吳桂玲，胡麗，馮定坤，邢焰

（黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州 都勻 558000）

藍(lán)莓，又名越橘，屬杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium L.），為常綠灌木。在我國(guó)的四川、重慶，貴州、云南等地已有大面積種植，藍(lán)莓果實(shí)呈藍(lán)色，具有獨(dú)特的風(fēng)味，并且營(yíng)養(yǎng)豐富，但藍(lán)莓果實(shí)價(jià)格昂貴，從而限制了藍(lán)莓的廣泛應(yīng)用[1-2]。藍(lán)莓葉作為藍(lán)莓的一種副產(chǎn)品，通常被丟棄，人們很少對(duì)它進(jìn)行開(kāi)發(fā)和利用，已有研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉中含有總酚、原花青素等化合物[3-4]，同時(shí)還含有大量的黃酮類物質(zhì)[4]。黃酮類化合物具有較好的抗氧化、抗衰老和增加機(jī)體免疫力、降血壓、降血糖、以及抗癌、抗腫瘤和抗突變等功能[5-6]，鑒于藍(lán)莓葉的這些功能，現(xiàn)已有把藍(lán)莓葉烘干作為茶飲用?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物在抑制脂肪酶活性等方面也有一定的效果，目前食品和醫(yī)藥品都在重點(diǎn)開(kāi)發(fā)這個(gè)領(lǐng)域[7-8]。目前提取黃酮類化合物的方法主要有溶劑回流提取法[1，9]、微波輔助提取法[10-11]、超聲輔助提取法[12-14]，超聲輔助提取技術(shù)的高頻振動(dòng)可以將細(xì)胞組織破壞，從而使浸提效果增強(qiáng)，可以使提取效率得到有效提高的同時(shí)將提取時(shí)間縮短，近年來(lái)已很好地用在天然植物有效成分的提取中。

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX，ECl.13.11.12），俗稱脂肪氧化酶、是廣泛存在于哺乳動(dòng)物、植物和微生物中的一類非血紅素鐵蛋白。它專門(mén)催化具有順，順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，在植物體中脂氧合酶將亞油酸和亞麻酸轉(zhuǎn)化成氫過(guò)氧化脂肪酸[15-17]，最后由于其他酶的作用，產(chǎn)生了具有特殊風(fēng)味的酯類物質(zhì)[17]，比如說(shuō)大豆的豆腥味，谷子的陳化[18]，還有研究表明小米中脂氧合酶活性會(huì)影響小米的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性[19]。茶葉中的LOX 主要在綠茶加工的初期起作用，比如茶鮮葉攤放的時(shí)候和殺青的過(guò)程中，LOX會(huì)影響綠茶的湯色、滋味、香氣等品質(zhì)[20]，但是LOX 的殘留量過(guò)大會(huì)引起干茶的變質(zhì)。已有研究發(fā)現(xiàn)茶葉產(chǎn)生陳味主要是由于茶葉中的LOX 引起的[20]，因此，可以在茶葉加工貯藏中盡可能的抑制LOX 的活性而達(dá)到有效貯藏的目的。通過(guò)之前的研究發(fā)現(xiàn)麻竹葉和馬蘭根黃酮類化合物可以抑制毛尖茶葉中的LOX 的活性[8，21]，為了開(kāi)發(fā)更多的天然的LOX 抑制劑，本試驗(yàn)以貴州麻江縣的藍(lán)莓葉為原料，用超聲波輔助提取法提取藍(lán)莓葉中的黃酮類化合物，用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，以都勻毛尖茶葉為原料，提取了脂氧合酶，將藍(lán)莓葉中的黃酮類化合物對(duì)毛尖茶葉脂氧合酶活性進(jìn)行了抑制性試驗(yàn)。充分利用了藍(lán)莓葉資源并為天然抗氧化劑（黃酮類化合物）的提取及其對(duì)LOX 抑制機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)，為尋找天然的LOX 抑制劑及研究茶葉的保鮮奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

藍(lán)莓葉，采自貴州省麻江縣，將藍(lán)莓葉洗凈置于DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥后取出用高速萬(wàn)能粉粹機(jī)粉粹得最終樣品；毛尖茶葉采自都勻團(tuán)山；蕓香葉苷（含量≥95.0%）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫20、純度為99.9%的亞油酸：阿拉??；pH 6.3 的麥?zhǔn)暇彌_溶液：黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院301 實(shí)驗(yàn)室自配，其他化學(xué)試劑均為分析純。

TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9030A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA1204B 電子分析天平：上海精密儀器儀表有限公司；FW200A 高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；ps-20 超聲波清洗機(jī)：深圳市得康科技有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水真空泵：鄭州予華儀器制造有限公司；GTR21-1高速冷凍離心機(jī)：上海趙迪生物科技有限公司；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品在溫度100 ℃下干燥直至恒重，準(zhǔn)確稱取樣品0.020 0 g，先加適量無(wú)水甲醇，使蘆丁完全溶解，再加無(wú)水乙醇，定容到100 mL，得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為0.20 mg/mL。

從預(yù)先配好的100 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別量取0.00、1.00、2.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL 依次置于 25 mL的容量瓶中，加入1.00 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液，充分搖勻，靜置6 min；再加入1.00 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的硝酸鋁溶液，再次搖勻后，靜置5 min；最后加入10.00 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的氫氧化鈉溶液，搖勻，用無(wú)水乙醇定容，放置15 min 至20 min，在最大吸收波長(zhǎng)500 nm 處測(cè)定溶液的吸光度A，以試劑作空白對(duì)照，記錄數(shù)據(jù)，用A 為縱坐標(biāo)，c 為橫坐標(biāo)繪圖，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=10.874 12X+0.008 6，相關(guān)系數(shù) R2＝ 0.999 5。

1.2.2 藍(lán)莓葉黃酮類化合物的提取和含量測(cè)定

稱取處理過(guò)的藍(lán)莓葉粉末3 份，每份0.50 g，分別置于3 個(gè)錐形瓶中，分別進(jìn)行超聲波輔助提取，將3 份提取液過(guò)濾，分別將濾液于5 000 r/min 離心10 min，取5 mL 上清液稀釋至50 mL，備用。取適量待測(cè)液于25 mL 容量瓶中，按照1.2.1 測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的方法，將藍(lán)莓葉總黃酮溶液置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，測(cè)定溶液的吸光度A。根據(jù)1.2.1 得到的回歸方程，根據(jù)吸光度A 可以計(jì)算出藍(lán)莓葉總黃酮的含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

對(duì)藍(lán)莓葉黃酮類化合物提取條件所涉及到的4 個(gè)因素：乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時(shí)間研究單因素的影響，每個(gè)因素選取3 個(gè)水平來(lái)進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，得出最佳提取條件。1）乙醇濃度設(shè)定為40%、50%、60%、70%、80%、90%；2）料液比設(shè)定為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）；3） 提取溫度設(shè)定為30、40、50、60、70 ℃；4）提取時(shí)間設(shè)定為 10、20、30、40、50 min。

1.2.4 超聲輔助提取工藝因素水平的確定

參照前期單因素試驗(yàn)的結(jié)果，超聲波輔助提取藍(lán)莓葉中總黃酮的試驗(yàn)主要考察乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時(shí)間（D）4 個(gè)因素，每個(gè)因素選3 個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)，研究4 個(gè)因素對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的綜合影響，最佳提取條件的確定是將藍(lán)莓葉總黃酮提取率定為考察指標(biāo)。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 超聲輔助提取正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The different levels of the factors in orthogonal test with ultrasound-assisted extraction of flavonoids

1.2.5 都勻毛尖茶葉中LOX 的提取

參照王海濱等[22]從茶鮮葉中分離提純LOX 的方法，略作修改。將新鮮的毛尖茶葉晾干后剪碎，稱取10 g 剪碎的茶葉，準(zhǔn)確量取200 mL 的麥?zhǔn)暇彌_液與茶葉混勻2 min 后將混合液過(guò)濾，取濾液低溫高速離心5 min，取上清液，向上清液中加入固體（NH4）2SO4使溶液的飽和度為30%，在冰箱中靜置4 h。再次將溶液低溫高速離心5 min。取上清液并向其中加入（NH4）2SO4使溶液的飽和度達(dá)到70%。將溶液放入冰箱中靜置24 h 左右，將溶液低溫離心10 min，進(jìn)行過(guò)濾，將沉淀用麥?zhǔn)暇彌_溶液進(jìn)行溶解，溶液即為茶葉的粗酶液，放入冰箱冷藏備用。

