吳鋒鋒 王國榮 高宏梁 顏瑞健 蔣雪生 胡斌 唐蟠 金明超

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是將人工關(guān)節(jié)假體通過外科手術(shù)植入體內(nèi)，以此重建關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與功能。人工關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療終末期膝關(guān)節(jié)炎最有效的手術(shù)方法之一。隨著人口老齡化加劇，人工關(guān)節(jié)置換初次與翻修數(shù)量逐漸增加[1]。然而，術(shù)后假體周圍感染是目前人工關(guān)節(jié)置換術(shù)失敗和翻修的首要原因[2]。目前常用的鈦及鈦合金等人工假體材料缺乏足夠的抗菌活性。細(xì)菌一旦附著于假體表面后，就會形成生物膜并導(dǎo)致長期感染[3]。因此，迫切需要尋找可有效防止或減少假體周圍感染的替代材料[4]。鈦及合金材料表面制備的二氧化鈦 ( TiO2) 納米管仿生涂層具有良好的抑菌性能，已成為目前骨科及牙科材料學(xué)領(lǐng)域最具前景的材料之一[5]。TiO2納米管的微孔結(jié)構(gòu)為抗菌劑的有效負(fù)載提供了良好的載體。報道將萬古霉素與銀離子負(fù)載于 TiO2納米管，顯示具有良好的抑菌效果[6]。此外，研究證實負(fù)載慶大霉素的 TiO2納米管不僅能促進(jìn)骨細(xì)胞的活性而且能顯著降低葡萄球菌的黏附，有效減少感染和炎癥發(fā)生率[7]。

聚六亞甲基胍 ( polyhexamethylene guanidine，PHMG ) 是一類具有廣譜、高效、快速、持久抑菌的新型環(huán)保高分子聚合物抗菌劑[8-9]。研究證實 PHMG 對臨床常見的六類抗生素耐藥細(xì)菌均有顯著的抑菌效果[10]。雖然已有 PHMG 在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用探索研究，但迄今尚無將 PHMG 應(yīng)用到骨科人工關(guān)節(jié)假體材料以探究其抑菌性能的研究工作。本研究從體外實驗和體內(nèi)實驗兩個層面綜合評估了負(fù)載 PHMG 的 TiO2納米管的抑菌性能，并初步探討其抗菌機制，為具有良好抗菌性能人工關(guān)節(jié)假體材料的開發(fā)提供新的思路。

材料與方法

一、負(fù)載 PHMG 的 TiO2 納米管制備

1. TiO2納米管制備：將 ( 1.0±0.1 ) mm 厚的鈦箔 ( 99.2%，Alfa Aesar ) 裁剪成 ( 10±1 ) mm× ( 14± 1 ) mm 鈦箔，將 φ3.175 mm 鈦棒 ( 99.99%，Alfa Aesar ) 裁剪成長度 ( 15±1 ) mm 的鈦棒，經(jīng)氫氟酸酸洗后分別用 1000 目、2000 目、3000 目、5000 目、7000 目砂紙打磨，依次經(jīng)丙酮，無水乙醇清洗處理后待用。陽極氧化反應(yīng)裝置采用 250 ml 燒杯作為反應(yīng)容器，恒壓直流電源 ( IT6834，艾德克斯電子有限公司 ) 供電，采用兩電極體系。陽極接用于制備納米管陣列的純金屬鈦箔或鈦棒，陰極接鉑電極，兩電極相對，距離保持在 5 cm，將兩個相對的電極固定于一塊四氟板上，置于裝有 100 ml 電解液的 250 ml 燒杯中，分別設(shè)定電壓為 10 V、15 V、 20 V、25 V、30 V，在室溫下進(jìn)行反應(yīng) 4 h，分別用乙醇和去離子水各超聲清洗 5 min，干燥獲得含 TiO2納米管覆層的鈦箔或鈦棒。有機電解液體系配制：稱取 0.0335 g ( 0.3 wt% ) 溶于 2.2 ml ( 2 wt% ) 去離子水中，待其溶解后，再加入 98 ml 乙二醇，磁力攪拌器攪拌 10 min。

