陳夢(mèng)迪，楊梅，馬儷珍，任小青

（天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

魚(yú)肉中肌漿蛋白占總蛋白含量的20%～50%[1]，長(zhǎng)期以來(lái)人們認(rèn)為肌漿蛋白會(huì)干擾肌原纖維蛋白的凝膠化，因此，為了提高淡水魚(yú)糜制品品質(zhì)，通常采用漂洗的方式去除魚(yú)糜中的肌漿蛋白，但這樣做會(huì)導(dǎo)致大量的肌漿蛋白流失到漂洗水中，不僅造成蛋白質(zhì)資源的大量浪費(fèi)，而且使周邊水環(huán)境富營(yíng)養(yǎng)化，產(chǎn)生赤潮等環(huán)境問(wèn)題[2-4]。因此，對(duì)大量的魚(yú)糜漂洗水進(jìn)行處理，有效回收其中的蛋白質(zhì)，不僅可減少蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)，提高水產(chǎn)品附加值，同時(shí)使廢水循環(huán)利用成為可能，順應(yīng)了水產(chǎn)品清潔化、高值化生產(chǎn)的趨勢(shì)。

近年來(lái)，越來(lái)越多的科研人員關(guān)注于如何將肌漿蛋白從魚(yú)糜漂洗水中進(jìn)行回收及其應(yīng)用，徐律等[5]利用等電沉淀法回收魚(yú)糜漂洗水中蛋白質(zhì)，其回收率可高達(dá)83.33%；Huang 等[6]等究了間斷性加熱對(duì)魚(yú)糜漂洗水中蛋白質(zhì)的回收效果，發(fā)現(xiàn)70 ℃為蛋白質(zhì)凝聚的最佳溫度；Bourtoom 等[7]利用調(diào)節(jié)pH 值處理魚(yú)糜漂洗水以達(dá)到高的蛋白質(zhì)回收率。Yongsawatdigul 和Piyadhammaviboon 等[8]發(fā)現(xiàn)羅非魚(yú)肌漿蛋白的添加破壞了蜥蜴魚(yú)魚(yú)糜的凝膠，Jafarpour 和Gorczyca 等[9]報(bào)道了鯉魚(yú)肌漿蛋白能夠增強(qiáng)魚(yú)糜的質(zhì)地。但有關(guān)肌漿蛋白的微觀結(jié)構(gòu)及功能特性研究報(bào)道相對(duì)較少。

本試驗(yàn)研究不同回收方法對(duì)肌漿蛋白微觀結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，回收方法包括：35 ℃真空濃縮冷凍干燥、35 ℃真空濃縮-調(diào)節(jié) pH 值冷凍干燥、65 ℃真空濃縮冷凍干燥、65 ℃真空濃縮-調(diào)節(jié)pH 值冷凍干燥和調(diào)節(jié)pH 值冷凍干燥5 種方法，以期根據(jù)回收蛋白質(zhì)的功能特性不同，從而篩選出對(duì)應(yīng)的回收方法，為魚(yú)糜漂洗水中蛋白質(zhì)回收及副產(chǎn)物利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚(yú)（2 kg～2.5 kg）：天津市西青區(qū)紅旗農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，20 min 內(nèi)運(yùn)送至天津農(nóng)學(xué)院食品加工車(chē)間。

溴酚藍(lán)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；甘油、Tris-HCl、甘氨酸：北京索萊寶科技有限公司；酒石酸鉀鈉：哈爾濱市萬(wàn)泰生物藥品公司；2，4-二硝基苯肼：上海申翔化學(xué)試劑有限公司；尿素：天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：上海藍(lán)技科技發(fā)展有限公司；牛血清蛋白：上海生物生工有限公司；甲叉雙丙烯酰胺、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉：美國(guó)Sigma 公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器

酸度計(jì)（PB-10）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；高速剪切分散乳化機(jī)（FA25）：德國(guó)弗魯克公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1800）：日本島津公司；差示掃描量熱儀（DSC200F3）：德國(guó)耐馳公司；冷凍離心機(jī)（ST40R）：德國(guó) Theromo Scientific 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A）：上海亞榮生化儀器廠；低溫泵（DW-5/20）：上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；飛納臺(tái)式掃描電子顯微鏡（Phenom G2 pro）：荷蘭飛納公司；傅立葉變換紅外光譜儀（Spectrum65）：美國(guó) Perkin Elmer 公司；電泳儀（MINI 4）：美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚(yú)糜漂洗水制備

