陳 萍，張水木，雷 航，王鈺箐，陳 宇，王學(xué)鋒，蔡曉紅

[1.北京中醫(yī)藥大學(xué)廈門醫(yī)院（廈門市中醫(yī)院）輸血科，福建 廈門 361009；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床輸血科，上海 200025；3.上海市嘉定區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，上海 201821]

臨床實(shí)驗(yàn)室中ABO 血型正反定型不符的原因多樣[1-3]，使血型鑒定及輸注血液選擇的難度增加，影響著臨床輸血安全。血清學(xué)檢測可以全面了解ABO 抗原抗體存在情況，但對于檢測中出現(xiàn)的正反定型不符的原因分析，血清學(xué)的方法往往存在局限性，易受多種因素影響，如疾病狀態(tài)、近期輸血史、缺乏家系無法分析遺傳性等。在這些方面，基因檢測可彌補(bǔ)血清學(xué)的不足，為血清學(xué)鑒定困難的標(biāo)本提供新的檢測手段?；驒z測近年來越來越廣泛地被應(yīng)用于ABO 疑難血型的鑒定，尤其是一些已知的明確導(dǎo)致血型異常的等位基因，一旦檢出，可100%確定血型。然而，目前國內(nèi)真正開展H 基因和ABO 基因檢測的輸血科并不多見。為此，本研究對我院2018 年7 例ABO 正反定型不符的標(biāo)本進(jìn)行基因分析，以探討血型基因檢測結(jié)合血清學(xué)方法在ABO 疑難血型鑒定中的應(yīng)用，旨在建立穩(wěn)定可行的檢測方法組合，提高血型鑒定準(zhǔn)確性，指導(dǎo)臨床供血的選擇。

資料與方法

一、資料

收集我院2018 年度血型血清學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的7 例血型正反定型不符的成人，均無血液系統(tǒng)疾病、骨髓移植或造血干細(xì)胞移植等治療狀態(tài)，取乙二胺四乙酸二鈉抗凝血液標(biāo)本、唾液標(biāo)本進(jìn)行檢測。所有患者取樣均獲得知情同意。送患者血樣至上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院輸血科進(jìn)行血型基因測序。例1 為28 歲男性，門診體檢者，病史不詳；例2 為28 歲男性，門診患者，病史不詳；例3 為36 歲男性，慢性乙型病毒肝炎患者，無輸血史；例4 為23 歲女性，于我院產(chǎn)科檢查；例5 為32 歲女性，因闌尾炎收住入我院；例6為26 歲男性，肛膿腫患者；例7 為50 歲男性，面神經(jīng)麻痹患者。

二、方法

1.儀器與試劑：本研究所用試劑如下。單克隆抗-A、抗-B 試劑、ABO 反定型標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞、不規(guī)則抗體篩檢細(xì)胞采用的抗-H、抗-A1 試劑購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司；抗-B 試劑購自長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司；抗-Lea、抗-Leb 購自法國DIACAST 公司。儀器及試劑盒包括全自動血型分析儀（奧森多公司，型號為AutoVueInnova）、血液基因組DNA 抽提試劑盒（上海生工生物技術(shù)有限公司）、TaKaRa La Tap 酶（日本TaKaRa 公司）、DNA 瓊脂糖凝膠純化試劑盒（北京TianGen 公司）、pMD18-T 載體（日本TaKaRa 公司）、PCR 儀（美國ABI 公司）、DNA 測序儀（美國ABI 公司，型號為PRISM377）、離心機(jī)（日本久保田公司，型號為KA-2200）。

2.血清學(xué)試驗(yàn)：檢測包括ABO 血型正反定型、抗體篩查試驗(yàn)、吸收放散試驗(yàn)、唾液ABH 血型物質(zhì)鑒定、Lewis 血型鑒定及H 抗原鑒定，檢測時均按相關(guān)試劑說明書和《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[4]進(jìn)行操作。正反定型的微柱凝集法鑒定結(jié)果采用鹽水試管法驗(yàn)證確認(rèn)，不凝集結(jié)果經(jīng)顯微鏡下觀察驗(yàn)證。

3.DNA 抽提和PCR 擴(kuò)增：取200 μL 白膜層血樣，用外周血DNA 抽提試劑盒提取全基因組DNA，分別對ABO 基因1～7 外顯子、FUT1 基因和FUT2 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增體系中包含全基因組DNA、TaKaRa La Taq 酶，ABO 基因1～7 外顯子引物序列參見文獻(xiàn)[5]，引物擴(kuò)增區(qū)域包含外顯子區(qū)域和外顯子內(nèi)含子交接區(qū)域。FUT1 基因和FUT2基因引物序列參見文獻(xiàn)[6]。反應(yīng)步驟為，95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