2. TiO2納米管結(jié)構(gòu)表征：將制備含 TiO2納米管覆層的鈦箔、鈦棒分別用導(dǎo)電膠帶固定于 SEM 載物臺上，真空噴金 30 s 后，置于掃描電鏡 ( SU8010，日本日立公司 ) 下進(jìn)行觀察，納米管直徑在電鏡拍照時直徑測量，每個樣品測量至少 5 次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

二、抗菌劑 PHMG 負(fù)載及載藥率測試

將含 Ti O2納米管覆層的鈦箔鈦棒清洗干凈后，置于真空下，室溫脫氣 24 h 后，分別稱取其質(zhì)量記為初始質(zhì)量 M1 ( 單位 mg )，然后用移液槍量取 100 μl 的 25% 的 PHMG 溶液均勻添加到含 Ti O2納米管覆層的鈦箔鈦棒上，待表面干燥后重新均勻滴加 100 μl 的 25% 的 PHMG 溶液，重復(fù)操作 5 次。然后將鈦箔的另一面翻上，鈦棒滾動 180° 后，重復(fù)以上操作 5 次。磷酸鹽緩沖溶液 ( phosphate buffered saline，PBS ) 沖洗鈦箔鈦棒表面，干燥稱取其質(zhì)量記為載藥后質(zhì)量 M2 ( 單位 mg )。其載藥率按如下公式計算：載藥率 %＝(載藥后質(zhì)量 M2-初始質(zhì)量 M1 ) / 250×100%。

三、抗菌劑 PHMG 緩釋實驗

將負(fù)載 PHMG 的含 TiO2納米管覆層的鈦箔鈦棒浸沒于 1.5 ml PBS ( pH＝7.4 ) 中，密封后置于恒溫震蕩器中，溫度設(shè)置 37 ℃，震蕩速率為 80 rpm。于固定時間點 ( 15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、5 天與 7 天 ) 每次量取 100 μl，同時添加 100 μl 新鮮 PBS。將取出的 100 μl 稀釋后，應(yīng)用紫外線分光光度計測定 PHMG 的濃度并根據(jù) PHMG 的紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其含量，藥物的累積釋放率按如下公式：累積釋放率 %＝每個時間點的累積釋放質(zhì)量 / 負(fù)載的總質(zhì)量×100%。以累積釋放率為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)繪制 PHMG 的累積緩釋曲線。

四、負(fù)載 PHMG 的 TiO2 納米管覆層的體外抑菌實驗

分別將純金屬鈦箔、Ti O2納米管鈦箔和負(fù)載 PHMG 的 Ti O2納米管鈦箔與 1 ml 金黃色葡萄球菌 ATCC 29213 懸液 ( 107CFU / ml ) 在 37 ℃ 下共培養(yǎng) 1 h 和 4 h。將鈦箔取出分別用 3 ml 無菌的 PBS 清洗 3 遍，采用 SYTO 9 在黑暗環(huán)境下染色 20 min，使用激光掃描共聚焦顯微鏡 ( CLSM；FV1000D；奧林巴斯，東京，日本 ) 觀察。選取電鏡下 200 μm× 200 μm 的視野范圍使用 Image Pro Plus 軟件 ( 版本：6.0 ) 進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。同時，將鈦箔在室溫下用 2.5% 戊二醛固定 1 h 后用 3 ml 的 0.1 M 無菌 PBS 洗滌。隨后將鈦箔在不同濃度的乙醇 ( 75%，80%，90%，95% 和 100% ) 中逐漸脫水，室溫干燥 30 min，通過 DC 磁控管濺射鍍金，使用掃描電鏡在 10 kV 的加速電壓下進(jìn)行觀察。