將新鮮鰱魚(yú)宰殺后采肉、攪碎，添加4 ℃的蒸餾水漂洗，且魚(yú)肉與水的質(zhì)量比為1∶3，用高速剪切分散乳化機(jī)在 15 000 r/min 勻漿 2min，4 ℃下 10 000×g 離心后過(guò)濾，得到的濾液為魚(yú)糜漂洗水，用于回收肌漿蛋白。

1.3.2 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1.3.2.1 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.2.2 傅里葉紅外光譜的測(cè)定

參考喻亞麗等[10]的方法。在干燥的條件下，取凍干的肌漿蛋白樣品1 mg，經(jīng)KBr 壓片，用Spectrum65 紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行紅外掃描。掃描范圍為1 700 cm-1～1 000 cm-1。

1.3.2.3 掃描電鏡的測(cè)定

將不同處理方法得到的肌漿蛋白樣品凍干，隨后取樣品均勻涂抹在試樣盤(pán)上，通風(fēng)櫥風(fēng)干，進(jìn)行噴金鍍膜處理，噴射儀工作距離50 mm，噴射時(shí)間3 min～5 min，鍍膜厚度大約20 nm。然后將試樣盤(pán)從鍍膜機(jī)中取出、放在掃描電鏡儀內(nèi)，調(diào)整束斑位置和放大倍數(shù)、聚焦清晰后獲取微觀結(jié)構(gòu)圖像。

1.3.2.4 總巰基含量的測(cè)定

總巰基含量的測(cè)定參考李鵬的方法[11]，吸取0.5 mL濃度為2 g/L 的蛋白質(zhì)溶液置于2.5 mL 含8 mol/L 尿素的Tris-甘氨酸和0.02 mL 的Ellman’s 試劑（每1 mL Tris-甘氨酸中加 4 mg 5，5’-二硫基-2-對(duì)硝基苯甲酸）的離心管中。加入 20 μL 5，5’-二硫基-2-對(duì)硝基苯甲酸（5，5'-dithio bis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）計(jì)時(shí)反應(yīng)25 min 后，立即在412 nm 下進(jìn)行吸光度的測(cè)定?？値€基濃度計(jì)算使用摩爾消光系數(shù)13600 cm/（mol/L），被溶解的蛋白質(zhì)含量使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。公式如下：

式中：A412為 412 nm 下的吸光度；1.36×104為摩爾吸光系數(shù)；106為摩爾基礎(chǔ)單位到mmol/L 和蛋白質(zhì)從mg 到g 的單位轉(zhuǎn)換；C 為考馬斯亮藍(lán)法在595 nm 下測(cè)得的蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

1.3.2.5 表面疏水性的測(cè)定

蛋白質(zhì)表面疏水性的測(cè)定參照Chelh 等[12]的方法。將蛋白質(zhì)溶于pH 為7.0，20 mmol/L 的磷酸緩沖液中得到蛋白質(zhì)溶液濃度為5 mg/mL。準(zhǔn)確吸取1 mL 的蛋白質(zhì)溶液與 200 μL 的溴酚藍(lán)（1 mg/mL）混勻，室溫（25 ℃）下攪拌 10 min，然后 10 000×g 離心 15 min，將得到的上清液稀釋10 倍后，于595 nm 下測(cè)定溶液的吸光值 A，以磷酸緩沖液（pH 7.0，20 mmol/L）加 200 μL的溴酚藍(lán)（bromophenol blue，BPB）為空白樣品。計(jì)算公式為：

1.3.2.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

采用濁度法測(cè)定乳化性和乳化穩(wěn)定性[13]使用0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液配制5 mg/mL 蛋白質(zhì)溶液，2 mL 大豆油與8 mL 蛋白質(zhì)溶液于高速剪切分散乳化機(jī)下10 000 r/min 均質(zhì)2 min。分別于 0 min 和 10 min 從底部迅速取出 50 μL，用 0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）稀釋一百倍后，于500 nm 下測(cè)定吸光值。乳化性計(jì)算公式如下：