4.PCR 產(chǎn)物直接測序及克隆后測序：PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化擴(kuò)增，ABO 基因第6、第7 外顯子和FUT2 基因的PCR 純化產(chǎn)物直接進(jìn)行測序。ABO 基因第7 外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD18-T 載體，PCR 插入片段隨后在ABI377 測序儀上進(jìn)行序列分析，用Chromos 軟件比對和分析測序結(jié)果。

結(jié) 果

在7 例ABO 正反定型不符的標(biāo)本中，血清學(xué)檢測有3 例為類孟買血型，唾液存在ABH 血型物質(zhì)；Lewis 血型為Le（a-b+），證實(shí)為分泌型（見表1）；其中標(biāo)本1、2 在37 ℃下及室溫下未檢出有活性的抗-H 或抗-HI 抗體，吸收放散試驗(yàn)因標(biāo)本不足而未檢出與血型物質(zhì)相符的血型抗原；標(biāo)本3 檢出抗-HI 抗體，在37 ℃下及室溫下均有活性。

有2 例血清學(xué)表現(xiàn)為B（A）型（見表1），在正定型凝集強(qiáng)度改變的同時，血清中存在針對弱抗原的抗體，紅細(xì)胞與抗-A1 不凝集，與抗-H 凝集強(qiáng)度大于正常B 型細(xì)胞。

有2 例血清學(xué)表現(xiàn)為Bw 亞型（見表1），紅細(xì)胞與2 種不同廠家的抗-B 單克隆試劑的凝集強(qiáng)度均為2+，無雙群現(xiàn)象；與抗-H 反應(yīng)均增強(qiáng)，未檢出不規(guī)則抗-B 抗體。

6 例標(biāo)本基因分型與血清學(xué)格局相符，其中3 例類孟買血型個體的FUT2 基因經(jīng)DNA 測序?yàn)槌Ｒ姷念惷腺I等位基因，均為分泌型（Se）表型，與唾液血型物質(zhì)以及Lewis 血型檢測結(jié)果相符；另外3 例ABO 血型亞型檢出相應(yīng)的關(guān)鍵突變位點(diǎn)（見表2）。上述6 例基因檢測的結(jié)果可以補(bǔ)充血型資料并幫助最終確認(rèn)血型，突變類型見圖1。標(biāo)本7 測序未發(fā)現(xiàn)ABO 基因編碼區(qū)和已知調(diào)控區(qū)位點(diǎn)突變。

表2 基因測序結(jié)果

圖1 基因突變測序圖譜

討 論

一、ABO 正反定型不符現(xiàn)象分析

ABO 血型系統(tǒng)是臨床輸血中最重要的血型系統(tǒng)。臨床基層實(shí)驗(yàn)室通常將血清學(xué)抗原抗體相互驗(yàn)證后仍難以明確判定ABO 血型的血型統(tǒng)稱為疑難血型。造成疑難血型現(xiàn)象的原因有冷凝集素、ABO血型不合造血干細(xì)胞移植、ABO 亞型、抗原減弱或缺失、抗體減弱或缺失、惡性血液病、自身抗體、意外抗體，另外還有補(bǔ)體致敏、假凝集及直接抗體陽性等多種因素[1-3]，其中，ABO 亞型和類孟買血型是ABO 正反定型不符現(xiàn)象的常見原因之一。類孟買血型是H 基因突變的結(jié)果，因其上位效應(yīng)影響ABO基因產(chǎn)物，造成了ABO 血型異常表現(xiàn)，可以算作廣義上的ABO 亞型[8]。

二、血清學(xué)檢測血型的局限性

血清學(xué)凝集試驗(yàn)是經(jīng)典的血型檢測方法，目前其在實(shí)驗(yàn)室中具有不可替代性。但由于血型抗原抗體效價在不同的生理病理時期可能存在動態(tài)變化，不同抗血清試劑的差異、不同的亞型關(guān)鍵核苷酸突變、不同的共表達(dá)等位基因以及不同操作人員對結(jié)果的判讀誤差等難以避免的主客觀因素，影響血清學(xué)鑒定結(jié)果。