五、負(fù)載 PHMG 的 TiO2 納米管覆層的體內(nèi)抑菌實驗

1. 實驗動物：感染實驗的 20 只新西蘭大白兔購自杭州余杭科聯(lián)兔業(yè)專業(yè)合作社，許可證號：SCXK ( 浙 ) 2017-0004，合格證號：1808090007。抑菌實驗 24 只新西蘭大白兔購自杭州余杭科聯(lián)兔業(yè)專業(yè)合作社，許可證號：SCXK ( 浙 ) 2017-0004 合格證號：1811140028。飲用水為超純水。實驗動物房使用許可證號為 SYXK ( 浙 ) 2015-0008，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度范圍 20 ℃～25 ℃，相對濕度范圍 40%～ 70%。實驗前在動物房適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周。動物飼料購自江蘇協(xié)同生物工程有限責(zé)任公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn) GB14924.3-2010《實驗動物配合飼料營養(yǎng)成分》。

2. 感染實驗：用 3% 戊巴比妥鈉于耳緣靜脈麻醉后，將新西蘭大白兔仰臥位固定于操作臺上，固定頭部、四肢，手術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)行剃毛、消毒、鋪無菌巾單準(zhǔn)備，定位于右下肢膝關(guān)節(jié)位置，采用膝關(guān)節(jié)正中髕旁內(nèi)側(cè)入路，逐層分離松解軟組織至可向外側(cè)推開髕骨，顯露髁間位置，依次采用 22 G、 20 G、18 G、16 G、14 G 的注射器針頭穿刺進(jìn)入股骨髓腔，逐漸進(jìn)行擴(kuò)髓處理。將 20 只新西蘭大白兔分成 5 組，每組 4 只，其中 4 組各注入 0.1 ml 不同濃度金黃色葡萄球菌菌液 ( 106CFU / ml；107CFU / ml； 108CFU / ml；109CFU / ml ) 后，分別將純金屬鈦棒完全逆行插入新西蘭大白兔右側(cè)股骨髓腔，沖洗切口并逐層縫合后，碘酒局部皮膚消毒，第 5 組作為對照組 ( 注入 0.1 ml 生理鹽水 )，探尋造成感染的最佳細(xì)菌濃度。

術(shù)后新西蘭大白兔按常規(guī)飼料分籠喂養(yǎng)，每天觀察新西蘭大白兔進(jìn)食水及雙側(cè)膝關(guān)節(jié)情況 ( 包括關(guān)節(jié)切口愈合情況，是否有局部膝關(guān)節(jié)腫脹，是否有局部紅腫情況，是否有竇道形成流膿出現(xiàn)，觀察雙側(cè)膝關(guān)節(jié)的負(fù)重及活動度情況 )。術(shù)后第 14 天，拍攝 X 線片觀察股骨，空氣注射法處死新西蘭大白兔，切開離斷實驗新西蘭大白兔的雙側(cè)髖關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)，取出雙側(cè)股骨。

3. 抑菌實驗：將 24 只新西蘭大白兔分成 3 組，每組 8 只，擴(kuò)髓處理后，注入 0.1 ml 108CFU / ml 的金黃色葡萄球菌菌液 ( 濃度依據(jù)感染實驗獲得 )，分別將純金屬鈦棒、TiO2納米管鈦棒和負(fù)載 PHMG 的 TiO2納米管鈦棒完全逆行插入新西蘭大白兔右側(cè)股骨髓腔，沖洗切口并逐層縫合后，碘酒局部皮膚消毒。新西蘭大白兔術(shù)后飼養(yǎng)同上。

4. 細(xì)菌劃痕實驗：用 2 ml 無菌生理鹽水將鈦棒和骨髓組織反復(fù)吹吸震蕩后作為微生物培養(yǎng)原液，稀釋 10 倍后取出 0.1 ml 培養(yǎng)原液于無菌的血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃ 培養(yǎng) ( 24±2 ) h，培養(yǎng)后觀察平板上的所有菌落，觀察鈦棒及骨髓上菌體在平板上的定植情況；挑取特征性的菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后涂片做革蘭染色鑒定是否為金黃色葡萄球菌。細(xì)菌劃痕實驗送樣至千麥醫(yī)學(xué)檢驗所進(jìn)行，同時進(jìn)行菌種 鑒定。