式中：A500為樣品吸光值；F 為樣品稀釋倍數(shù)，即100；C 為蛋白質(zhì)濃度，即 0.005 g/mL；φ 為油相占體積比，即0.25。乳化穩(wěn)定性計(jì)算公式如下：

式中：A0為 0min 吸光值；A10為靜止 10min 吸光值。

1.3.2.7 差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）測(cè)定

測(cè)定采用差示掃描量熱法，稱(chēng)取10 mg～15 mg，密封在鋁盒中并放入樣品池，以空盒做參比，保護(hù)氣為氮?dú)?，流量?0 mL/min，升溫速率為10 ℃/min，溫度范圍 10 ℃～200 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同回收方法得到的魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白的傅里葉紅外光譜（fourier infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）分析

不同回收方法得到的魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白的紅外光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 不同回收方法得到的魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白的紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of sarcoplasmic proteins in fish mince wash water obtained by different recovery methods

酰胺Ⅰ帶（1 600 cm-1～1 700 cm-1）主要來(lái)自 C=O的伸縮振動(dòng)，并且通常提供關(guān)于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)信息[14]。由圖1 可知，不同回收方法都改變了肌漿蛋白的結(jié)構(gòu)，只是不同回收方法導(dǎo)致肌漿蛋白的變性程度不同，從而導(dǎo)致FT-IR 在酰胺I 帶表現(xiàn)出的強(qiáng)度不同。當(dāng)魚(yú)糜漂洗水經(jīng)過(guò)35 ℃濃縮時(shí)，導(dǎo)致其輕微變性，因此LT 組在酰胺I 帶表現(xiàn)出的強(qiáng)度低于crude 組；當(dāng)魚(yú)糜漂洗水僅經(jīng)過(guò)65 ℃濃縮及調(diào)節(jié)pH 值處理后，變性程度增加，因此HT 組和pH 組在酰胺I 帶表現(xiàn)出的強(qiáng)度低于Crude 組和LT 組，酰胺I 帶強(qiáng)度的降低表明了肌漿蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)。Yongsawatdigu 等[15]在研究調(diào)節(jié)pH處理馬鞭子肌漿蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)pH 值使肌漿蛋白在酰胺I 帶的強(qiáng)度降低與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

Crude、LT、LT-pH、HT、HT-pH 以及 pH 組在酰胺Ⅰ帶的吸收峰分別為 1 625、1 624、1 622、1 623、1 622、1 623 cm-1，其中經(jīng)過(guò)加熱濃縮結(jié)合調(diào)節(jié)pH 值處理的肌漿蛋白的酰胺I 帶特征振動(dòng)頻率低于其他幾組?？赡苁且?yàn)檎{(diào)節(jié)pH 值后，在極性環(huán)境中，受到氫鍵或者電子基團(tuán)的作用，酰胺I 帶特征振動(dòng)頻率會(huì)向低波數(shù)方向移動(dòng)。

不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響見(jiàn)表1。

表1 不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響Table 1 Effects of different recovery methods on the secondary structure of sarcoplasmic protein infish mince wash water

酰胺I 帶各處理組表現(xiàn)出的強(qiáng)度不同對(duì)應(yīng)著其二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。波數(shù)在1 650 cm-1～1 658 cm-1處峰面積代表α-螺旋的含量，波數(shù)在1 610 cm-1～1 640 cm-1處峰面積代表β-折疊的含量，波數(shù)在1 640 cm-1～650 cm-1處峰面積代表無(wú)規(guī)則卷曲的含量，波數(shù)在1 660 cm-1～1 695 cm-1處峰面積代表β-轉(zhuǎn)角含量[16]。對(duì)不同回收方法得到的魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白的傅里葉紅外光譜酰胺I 譜峰進(jìn)行傅里葉自轉(zhuǎn)積譜分析，得到自轉(zhuǎn)積譜和相應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象指認(rèn)，結(jié)合Origin 里的Savitsk-Golay 函數(shù)得到各個(gè)峰區(qū)對(duì)應(yīng)的面積，即為各結(jié)構(gòu)的含量。由表1 可知，crude 組的肌漿蛋白中α-螺旋的結(jié)構(gòu)含量為24.20%，β-折疊的結(jié)構(gòu)含量為36.81%，LT 組和HT 組的α-螺旋以及β-折疊的結(jié)構(gòu)含量均低于crude 組，加熱條件下α-螺旋含量降低代表蛋白質(zhì)分子展開(kāi)程度增加。

