李 惠，馮 潔，韓立中

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院a.檢驗(yàn)系，b.臨床微生物科，上海 200025；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心 上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，上海 201203）

隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，發(fā)達(dá)國(guó)家在生命科學(xué)研究、藥品及生物試劑生產(chǎn)、食品檢驗(yàn)和航天工業(yè)中使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均已達(dá)到無(wú)特定病原體（specific pathogen free,SPF）級(jí)，我國(guó)也要求在2010 年普及使用SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[1]。歐洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物聯(lián)合會(huì)（Federation of European Laboratory Animal Science Associations,FELASA）定期發(fā)布和更新詳細(xì)全面的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康監(jiān)控指南和人員培訓(xùn)計(jì)劃，詳細(xì)闡述了監(jiān)測(cè)病原體的種類(lèi)、采樣要求和檢測(cè)方法等[2]。我國(guó)最新發(fā)布的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)（GB 14922.2-2011）》中指出，SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是指除清潔動(dòng)物應(yīng)排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病菌和對(duì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)干擾大的病原，簡(jiǎn)稱(chēng)SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。針對(duì)無(wú)特定微生物，我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)列舉了8 個(gè)必須排除的菌屬或菌種，分別為沙門(mén)菌屬（Salmonella spp.）、支原體屬（Mycoplasma spp.）、鼠棒狀桿菌（Corynebacterium kutscheri）、泰澤病原體（Tyzzer′s Organism）、嗜肺巴斯德桿菌（Pasteurella pneumotropica）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella peneumoniae）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。即SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不帶有對(duì)人或動(dòng)物本身致病的微生物，但非特定的微生物是允許存在的，且不能排除可經(jīng)胎盤(pán)屏障垂直傳播的微生物。然而在特定條件下，“非”病原體可以成為病原體，目前對(duì)于部分病原體尚缺乏有效的檢查手段。最近有研究表明，動(dòng)物腸道微生物其實(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大影響，許多科研結(jié)果不能重復(fù)也歸咎于腸道菌群的影響[3]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否達(dá)到了SPF 級(jí)別，其重要的評(píng)價(jià)手段就是微生物質(zhì)量監(jiān)測(cè)，必須建立一套完整且高通量的微生物檢測(cè)體系，來(lái)確保大批量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不攜帶應(yīng)排除的病原體。本研究在比較國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌監(jiān)測(cè)方案后，選取部分細(xì)菌指標(biāo)作為調(diào)查項(xiàng)目，旨在建立一個(gè)將SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠腸道內(nèi)容物病原菌的篩選與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)平臺(tái)，探討其腸道菌群結(jié)構(gòu)分析的方法，從微生物質(zhì)量角度評(píng)估SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠質(zhì)量，為提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物檢測(cè)水平提供技術(shù)支撐。

材料與方法

一、材料

選取14 個(gè)品系共65 只SPF 級(jí)健康成年小鼠（見(jiàn)表1），雌鼠33 只，雄鼠32 只，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，飼養(yǎng)環(huán)境及條件相同，均隨機(jī)取自各飼養(yǎng)籠中。

表1 65 只SPF 級(jí)小鼠樣本編號(hào)其品系分布

二、材料與方法

1.腸道內(nèi)容物總DNA 抽提：無(wú)菌采集處死后SPF 級(jí)健康成年小鼠回盲部腸道內(nèi)容物，稱(chēng)重3～5 g，立即置于無(wú)菌采樣盒內(nèi)，于-80 ℃下冷凍保存。取150 mg 冰凍樣品，采用TIANGEN（天根）生化科技有限公司提供的糞便基因組DNA 抽提試劑盒抽提糞便DNA[盡量使DNA 濃度大于100 ng/μL，吸光度值（A）280/260介于1.8～2.0 之間，并確保DNA 無(wú)降解]，在完成濃度測(cè)定及瓊脂糖凝膠電泳評(píng)定后，保存于-20 ℃冰箱中。