5. 骨髓及鈦棒洗脫液細(xì)菌分離：在超凈工作臺用 2 ml 無菌生理鹽水將鈦棒和骨髓組織反復(fù)吹吸震蕩作為洗脫液。將接種環(huán)在酒精燈上燃燒滅菌，冷卻 10 s 后蘸取鈦棒和骨髓洗脫液，在事先制備的血平板上劃線，劃線為 Z 字形以分離稀釋洗脫液。劃痕完成后翻轉(zhuǎn)平板，37 ℃ 倒置培養(yǎng) ( 24±2 ) h。部分樣品中菌落生長較緩慢，適當(dāng)延長培養(yǎng)時間來形成可見單菌落劃痕，此時血平板可能會變褐色屬于正常現(xiàn)象。

6. 菌種鑒定：在超凈工作臺中用滅菌槍頭挑出 3 個特征性菌落，分別接種到 3 ml LB 液體培養(yǎng)基中，于搖床上 37 ℃，180 rpm 過夜培養(yǎng)。革蘭染色鏡檢觀察特征菌落染色結(jié)果。

7. HE 染色：股骨脫鈣處理后，制作石蠟切片。脫蠟復(fù)水后，用蘇木精和伊紅染液進(jìn)行染色。

8. 掃描電鏡：樣本于 2.5% 戊二醛磷酸緩沖液中過夜固定，1% 鋨酸后固定 1 h，2% 醋酸鈾水溶液染色 30 min。依次用 50%、70%、90% 酒精脫水 15 min，100% 酒精脫水 20 min。臨界點干燥并噴金，置于掃描電鏡下觀察并拍照。

結(jié) 果

一、TiO2 納米管制備與表征

為了獲得高度有序和一致的 TiO2納米管，本研究中使用了一系列電壓設(shè)置，如 10 V、15 V、20 V、 25 V 和 30 V，進(jìn)行陽極氧化反應(yīng)。分別于表面電鍍 4 h 后，采用掃描電鏡對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。不同電壓下 TiO2納米管的特性如圖 1 所示。表征結(jié)果顯示 Ti O2納米管具有光滑的表面結(jié)構(gòu)，均勻且組織良好，并且其孔徑隨陽極氧化電壓增加而增加。隨著陽極氧化電壓從 10 V 增加到 30 V，TiO2納米管的孔徑范圍從 ( 24.0±3.2 ) nm 到 ( 73.5±7.8 ) nm。

分析顯示在 10 V 和 15 V 的電壓下，Ti O2納米管的孔徑非常小，可能對 PHMG 的負(fù)載有很大的阻力。在 25 V 和 30 V 電壓下形成的 TiO2納米管雖具有較大的孔徑，但表面鍍層不夠牢固，在隨后的超聲清洗中會部分丟失。因此綜合考慮，筆者發(fā)現(xiàn)在 20 V 電壓下形成的 Ti O2納米管孔徑大小為 ( 46.4± 5.9 ) nm，鈦箔 TiO2納米管長度為 300～500 nm，鈦棒 TiO2納米管長度為 500～1000 nm，納米管均勻一致，具有更牢固的表面涂層，因此選取該納米管進(jìn)行進(jìn)一步分析 ( 圖 2a )。