三、血型基因分型與血清學(xué)方法互補(bǔ)確認(rèn)血型

血型基因分型從分子水平鑒定血型，克服了血清學(xué)方法的局限性，近年來被用于預(yù)測血型、篩選罕見和無效型血型個體、鑒定ABO 和Rh 等血型定型疑難樣品[9]。本研究中，標(biāo)本1～6 基因分析結(jié)果與血清學(xué)表現(xiàn)相符，標(biāo)本1、2、3 的H 基因突變是中國人群中常見的突變類型[10-11]，c.881_882de1TT 和c.551_552delAG 兩者均為移碼突變，導(dǎo)致生成截斷的無功能的FUT1 酶，因此可推測紅細(xì)胞上H 抗原完全缺失，也無法形成紅細(xì)胞上的A 或者B 抗原。而標(biāo)本1、2、3 紅細(xì)胞采用正定型檢測無法檢出A或B 抗原，吸收放散試驗(yàn)由于標(biāo)本量不足，結(jié)果為陰性，但參照之前的文獻(xiàn)報道，這2 種基因型對應(yīng)的類孟買血型紅細(xì)胞上經(jīng)吸收放散試驗(yàn)可以檢出相應(yīng)的A 和B 抗原[12]，推測這可能是由于檢出的這些A 和B 抗原是從血漿中吸附了H 物質(zhì)后形成，或直接就是吸附自體血漿的A 或B 物質(zhì)。標(biāo)本4、5的BA.04 基因型在國內(nèi)也有較多報道，2 例共表達(dá)基因均為O 基因，產(chǎn)生典型的B(A)血型血清學(xué)表現(xiàn)，即紅細(xì)胞A 抗原表達(dá)弱，H 抗原水平高，血清中有抗-A，是中國人中最常見的一種ABO 亞型[13]。標(biāo)本6 基因型為B303/O.01，但紅細(xì)胞與2 種單克隆抗-B（試劑1 為上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號為20 171023；試劑2 為長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號為20170406）作用均未出現(xiàn)B3血型混合視野特征，又因缺乏人源試劑，血清學(xué)分型只能鑒定為Bw，無法驗(yàn)證為B3型。不排除用人源試劑檢測會出現(xiàn)混合視野特征而確認(rèn)為B3的可能；然而由于人源抗血清沒有商品化試劑，國內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室缺乏人源抗血清，在實(shí)驗(yàn)試劑缺乏情況下，無法準(zhǔn)確進(jìn)行血清學(xué)分類而將ABO 亞型直接判讀為w 的做法在國際輸血行業(yè)受到認(rèn)可。ABO 亞型的基因型與血清型不存在絕對的互相對應(yīng)關(guān)系，如崔文燕等[14]報道的1 例B305/O.01.02 等位基因425C→T 突變具有B3混合視野特征，李歸冀等[15]報道的1 例B3.05/O.01 等位基因425T＞C 突變無特異性混合視野特征。關(guān)于相同等位基因?qū)?yīng)不同血清學(xué)亞型的情況，研究推測是由于不同實(shí)驗(yàn)室使用不同的抗血清，或個體受到共表達(dá)的另外一個ABO 等位基因的影響有關(guān)[16]。

基因突變造成其編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)和活性改變，導(dǎo)致血型抗原合成異常，客觀解釋了血型抗原抗體在質(zhì)和量的差異性原因。標(biāo)本7 血清分型為Bw，無引起抗原減弱的臨床病因，其ABO 基因1～7 外顯子測序?yàn)檎.01/O.01.02，不能排除其他未知位點(diǎn)突變，并非所有的血清學(xué)亞型在基因水平均能檢出突變[16]，顯示目前基因分型鑒定亞型同樣也有局限性。目前對ABO 血型異常的基因檢測最為明確和集中的類型主要包括類孟買、B(A)和cisAB 血型，這些類型幾乎都能檢測到相應(yīng)的突變位點(diǎn)[5，7，13，16-18]。遺憾的是，本例Bw 未能取得家系成員進(jìn)行遺傳關(guān)系的驗(yàn)證。

四、基因分型是血清學(xué)檢測的有益補(bǔ)充

本研究中，基因檢測對類孟買血型和包括B(A)亞型在內(nèi)的部分ABO 亞型具有明確的鑒定意義，對臨床安全輸血有重要價值。臨床上，選擇ABO 基因同型紅細(xì)胞輸血與O 型洗滌紅細(xì)胞輸注效果無顯著性差異[3]，提示基因配型可以作為輸血配型的重要依據(jù)。對于血清學(xué)表型疑似ABO 亞型但未檢測到ABO 基因突變的個體，并不能完全排除其為ABO 亞型的可能性，應(yīng)進(jìn)行家系調(diào)查分析，證實(shí)其是否存在可遺傳的血型異常，避免漏檢ABO 亞型。血清學(xué)方法簡單易行、高效靈敏[19]，既是ABO 亞型的初篩試驗(yàn)，也是在亞型確診和輸血方案確定之后判斷不同血型間輸注相容性的驗(yàn)證試驗(yàn)?；蚍中陀兄谶M(jìn)一步了解血型的形成機(jī)制，只要檢出突變的血型等位基因就能準(zhǔn)確定型，與血清學(xué)方法互補(bǔ)，可清晰判斷個體存在的抗原抗體、臨床意義及遺傳特性之間的邏輯關(guān)聯(lián)。厘清ABO 血型抗原表達(dá)的復(fù)雜性，在臨床治療中將其用于選擇和驗(yàn)證安全相容的血液制品，可提供個體獲益最大的輸血方案?；蚍中褪茄鍖W(xué)檢測的有益補(bǔ)充,為臨床安全輸血提供更有力的保障。