2.16S rDNA 基因擴(kuò)增、純化及測(cè)序

（1）PCR 擴(kuò)增：用338F（5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3′）引物對(duì)樣本中細(xì)菌16S rRNA 基因的高可變V3～V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min（ABI GeneAmp?9700 型PCR 儀）。擴(kuò)增體系為20 μL，包括5×FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L 的dNTPs 2 μL，0.8 μL 引物（5 μmol/L），F(xiàn)astPfu 聚合酶0.4 μL；10 ng DNA 模板。

（2）Illumina MiSeq 測(cè)序：使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences,Union City,CA,USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。利用QuantiFluorTM-ST（Promega,USA）進(jìn)行定量檢測(cè)。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)（Illumina,San Diego,USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 文庫(kù)。用Illumina 公司的MiSeq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

3.數(shù)據(jù)處理：原始測(cè)序序列使用Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)控，用FLASH 軟件進(jìn)行拼接。①設(shè)置50 bp 的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長(zhǎng)度低于50 bp 的序列；②barcode 需精確匹配，引物允許2 個(gè)堿基的錯(cuò)配，去除模糊堿基；③根據(jù)重疊堿基將兩端序列進(jìn)行拼接，重疊堿基需大于10 bp。去除無(wú)法拼接的序列[4]。使用的UPARSE 軟件（版本7.1,網(wǎng)址http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行運(yùn)籌分類(lèi)單位（operational taxonomic units，OTU）聚類(lèi)；使用UCHIME 軟件剔除嵌合體。利用核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)項(xiàng)目（ribosomal database project,RDP）分類(lèi)（http：//rdp.cme.msu.edu/）對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU123），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。Alpha 多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性進(jìn)行分析[5]，包括Chao1 值、Ace 值、Shannon 指數(shù)以及Simpson 指數(shù)等[6]。利用Mothur（版本1.30.1）軟件計(jì)算樣品的Alpha 多樣性值。利用測(cè)得16S rDNA序列中已知的各種OTU 的相對(duì)比例，來(lái)計(jì)算抽取n 個(gè)（n 小于測(cè)得標(biāo)簽序列總數(shù)）標(biāo)簽序列時(shí)出現(xiàn)OTU 數(shù)量的期望值，然后根據(jù)一組n 值（一般為一組小于總序列數(shù)的等差數(shù)列）與其相對(duì)應(yīng)的OTU 數(shù)量的期望值，采用軟件R（版本3.2.2）繪制稀釋曲線。

結(jié) 果

一、高通量序列分析和質(zhì)量控制

65 只SPF 級(jí)健康成年小鼠的回盲部腸道內(nèi)容物樣本，經(jīng)數(shù)據(jù)過(guò)濾和質(zhì)控后得到144 318 條高質(zhì)量序列用于后續(xù)分析，這些序列長(zhǎng)度集中在421～460 bp 之間（見(jiàn)圖1）。經(jīng)開(kāi)放讀碼框OUT 聚類(lèi)，65 個(gè)樣本高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的片段可以聚類(lèi)為972 個(gè)OUT。

圖1 樣本高通量測(cè)序數(shù)據(jù)平均長(zhǎng)度分布

二、Alpha 多樣性分析結(jié)果

C57 品系小鼠（11 只）、BALB/c 品系小鼠（11 只）、ICR 品系小鼠（15 只）、C57BL/6 品系（11 只）Nu/Nu和db 品系（6 只）與其他品系小鼠（8 只）樣品的Alpha 多樣性分析結(jié)果見(jiàn)表2～7。本次實(shí)驗(yàn)Alpha多樣性指數(shù)的結(jié)果顯示，相同品系的小鼠樣本間Alpha 多樣性表現(xiàn)不均一，菌種數(shù)目亦不均勻，覆蓋率顯示本次測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本中微生物的真實(shí)情況。