二、抗菌劑 PHMG 負(fù)載與緩釋

使用 100 μl 25% PHMG 水溶液進(jìn)行 10 次重復(fù)載藥，能夠?qū)?( 3.46±0.40 ) mg 或 ( 1.27±0.28 ) mg 的 PHMG 負(fù)載到鈦箔或鈦棒 Ti O2納米管上。體外 PHMG 緩釋研究表明，與早期報道一致，藥物 PHMG 也存在兩個釋放階段：初始突釋釋放和相對緩慢釋放。如圖 2b 所示，最初的 20 h 內(nèi)，85% 以上的 PHMG 從 TiO2納米管鈦棒上被釋放，隨后在 7 天內(nèi)逐步釋放完成 ( 約占總加載量 95% 左右 )。同時，80% 以上的 PHMG 在最初的 20 h 內(nèi)從 TiO2納米管鈦箔上被釋放，隨后在 7 天內(nèi)逐步釋放完成 ( 約占總加載量 90% 左右 )。因此，PHMG 從 TiO2納米管上的初始突釋釋放為早期抑制細(xì)菌入侵提供了安全屏障，并防止植入部位的細(xì)菌污染。

三、體外抑菌實驗

圖 1 不同電壓陽極氧化下制備的 TiO2 納米管的電鏡結(jié)構(gòu)特征Fig.1 SEM images of top views of TiO2 nanotubes after anodization under different voltages. Bar, 20 nm and 50 nm

用 1 ml 金黃色葡萄球菌懸浮液 ( 108CFU / ml ) 在 24 細(xì)胞培養(yǎng)板中于 37 ℃ 下培養(yǎng)純鈦箔，TiO2納米管鈦箔和 PHMG-TiO2納米管鈦箔來評估其體外抗菌性能。收集純金屬鈦箔、Ti O2納米管鈦箔和 PHMG-TiO2納米管鈦箔，用無菌 PBS 洗滌，并在黑暗中用 SYTO 9 染色 20 min。使用 CLSM (×200 放大倍率 ) 觀察金黃色葡萄球菌 ( 綠色 ) 的分布。結(jié)果表明，和純金屬鈦箔與 TiO2納米管鈦箔相比，PHMGTi O2納米管鈦箔可有效減少培養(yǎng)物中金黃色葡萄球菌的黏附 ( 圖 3a )，其細(xì)菌數(shù)量顯著減少 (P＜0.001 ) ( 圖 3b )。結(jié)果表明，純金屬鈦箔組與 TiO2納米管鈦箔組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

另外，在掃描電鏡下觀察到金黃色葡萄球菌黏附在鈦箔表面上。附著在 PHMG-Ti O2納米管鈦箔上的金黃色葡萄球菌明顯少于純金屬鈦箔 ( 圖 4a ) 與 TiO2納米管鈦箔上 ( 圖 4b ) 附著的金黃色葡萄球菌，而且 PHMG-TiO2納米管鈦箔表面上大多數(shù)金黃色葡萄球菌形態(tài)受到損害 ( 圖 4c )。

四、體內(nèi)抑菌實驗

圖 2 a：20 V 電壓下陽極氧化制備的 Ti O2 納米管的電鏡結(jié)構(gòu)特征；b：藥物 PHMG 體外緩釋結(jié)果 ( 黑色曲線為 TiO2 納米管鈦箔藥釋結(jié)果，紅色曲線為 TiO2 納米管鈦棒藥釋結(jié)果 )Fig.2 a: SEM images of top and bottom views of TiO2 nanotubes after anodization at voltage of 20 V; b: The in vitro release curve of PHMG from PHMG-TiO2 nanotubes. The black and red lines represent the release curve of PHMG from PHMG-TiO2 nanotubes slice and rod, respectively. Bar, 50 nm

使用血瓊脂平板和其它臨床評估方法評估新西蘭大白兔植入物的感染。瓊脂平板接種結(jié)果表明，PHMG-Ti O2納米管鈦棒植入組的新西蘭大白兔未感染金黃色葡萄球菌 ( 圖 5 )。發(fā)現(xiàn)純金屬鈦棒植入組的新西蘭大白兔感染率為 100%，而 TiO2納米管鈦棒植入組的新西蘭大白兔感染率為 87.5% ( 8 只新西蘭大白兔感染 7 只 )。體內(nèi)抑菌實驗表明，PHMGTiO2納米管鈦棒植入組對感染金黃色葡萄球菌具有很強的抑菌性能。純鈦棒植入組和 Ti O2納米管鈦棒植入組出現(xiàn)感染的原因可能是由于細(xì)菌黏附在植入物表面進(jìn)而形成生物膜，因而從源頭抑制細(xì)菌黏附于植入物表面對預(yù)防植入物引起的感染至關(guān)重要。相反，PHMG-Ti O2納米管鈦棒植入組具有很強的體內(nèi)抑菌性能，可能由于其植入后起初數(shù)小時的突釋釋放以及隨后的緩慢釋放作用。