1.2.6 茶葉脂氧合酶活性測(cè)定

底物的制備：先配制10 mL 硼酸鹽緩沖溶液，使其pH 值為9.0，濃度為0.2 mol/L，然后取吐溫200.25 mL分散在緩沖溶液中，邊搖動(dòng)溶液邊滴加亞油酸0.27 mL，充分搖勻，使它們混合均勻，再加入一定體積的濃度為1 mol/L 的NaOH 溶液，邊加邊搖動(dòng)，直到使整個(gè)溶液澄清，將溶液pH 值調(diào)到9.0，定容到500 mL 作為底物備用。

用分光光度法測(cè)定茶葉脂氧合酶的酶活性[23]。以溫度 50 ℃，pH 值為 6.3，15 mL 反應(yīng)體系，其中底物為亞油酸鈉，以最大吸收波長(zhǎng)234 nm 處的吸光度值每分鐘增加0.001 個(gè)單位定義為一個(gè)酶活單位。具體操作如下：15 mL 反應(yīng)體系中含粗酶液1.0 mL，亞油酸鈉母液250 μL，以及緩沖液。在水浴中反應(yīng)，水浴溫度為50 ℃，反應(yīng) 2 min 時(shí)測(cè) 1 次 234 nm 處的 OD 值，反應(yīng)4 min 時(shí)再測(cè)1 次，觀察兩次OD 值的變化，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)。以234 nm 處的吸光度值每分鐘增加0.001個(gè)單位定義為一個(gè)酶活單位。

酶活單位計(jì)算公式：A=1 000×[OD4min-OD2min]/2

式中：A 為酶活性單位；OD4min為反應(yīng)4 min 的OD值；OD2min為反應(yīng) 2 min 的 OD 值。

1.2.7 茶葉脂氧合酶的活性抑制性測(cè)定

在15 mL 反應(yīng)體系中，加入已稀釋了的酶液1.0 mL，亞油酸鈉底物250 μL，再加入藍(lán)莓葉黃酮類化合物，黃酮類化合物分別取 0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL，全部混勻后用pH 值為6.3 的緩沖溶液補(bǔ)足至15 mL，將反應(yīng)體系在溫度為50 ℃的恒溫水浴中反應(yīng)2 min，在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定234 nm 處的吸光度，再繼續(xù)反應(yīng)2 min，再次測(cè)定234 nm 處的吸光度。黃酮類化合物對(duì)LOX 的抑制率按下式計(jì)算：抑制率/%=[（A0-A1）/A0]× 100

式中：A0為無(wú)抑制劑時(shí)的酶活力；A1為加抑制劑時(shí)的酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響

在提取溫度40 ℃、提取時(shí)間20 min、料液比1∶30（g/mL）條件下，研究當(dāng)改變乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，藍(lán)莓葉總黃酮提取率的變化結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

由圖1 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從40%開(kāi)始逐漸增大時(shí)，相應(yīng)的藍(lán)莓葉總黃酮提取率逐漸升高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，總黃酮提取率最大，當(dāng)超過(guò)70%再升高時(shí)，總黃酮提取率反而降低，因此選擇60%、70%、80%為正交試驗(yàn)中乙醇體積分?jǐn)?shù)的3 個(gè)水平。

2.1.2 料液比對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度設(shè)定為40 ℃、提取時(shí)間定為20 min，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，研究當(dāng)料液比不同時(shí)，藍(lán)莓葉總黃酮提取率有什么變化，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2 可知，當(dāng)當(dāng)溶劑用量逐漸增大即料液比逐漸減小時(shí)，藍(lán)莓葉總黃酮提取率也相應(yīng)增大，在料液比 1∶40（g/mL）時(shí)，總黃酮提取率最高，之后隨著料液比的的減小，總黃酮提取率開(kāi)始降低，因此選擇1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）為正交試驗(yàn)中料液比的 3 個(gè)水平。

2.1.3 提取溫度對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響

在固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶40（g/mL）、提取時(shí)間20 min 條件下，研究當(dāng)超聲提取溫度不同時(shí)，藍(lán)莓葉總黃酮提取率的變化結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖2 料液比對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