65 條樣品稀釋曲線如圖2 所示，無(wú)限接近于樣本中所包含OTUs 的最大值，但各樣本物種豐度表現(xiàn)出明顯差異。各曲線上升趨勢(shì)已趨于平緩，接近平臺(tái)期，說(shuō)明其高通量測(cè)序深度能夠滿足本研究的分析要求。等級(jí)豐度曲線可用來(lái)解釋多樣性的2個(gè)方面，即物種豐度和物種均勻度（見(jiàn)圖3）。本實(shí)驗(yàn)的65 份樣本曲線走勢(shì)顯示在橫軸上的范圍和平滑程度均有較大差異，亦說(shuō)明小鼠樣本間表現(xiàn)出不同的豐度和均勻度。

三、腸道內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)組成

1.在門(mén)水平上樣品物種分布情況：基于OTU聚類(lèi)對(duì)V3～V4 區(qū)序列在門(mén)水平上的樣品數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)所有樣本的序列主要集中在以下8 個(gè)門(mén)，依次為厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、Saccharibacteria、軟壁菌門(mén)（Tenericutes）和螺旋菌門(mén)（Spirochaetae），以厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)為主，除樣本33～36 外，這二類(lèi)基本占所有菌群門(mén)水平的60%以上。樣本33～36 以變形菌門(mén)（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌群；樣本39、40、47 和52 則以厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌群（見(jiàn)圖4）。

表2 C57 品系小鼠（11 只）樣品在在97%相似度水平下的Alpha 多樣性

表3 BALB/c 品系小鼠（11 只）樣品在在97%相似度水平下的Alpha 多樣性

表4 ICR 品系（15 只）小鼠樣品在在97%相似度水平下的Alpha 多樣性

表5 C57BL/6 品系（11 只）小鼠樣品在在97%相似度水平下的Alpha 多樣性

表6 Nu/Nu 和db 品系（6 只）小鼠樣品在在97%相似度水平下的Alpha 多樣性

表7 其他品系小鼠（8 只）樣品在在97%相似度水平下的Alpha 豐富程度

圖2 樣品在遺傳距離0.03 下的稀釋曲線

2.在屬水平上樣本物種分布情況：本組各樣本在屬分類(lèi)水平上菌群結(jié)構(gòu)組成見(jiàn)圖5。

圖3 等級(jí)豐度曲線

在ICR 品系小鼠中，樣本33～36 表現(xiàn)為Enterobacteriaceae_unclassified 豐度較高，分別為89.1%、90.3%、89.2%和77.3%，顯著高于其他小鼠的豐度。樣本33～36 中類(lèi)芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）豐度分別為9.6%、9.4%、9.6%和21.4%；樣本39 和40 號(hào)來(lái)自品系C57BL/6，其類(lèi)芽孢桿菌屬豐度分別為20.8%和33.0%，以上6 個(gè)樣本該菌屬豐度顯著高于其他小鼠。同樣，在樣本39 和40 中,狹義梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）豐度分別為75.2%和61.0%，亦顯著高于其他小鼠。針對(duì)本研究的目的菌屬，樣本39 和40 中葡萄球菌屬（Staphylococcus）的豐度分別為2.3%和2.6%，葡萄球菌屬還存在于其他部分樣本中，其在各樣本中的豐度見(jiàn)表8。