使用 HE 染色技術(shù)對新西蘭大白兔股骨進(jìn)行臨床病理分析，分析結(jié)果如圖 6 所示。從圖像中可看出，植入純金屬鈦棒組和植入 Ti O2納米管鈦棒組在股骨髓腔內(nèi)具有相似的病理變化，骨髓腔內(nèi)的有核細(xì)胞明顯減少，網(wǎng)狀結(jié)締組織結(jié)構(gòu)消失，腔內(nèi)可見大量纖維增生，大量多核破骨細(xì)胞以及骨質(zhì)壞死。而 PHMG-TiO2納米管鈦棒植入組的骨髓腔內(nèi)可見大量有核細(xì)胞、脂肪和結(jié)締組織組成的正常骨髓，病變較其它組明顯減輕。

圖 3 體外抑菌性能 a：與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng) 1 h 與 4 h 下黏附于純金屬鈦箔、TiO2 納米管鈦箔以及 PHMG-TiO2 納米管鈦箔上的金黃色葡萄球菌經(jīng) SYTO 9 染色后的共焦激光掃描結(jié)果；b：在 200 μm × 200 μm 視野下共培養(yǎng) 1 h 與 4 h 黏附在純金屬鈦箔，TiO2 納米管鈦箔以及 PHMG-TiO2 納米管鈦箔上的金黃色葡萄球菌的數(shù)量Fig.3 The in vitro antibacterial ability a: The CLSM images of S. aureus colonies stained with SYTO 9 after 1 and 4 hours of culture with pure titanium foil, TiO2 nanotube foil and PHMG-TiO2 nanotube foil, respectively. The live bacteria appeared in green; b: The number of S. aureus colonies adhering to the surface of pure titanium foil, TiO2 nanotube foil and PHMG-TiO2 nanotube foil within 200 μm × 200 μm fi eld of CLSM view. Bar: 50 μm

圖 4 附著純鈦箔、TiO2 納米管鈦箔以及 PHMG-TiO2 納米管鈦箔上金黃色葡萄球菌的電鏡結(jié)構(gòu)特征 a～b：細(xì)菌在純鈦箔和 TiO2 納米管鈦箔上顯示正常圓球狀形態(tài) ( 白色箭頭所示 )；c：在 PHMG-TNTs 上金黃色葡萄球菌的形態(tài)受損 ( 紅色箭頭所示 ) Fig.4 SEM morphology images of S. aureus on the surface of pure titanium foil, TiO2 nanotube foil and PHMG-TiO2 nanotube foil a - b: The bacteria showed a normal morphology ( white arrow ) on cp-Ti and TNTs; c: The morphology of S. aureus was impaired ( red arrow ) on PHMGTNTs (C). Bar, 2 μm and 50 μm

