。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定底物濃度為2 %、酶解時(shí)間為 2 h，選取酶解溫度（A）、pH 值（B）和酶底比（C）3 個(gè)因素為自變量，以酶解產(chǎn)物ACE 抑制率（Y）為目標(biāo)函數(shù)，根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface experiments

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Design and results of the response surface experiments

對(duì)表2 進(jìn)行回歸分析得到相應(yīng)的二次響應(yīng)面回歸方程：Y=94.53+2.47A-2.19B-1.34C-0.82AB-0.012AC-0.88BC-9.76A2-7.00B2-3.94C2。

顯著性方差分析的結(jié)果如表3 所示。

表3 回歸模型及方差分析結(jié)果Table 3 Regression model and analysis of variance

由表3可知，模型 p＜0.000 1，回歸模型極顯著（p＜0.01）；模型的一次項(xiàng) A、B、C，二次項(xiàng) A2，B2，C2，以及交互項(xiàng) BC 對(duì) ACE 抑制率影響極其顯著（p＜0.01），二次項(xiàng) AB 對(duì) ACE 抑制率影響顯著（p＜0.05），說(shuō)明各因素對(duì)ACE 抑制率的影響存在一定的交互作用，并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系；失擬項(xiàng)p 值不顯著，表明模型擬合程度良好；根據(jù)F 值大小得出各因素對(duì)ACE 抑制率的影響順序?yàn)闇囟龋緋H 值＞酶底比；相關(guān)系數(shù)R2=0.998 0，模型的校正系數(shù)R2Adj=0.995 4，變異系數(shù)CV=0.58%，說(shuō)明不確定因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，ACE 抑制率的變化有99.80%來(lái)源于所選變量，可以用此模型分析和預(yù)測(cè)汽爆輔助酶解制備魚(yú)皮ACE 抑制肽的情況。

根據(jù)回歸方程作響應(yīng)面圖，考察所擬合的響應(yīng)面形狀，分析處理因素對(duì)魚(yú)皮ACE 酶解液抑制活性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 各因子交互作用對(duì)酶解物ACE 抑制率的響應(yīng)曲面圖Fig.3 Response surface analysis of the influence on ACE-inhibitory by each factors

響應(yīng)面圖可以反映各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，以及各因素間交互作用的顯著性，響應(yīng)面圖坡度陡峭或平緩，反映響應(yīng)值對(duì)于試驗(yàn)因素的改變是否敏感。由圖3 可知，各因素中，酶解溫度對(duì)于魚(yú)皮酶解液ACE 抑制活性影響最為顯著，響應(yīng)面坡度陡峭，隨著酶解溫度的升高，ACE 抑制活性呈先增大后減小趨勢(shì)；其次，酶底比響應(yīng)面坡度相比pH 值稍平緩，pH 值比酶底比的影響相對(duì)顯著。這與方差分析結(jié)果一致，即各因素對(duì)ACE 抑制率的影響順序?yàn)槊附鉁囟龋緋H值＞酶底比。

2.3.2 最佳工藝條件的確定

由Design-Expert 分析得最佳酶解條件為：酶解溫度55.66 ℃，pH 值8.42，酶底比0.92%。此條件下ACE抑制率理論值為94.97%。為方便驗(yàn)證，將參數(shù)修正為酶解溫度56 ℃，pH 值8.4，酶底比0.92%，底物濃度2%，酶解時(shí)間2 h，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，得到ACE 抑制率實(shí)際值為93.16%，說(shuō)明模型與實(shí)際情況擬合較好，能夠較好的預(yù)測(cè)出實(shí)際ACE 抑制率。

2.4 羅非魚(yú)皮酶解液相對(duì)分子質(zhì)量分布

在試驗(yàn)所得的最優(yōu)酶解條件下，采用堿性蛋白酶對(duì)汽爆處理前后魚(yú)皮進(jìn)行酶解，酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線如圖4 所示。

圖4 魚(yú)皮酶解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分布圖Fig.4 Gel filtration chromatograms of fish skin hydrolysate treated with alcalase under optimal conditions

由圖4 可知，未處理魚(yú)皮酶解后仍存在大量大分子蛋白質(zhì)，其中4 000 Da 以上約占45.66%。汽爆魚(yú)皮酶解產(chǎn)物主要分布于307 Da～3 323 Da，其中2 000 Da～4 000 Da、1 000 Da～2 000 Da 和 300 Da～1 000 Da 分別占25.34%、21.64%和51.36%，不存在5 000 Da 以上的較大分子。這說(shuō)明汽爆處理可顯著改善魚(yú)皮蛋白的酶解效果，使其降解成小分子肽段。