crude 組無(wú)規(guī)則卷曲含量為26.38%，β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)含量為12.60%，其他幾組無(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)含量均高于crude 組，且經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)pH 值處理過(guò)的肌漿蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)含量均略高于未經(jīng)調(diào)節(jié)pH 值處理過(guò)的肌漿蛋白。正如張紅娟等[17]在研究pH 值對(duì)11S 球蛋白結(jié)構(gòu)與凝膠性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，pH 值為4.15 時(shí)11S 球蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲含量比pH 值為7.5 時(shí)含量多，而α-螺旋的結(jié)構(gòu)含量為0。

結(jié)合圖1 和表1 可知，不同回收方法得到的肌漿蛋白結(jié)構(gòu)均有所變化，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由正常的α-螺旋和β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角，使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越來(lái)越松散，疏水基團(tuán)暴露從而使其表面活性增強(qiáng)，變性后的蛋白質(zhì)有利于蛋白質(zhì)的交聯(lián)。

2.2 不同回收方法得到的魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白的掃描電鏡分析

不同回收方法得到的肌漿蛋白的掃描電鏡圖像見(jiàn)圖2。

圖2 不同回收方法得到的魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白的微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Microstructure diagram of sarcoplasmic protein in fish mince wash water obtained by different recovery methods

由圖可以看出，crude 組蛋白質(zhì)樣品（圖2 a～b）蛋白質(zhì)表面比較平整，大部分呈塊狀稍有褶皺和微小的孔洞；LT 組蛋白質(zhì)樣品（圖2 c～d）由大片的塊狀變成小塊狀，褶皺增加表面微小的孔洞增多，LT-pH 組蛋白質(zhì)樣品（圖2 e～f）整體還是呈現(xiàn)塊狀結(jié)構(gòu)，然而其表面結(jié)構(gòu)與crude 組和LT 組樣品相比變得粗糙，細(xì)小的孔洞增多；HT 組蛋白質(zhì)樣品（圖2 g～h），與 crude 組和LT 組相比表面褶皺增加，結(jié)構(gòu)粗糙，與LT-pH 相比細(xì)小孔洞減少，大縫隙變多；HT-pH 組蛋白質(zhì)樣品（圖2 i～j），與HT 組相比表面褶皺變少，孔洞密集呈蜂窩狀；pH 組蛋白樣品（圖2 k～l）表面結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，出現(xiàn)大的孔洞呈絮狀。根據(jù)以上結(jié)果可知，加熱濃縮導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，濃縮溫度由35 ℃增加到65 ℃，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集從而出現(xiàn)更多的褶皺；調(diào)節(jié)pH 值導(dǎo)致蛋白質(zhì)白結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度的孔洞，說(shuō)明熱處理和pH 值處理可破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使其從有序的結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o(wú)序的結(jié)構(gòu)，這也對(duì)應(yīng)著前文表1 的結(jié)果，經(jīng)過(guò)不同的處理，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由正常的α-螺旋和β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角，使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)越來(lái)越松散。

2.3 不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白總巰基含量的影響

不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中蛋白質(zhì)的總巰基含量的影響如見(jiàn)圖3。

圖3 不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中蛋白總巰基含量的影響Fig.3 Effects of different recovery methods on the content of total sulfhydryl groups in fish mince wash water

巰基和二硫鍵是蛋白質(zhì)中影響其功能特性的重要官能團(tuán)。溫度、壓力以及pH 的改變都會(huì)引起二硫鍵的斷裂和巰基的變化，從而引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。由圖3 可知，與crude 組相比，LT 組的肌漿蛋白總巰基含量顯著提高（P＜0.5），由 50.36 nmol/mg 提升到147.36 nmol/mg；而當(dāng)升高濃縮溫度時(shí)，HT 組表現(xiàn)出的蛋白質(zhì)總巰基含量低于LT 組，說(shuō)明在35 ℃濃縮的狀態(tài)下，漂洗水中肌漿蛋白總巰基含量增加，而當(dāng)濃縮溫度為65 ℃時(shí)，漂洗水中肌漿蛋白總巰基含量顯著降低。這可能是因?yàn)榻?jīng)受較高溫度的肌漿蛋白的構(gòu)象變化導(dǎo)致SH 基團(tuán)的暴露并通過(guò)氧化SH 基團(tuán)或二硫化物交換形成二硫鍵，此結(jié)果與Sankar 等[18]的研究結(jié)果一致。