圖3 提取溫度對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

當(dāng)提取溫度升高時(shí)，藍(lán)莓葉總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)達(dá)到一個(gè)最大提取率后再升高溫度反而降低了，由試驗(yàn)結(jié)果可知，總黃酮提取率最大時(shí)的溫度為60 ℃，因此選擇50、60、70 ℃為正交試驗(yàn)中提取溫度的3 個(gè)水平。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響

選取乙醇體積分?jǐn)?shù) 70%、料液比 1∶40（g/mL）、提取溫度60 ℃時(shí)，研究超聲時(shí)間改變時(shí)，藍(lán)莓葉總黃酮提取率的變化結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4 可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮提取率增大，到30 min 時(shí)達(dá)到最大值，30 min 之后其提取率反而降低，因此正交試驗(yàn)中超聲時(shí)間這個(gè)因素選擇20、30、40 min 3 個(gè)水平。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids from blueberry leaves

2.2 超聲輔助提取正交試驗(yàn)

根據(jù)前面單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合研究乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和超聲時(shí)間（D）4 個(gè)因素對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見(jiàn)表2。

表2 超聲輔助提取藍(lán)莓葉總黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of the orthogonal test for ultrasonic extraction of total flavonoids from blueberry leaves

由表2 可知，4 個(gè)因素對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響大小順序?yàn)橐掖紳舛龋咎崛囟龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間，可知對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率影響較大的因素是乙醇濃度，對(duì)總黃酮提取率影響較小的因素是提取時(shí)間。優(yōu)化的提取工藝條件為A1B3C3D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比 1∶50（g/mL），提取溫度 70 ℃，提取時(shí)間30 min，按優(yōu)化工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)3 次平行試驗(yàn)，得到藍(lán)莓葉總黃酮的平均提取率為9.56%，比正交試驗(yàn)表中的黃酮提取率都高，說(shuō)明驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可靠。

2.3 茶葉脂氧合酶活性測(cè)定及藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)茶葉LOX的活性抑制作用

按照1.2.6 的LOX 活性測(cè)定方法測(cè)得茶葉脂氧合酶的酶活力A=33.9。按照1.2.7 的LOX 活性抑制測(cè)定方法，結(jié)果顯示在水浴溫度為50 ℃，pH 值為6.3 條件下，藍(lán)莓葉黃酮類化合物可以抑制茶葉LOX 的活性，并且隨著總黃酮濃度的增大，抑制性也逐漸增強(qiáng)，結(jié)果見(jiàn)圖5。藍(lán)莓葉總黃酮：IC50=22.3 μg/mL。

圖5 藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)茶葉LOX 的抑制性Fig.5 Inhibition of total flavonoids from blueberry leaves on LOX in tea

通過(guò)研究，發(fā)現(xiàn)密蒙花中的黃酮類化合物對(duì)大豆脂氧合酶有一定的抑制作用[7]，麻竹葉黃酮類化合物也可以抑制毛尖茶葉中的LOX 活性[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)矢車菊素、矮牽牛素和飛燕草素可能對(duì)黑豆LOX 有一定的抑制性[24]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)都勻毛尖茶葉中的LOX 的也有一定的抑制作用。

3 結(jié)論

以乙醇為提取溶劑，超聲波輔助提取藍(lán)莓葉總黃酮，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，以總黃酮提取率為考核指標(biāo)，在給定的試驗(yàn)條件下，4 個(gè)因素對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮提取率的影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛龋咎崛囟龋玖弦罕龋咎崛r(shí)間，確定的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %，料液比1∶50（g/mL），提取溫度 70 ℃，提取時(shí)間 30 min，按優(yōu)化條件得到藍(lán)莓葉總黃酮的平均提取率為9.56%。相比于常規(guī)提取方法，超聲波輔助提取法操作簡(jiǎn)單，還可節(jié)省提取時(shí)間，降低成本，還提高了總黃酮的提取效率。LOX 的存在會(huì)使食品發(fā)生色、香、味的劣變，會(huì)對(duì)綠茶的湯色、滋味、香氣等品質(zhì)產(chǎn)生很重要的影響，還會(huì)降低食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，因此發(fā)現(xiàn)LOX 的天然抑制劑至關(guān)重要，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓葉中黃酮類化合物也可以抑制毛尖茶葉LOX 活性。這為尋找天然的LOX抑制劑及研究茶葉的保鮮奠定了一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)還能充分的利用藍(lán)莓葉，避免資源的浪費(fèi)。