3 討論

化學(xué)合成降壓藥物對(duì)高血壓療效較好，但會(huì)引起咳嗽、喪失味覺(jué)、腎功能可逆性下降等副作用，天然蛋白源的ACE 抑制肽因其安全性高，易吸收等優(yōu)勢(shì)被廣泛關(guān)注[27]。前人研究發(fā)現(xiàn)多肽C 端含有脯氨酸（Pro）或羥脯氨酸（Hyp）時(shí)具有較高的 ACE 抑制活性[20，28]。膠原蛋白三股螺旋區(qū)域呈（Gly-X-Y）n 周期性排列（其中X、Y 一般分別為Pro 和Hyp），因此膠原蛋白可能富含潛在的ACE 抑制活性肽段。但膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)通過(guò)分子內(nèi)及分子間氫鍵、范德華力、共價(jià)交聯(lián)等作用力相連接，難以被除基質(zhì)金屬蛋白酶之外的商品蛋白酶酶解[11]?，F(xiàn)有的膠原ACE 抑制肽制備工藝通常直接以提取的膠原、明膠為原料[12]、采用長(zhǎng)時(shí)間熱處理[13]或使用大劑量酸、堿、酶制劑等[14]，這些處理過(guò)程繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，甚至還會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此急需尋找適于產(chǎn)業(yè)化的快速、簡(jiǎn)便的膠原蛋白預(yù)處理方法，破壞其致密的三螺旋區(qū)域，提高酶解和ACE 抑制肽釋放效率。

通過(guò)適當(dāng)、適度的熱處理破壞蛋白質(zhì)分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)，使原料蛋白形成利于提取或控制酶解的亞基解離或聚集狀態(tài)，在此基礎(chǔ)上采用商品蛋白酶進(jìn)行限制性酶解，是蛋白質(zhì)物理改性研究中的熱點(diǎn)[29-30]。如Yang等[13]研究了高溫條件下軍曹魚(yú)皮明膠水解液的抗氧化特性；涂丹等[29]發(fā)現(xiàn)采用121 ℃預(yù)處理魚(yú)鱗蛋白，可顯著降低堿性蛋白酶的添加量和酶解時(shí)間；Min 等[31]發(fā)現(xiàn)水熱處理（150 ℃～250 ℃）可完全替代酸、堿、酶水解處理，用于豬皮蛋白水解液的制備。本研究采用汽爆處理羅非魚(yú)皮，高溫、高濕環(huán)境使得膠原蛋白分子間疏水鍵、氫鍵和某些共價(jià)鍵斷裂，使其三股螺旋結(jié)構(gòu)變得松散，從而暴露出更多酶切位點(diǎn)，提高酶解效率。汽爆處理會(huì)改變魚(yú)皮蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其酶解進(jìn)程，因而也就可能會(huì)改變魚(yú)皮蛋白酶解條件，為了提高魚(yú)皮多肽的得率，有必要對(duì)其酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

除原料預(yù)處理技術(shù)外，蛋白質(zhì)酶解效果也與酶解溫度、酶添加量及水解時(shí)間等工藝參數(shù)密切相關(guān)。李敏雄等[32]采用堿性蛋白酶酶解羅非魚(yú)皮制備膠原蛋白肽，酶解最佳工藝條件為：時(shí)間7 h、加酶量7%、溫度60 ℃、pH 值10.38，此條件下羅非魚(yú)皮水解度可達(dá)23%，酶解液分子量集中在180 Da～1 000 Da?？谆莸萚33]先后采用0.2%稀硫酸與1.0%檸檬酸復(fù)合處理，并結(jié)合水提法提取鮭魚(yú)皮明膠，進(jìn)一步選用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解處理，加酶量7%，pH 值8.0，水解時(shí)間2.5 h，此工藝條件下水解度為12.65%。本研究通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化出羅非魚(yú)皮最佳酶解條件為：汽爆壓力0.6 MPa、保壓時(shí)間0.5 min、酶底比0.92 %、酶解時(shí)間2 h、pH 值8.4、酶解溫度56 ℃。與前人研究相比，本研究通過(guò)將魚(yú)皮明膠提取與酶解工藝有機(jī)結(jié)合，簡(jiǎn)化了工藝路線，酶添加量更少，處理效率更高。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用響應(yīng)面優(yōu)化汽爆輔助酶法制備魚(yú)皮蛋白ACE 抑制肽的工藝參數(shù)，并進(jìn)一步分析了酶解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布情況。結(jié)果表明，最優(yōu)的工藝參數(shù)為汽爆壓力0.6 MPa、保壓時(shí)間0.5 min、酶底比0.92%、酶解時(shí)間 2 h、pH 值 8.4、酶解溫度 56 ℃。在此條件下酶解產(chǎn)物ACE 抑制率理論值為94.97%，實(shí)際值為93.16 %，其相對(duì)分子質(zhì)量主要分布于307 Da～3 323 Da。本研究結(jié)果可為汽爆輔助魚(yú)皮酶解制備ACE 抑制肽的實(shí)際生產(chǎn)提供依據(jù)與參考，但本試驗(yàn)只是初步研究了魚(yú)皮ACE 抑制肽粗提物的制備工藝，如何通過(guò)現(xiàn)代分離純化技術(shù)提高其純度和抑制活性有待進(jìn)一步研究；此外，對(duì)于魚(yú)皮經(jīng)汽爆處理后結(jié)構(gòu)變化機(jī)制尚有待深入研究。