當(dāng)魚(yú)糜漂洗水經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)極端pH 值處理時(shí)，肌漿蛋白的總巰基含量顯著低于crude 組（P＜0.5），而LT和HT 兩組經(jīng)過(guò)極端pH 值處理后，其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)總巰基含量也顯著降低，說(shuō)明經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)極端pH 值處理后，可降低魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白總巰基含量，這可能是因?yàn)檎{(diào)節(jié)pH 值的過(guò)程中肌漿蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，導(dǎo)致巰基暴露氧化，從而使總巰基含量降低。Wang 等[19]等研究指出當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)pH 酸性調(diào)回中性時(shí)，蛋白質(zhì)不能完全重折疊使得其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，巰基暴露從而使巰基更容易氧化成二硫鍵。

2.4 不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白表面疏水性的影響

不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白的表面疏水性的影響如見(jiàn)圖4。

圖4 不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白表面疏水性的影響Fig.4 Effects of different recovery methods on the hydrophobicity of sarcoplasmic protein surface in fish mince wash water

蛋白質(zhì)的表面疏水性反映的是蛋白質(zhì)分子表面疏水性氨基酸的相對(duì)含量，以溴酚藍(lán)可結(jié)合的疏水性氨基酸殘基的量來(lái)表示[20]。由圖4 可知，肌漿蛋白經(jīng)過(guò)加熱和調(diào)節(jié)pH 值處理都能增加其表面疏水性。LT 組蛋白質(zhì)輕微變性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露疏水區(qū)域?qū)е卤砻媸杷耘ccrude 組相比顯著增加（P＜0.5），HT組比LT 組處理劇烈，從而使蛋白質(zhì)變性程度增強(qiáng)，因此HT 組的表面疏水性顯著高于LT 組和crude 組（P＜0.5）。pH 組的表面疏水性為21.46 μg 顯著高于crude組的表面疏水性 74.73 μg（P＜0.5），這可能是由于表面帶有凈正電荷的蛋白質(zhì)在靜電排斥的作用下使蛋白質(zhì)分子展開(kāi)，從而導(dǎo)致包裹在其內(nèi)部的疏水基團(tuán)和疏水殘基暴露在表面，進(jìn)而使得表面疏水性增加，此結(jié)果與王偉等[21]的研究結(jié)果一致。HT 組的表面疏水性為57.15 μg 低于pH 組的表面疏水性，可是是因?yàn)樵?5 ℃濃縮在這一過(guò)程中，通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)不斷聚集，使暴露的疏水區(qū)域減少，導(dǎo)致其表面疏水性低于pH 組。

2.5 不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of different recovery methods on emulsification and emulsion stability of sarcoplasmic protein in fish mince wash water

當(dāng)魚(yú)糜漂洗水經(jīng)過(guò)不同回收方法處理時(shí)，肌漿蛋白分別發(fā)生不同程度的變性，處理越劇烈變性程度越高，因此使其乳化性與乳化穩(wěn)定性發(fā)生不同程度的升高。當(dāng)魚(yú)糜漂洗水經(jīng)過(guò)35 ℃濃縮時(shí)，肌漿蛋白輕微變性，其乳化性為8.16 m2/g 與crude 組相比差異顯著（P<0.05），HT 組乳化性為 11.49 m2/g，乳化性與 crude 組和LT 組相比乳化性差異顯著（P<0.5）。熱處理會(huì)改善蛋白質(zhì)的乳化性可能是由蛋白質(zhì)變性引起的，通過(guò)升高溫度破壞改變蛋白質(zhì)構(gòu)象（范德華相互作用、氫鍵和靜電力）從而暴露一些疏水殘基，改變蛋白質(zhì)分子的親水親油平衡從而提高乳化性與乳化穩(wěn)定性。經(jīng)pH值處理后，蛋白結(jié)構(gòu)解折疊，疏水性氨基酸側(cè)面暴露增加，從而使肌漿蛋白乳化性能大大提升，使LT-pH組和HT-pH 組的乳化性與LT 和HT 組的乳化性相比分別提升了 3.82 m2/g 和 2.61 m2/g，而 pH 組與 crude 組相比乳化性由5.19 m2/g 提升到17.65 m2/g，乳化穩(wěn)定性由30.33%提升高53.59%。Jiang 等[22]發(fā)現(xiàn)大豆蛋白再經(jīng)過(guò)pH 變換處理后，保持了原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)和整體的緊湊性，但失去了一些三級(jí)結(jié)構(gòu)體，這些結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致乳化性的顯著改善，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