圖 5 體內(nèi)抑菌性能Fig.5 The in vivo antibacterial ability

圖 6 病理組織學(xué)分析Fig.6 Histopathologic analysis

討 論

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染一直是骨科領(lǐng)域最為關(guān)注的問題之一，導(dǎo)致感染因素的多樣性及不可控性使得預(yù)防感染一直是骨科手術(shù)的一大挑戰(zhàn)，由于傳統(tǒng)抗生素治療而產(chǎn)生的耐藥性等一系列問題使這一挑戰(zhàn)更加復(fù)雜化[11]。假體周圍一旦感染，細(xì)菌黏附并定植于假體表面，形成生物膜結(jié)構(gòu)[3]。生物膜的出現(xiàn)可使細(xì)菌逃避宿主免疫機制的攻擊以及抗菌劑的殺菌作用，且生物膜內(nèi)細(xì)菌嚴(yán)重耐藥，導(dǎo)致慢性感染經(jīng)久不愈，且會抑制骨細(xì)胞等黏附而影響骨長入[12]。因此防控假體表面細(xì)菌聚集和黏附，對于人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍感染的防治具有重要意義。本研究中，掃描電鏡觀察結(jié)果顯示在 PHMG-TiO2納米管鈦箔表面上大多數(shù)金黃色葡萄球菌形態(tài)受到損害，呈不規(guī)則的扁平狀 ( 圖 4c )。同時，電鏡下未觀察到明顯的細(xì)菌定植后形成的生物膜樣結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，PHMG-TiO2納米管具有良好的抑菌效果。

鈦及鈦合金因具有良好的生物相容性，而成為常用的人工關(guān)節(jié)假體材料。Antoci 等成功將鈦合金表面與萬古霉素共價結(jié)合，發(fā)現(xiàn)體外可有效抑制金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的黏附、聚集，對細(xì)菌的多次感染亦有抗菌效能，可有效抑制細(xì)菌生物膜的形成[13]。通過改變現(xiàn)有生物材料的表面可賦予其新的性能，比如局部載藥功能，促進(jìn)材料的生物相容性等特點[14]。對鈦及合金材料表面進(jìn)行陽極氧化或酸蝕處理制備出 Ti O2納米管具有納米級的空間三維結(jié)構(gòu)、極大的比表面積、高度有序且大小均一的微孔結(jié)構(gòu)，可為抗菌劑的有效負(fù)載及緩慢釋放提供良好的載體。因此，在人工關(guān)節(jié)鈦假體材料表面制作抗菌納米涂層，是鈦金屬表面抗菌改性的研究熱點[15-18]。目前應(yīng)用于鈦金屬表面負(fù)載的抗菌劑主要有三類：有機抗菌劑抗生素；無機抗菌劑如銀、鋅、銅等金屬離子，次氯酸鈉無機化合物[19]；抗菌多肽如人 β 防御素系列[20-21]，研究顯示均有一定抗菌效果。PHMG 是一種新型環(huán)保型抗菌劑，在醫(yī)療衛(wèi)生的消毒、抗菌等方面有很大的潛在應(yīng)用價 值[22]，其應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，如消毒濕巾、漱口液[23]、滴眼液[24]等。PHMG 抗菌效果突出，生物學(xué)毒性低，是假體表面抗菌涂層的優(yōu)質(zhì)材料[25-27]。本研究使用金黃色葡萄球菌感染新西蘭大白兔造模，通過對 TiO2納米管進(jìn)行 PHMG 負(fù)載，首次成功制備出負(fù)載 PHMG 的 TiO2納米管人工關(guān)節(jié)假體材料，并對其抑菌性能進(jìn)行研究。

體外實驗顯示，負(fù)載 PHMG 的 Ti O2納米管覆層結(jié)構(gòu)材料可有效減少金黃色葡萄球菌的黏附與定植。體內(nèi)實驗證實，負(fù)載 PHMG 的 TiO2納米管覆層結(jié)構(gòu)材料可有效降低新西蘭大白兔下肢金黃色葡萄球菌感染發(fā)生率及嚴(yán)重程度，說明此材料具有良好的抑菌性能。負(fù)載 PHMG 的 TiO2納米管的良好抗菌性能，將為骨科、心內(nèi)科、牙科等多科室抗菌內(nèi)植入物的開發(fā)提供一定的借鑒研究價值。然而這一材料對人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染的其它常見細(xì)菌及真菌是否同樣具有抑菌性能，以及負(fù)載 PHMG 抗菌劑是否能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，仍需進(jìn)一步研究。