2.6 不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白熱穩(wěn)定性的影響

不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白熱變性溫度的影響見(jiàn)圖6。

圖6 不同回收方法對(duì)魚(yú)糜漂洗水中肌漿蛋白熱穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of different recovery methods on thermal stability of sarcoplasmic protein in fish mince wash water

蛋白質(zhì)的熱變性過(guò)程可以看作是溫度的動(dòng)態(tài)函數(shù)。蛋白質(zhì)在熱變性過(guò)程中，吸收熱量時(shí)由一個(gè)有序狀態(tài)變?yōu)闊o(wú)序狀態(tài)，破壞了分子內(nèi)的相互作用，致使多肽鏈展開(kāi)。當(dāng)達(dá)到蛋白質(zhì)的變性溫度時(shí)，在熱分析圖譜上會(huì)出現(xiàn)一個(gè)吸熱峰，由圖6 可看出所有回收蛋白質(zhì)都有一個(gè)主要的吸收峰，代表了各組回收蛋白質(zhì)的熱變性溫度點(diǎn)。crude 組蛋白質(zhì)熱變性溫度為37.41 ℃，表明該使蛋白質(zhì)在較低的溫度下就會(huì)發(fā)生熱變性。LT 組蛋白質(zhì)熱變性溫度為75.52 ℃，HT 組蛋白質(zhì)熱變性溫度為77.81 ℃，魚(yú)糜漂洗水在加熱濃縮處理時(shí)，肌漿蛋白已經(jīng)在35 ℃和65 ℃的條件下發(fā)生了結(jié)構(gòu)的改變，在用差示量熱掃描法測(cè)定其熱變性溫度時(shí)，比未經(jīng)處理過(guò)的肌漿蛋白crude 組溫度要有所升高。李曉龍等[23]也發(fā)現(xiàn)熱處理會(huì)引起蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)的等發(fā)生變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集交聯(lián)最終引起功能特性的改變。肌漿蛋白經(jīng)pH 值調(diào)節(jié)回收，表面攜帶了大量的凈正電荷，需要更高的溫度去克服靜電作用，因此與LT 組相比，經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)pH 值的肌漿蛋白過(guò)出現(xiàn)了熱變性溫度有所升高的現(xiàn)象，而HT 組回收蛋白質(zhì)已經(jīng)由于加熱濃縮導(dǎo)致變性，從而使pH 組蛋白質(zhì)變性溫度低于HT 組蛋白質(zhì)的變形溫度。此結(jié)果與Tadpitchayangkoon 等[24]研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

5 種回收蛋白質(zhì)與crude 相比均使肌漿蛋白在酰胺I 帶的波數(shù)向短波移動(dòng)，對(duì)其所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)也有所影響，使α-螺旋和β-折疊的含量呈下降趨勢(shì)，而無(wú)規(guī)則卷曲的頷聯(lián)呈上升趨勢(shì)；對(duì)應(yīng)著微觀結(jié)構(gòu)可發(fā)現(xiàn)，crude 組蛋白質(zhì)表面結(jié)構(gòu)平整，隨著回收方法的不同其表面結(jié)構(gòu)破壞程度不同，這與其無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量是對(duì)應(yīng)的，肌漿蛋白的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量越高，微觀結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重。

LT、LT-pH 和HT 回收可使肌漿蛋白的總巰基含量升高，其中LT 組升高的最多，從50.36 nmol/mg 提升到147.36 nmol/mg；這幾種回收方法均可使肌漿蛋白的表面疏水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性有所提升，其中pH 組提升的最多，表面疏水性由21.46 μg 提升到74.73 μg，乳化性由 5.19 m2/g 提升到 17.65 m2/g，乳化穩(wěn)定性由30.33%提升高53.59%；HT-pH 熱變性溫度提升了最多，由37.41 ℃提高到108.28 ℃。