圖4 樣品在門(mén)分類(lèi)水平上菌群結(jié)構(gòu)組成

表8 目的菌屬在各品系小鼠不同樣本的豐度

本研究中其他目的菌屬包括支原體、棒狀桿菌屬和假單胞菌屬在各品系小鼠不同樣本的豐度詳見(jiàn)表8。

討論

在機(jī)體腸道中，微生物在與宿主共同進(jìn)化過(guò)程中形成了數(shù)量巨大、對(duì)宿主有益且必要的腸道正常菌群。這些微生物菌群在系統(tǒng)發(fā)生上顯著不同，而其多樣性是宿主選擇性和菌群共進(jìn)化、共同作用的結(jié)果，包括厭氧菌、兼性厭氧菌和需氧菌，其中97%以上為專(zhuān)性厭氧菌，且大多分布在結(jié)腸部位。在正常情況下，這些微生物菌群保持著動(dòng)態(tài)的平衡和穩(wěn)定。分子微生物生態(tài)學(xué)的方法已經(jīng)揭示了未能培養(yǎng)的細(xì)菌群體的多樣性[7]，最近這些技術(shù)又被用來(lái)分析隨著時(shí)間變化、腸道不同區(qū)域以及不同個(gè)體之間的微生物菌群結(jié)構(gòu)差異[8-9]。高通量測(cè)序技術(shù)已被應(yīng)用于多種生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性研究，如土壤[10-11]、海洋[12]、腸道[13-14]等，其使得人們對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致、全面的分析成為可能，故又被稱(chēng)為深度測(cè)序，是深入研究微生物菌群結(jié)構(gòu)的新手段[15-16]。由于目的菌屬在各樣本中的豐度較低，本研究應(yīng)用Megablast 的方法檢測(cè)所有樣本中屬內(nèi)OUT 數(shù)量（見(jiàn)表9）。

圖5 樣品在屬分類(lèi)水平上菌群結(jié)構(gòu)組成

表9 Megablast 方法分析樣本中檢測(cè)到目的菌屬的OUT 數(shù)量

目前，我國(guó) 《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)（GB 14922.2-2011）》所推薦的小鼠細(xì)菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為常規(guī)分離培養(yǎng)結(jié)合生化鑒定法。傳統(tǒng)的研究是通過(guò)培養(yǎng)結(jié)合生化鑒定的方法來(lái)分析其組成，腸道可培養(yǎng)的常見(jiàn)厭氧菌種屬有擬桿菌、梭菌、雙歧桿菌和乳桿菌；兼性厭氧菌有革蘭陰性腸桿菌（如大腸埃希菌、沙門(mén)菌）和革蘭陽(yáng)性球菌（如腸球菌、葡萄球菌、鏈球菌）。然而，直接進(jìn)行顯微觀察的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腸道微生物形態(tài)與可培養(yǎng)微生物形態(tài)并不一致，其可能是腸道微生物離開(kāi)了相應(yīng)的生態(tài)位后死亡而引起。為了避免傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限，本研究引入了高通量測(cè)序技術(shù)，分析65 份SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠回盲部腸道內(nèi)容物的細(xì)菌物種組成和豐度、Alpha 多樣性和菌群結(jié)構(gòu)，基本完成了在屬水平上篩選特定的病原菌，包括葡萄球菌屬、支原體屬、棒狀桿菌屬及假單胞菌屬。

本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)和完整實(shí)驗(yàn)，完成了對(duì)各步驟反應(yīng)條件的探索和優(yōu)化，包括引物的特異性和擴(kuò)增條件的選擇以及高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的處理，結(jié)果能夠使研究人員在需用實(shí)驗(yàn)小鼠作為科研對(duì)象時(shí)，預(yù)先了解SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠腸道的菌群結(jié)構(gòu)和組成，有助于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析和重復(fù)，尤其是需要大批量的SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠時(shí)。本研究為有針對(duì)性地設(shè)計(jì)篩選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道內(nèi)容物特定病原體實(shí)驗(yàn)提供了一種新方法，并適合大樣本量的篩查（本方法已申請(qǐng)專(zhuān)利,專(zhuān)利號(hào)201710924382.0）。在屬水平上，本研究在所有樣本中檢測(cè)到了葡萄球菌屬、假單胞菌屬、支原體和棒狀桿菌屬，但豐度均相對(duì)較低。經(jīng)高通量測(cè)序篩查后，在屬水平上檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本，還需要進(jìn)一步用PCR 檢測(cè)來(lái)再次確定是否含有特定菌種。目的病原菌中涉及到的鼠棒狀桿菌、牛棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞菌均需在種水平上確定其有或無(wú)。本研究還發(fā)現(xiàn)，ICR 品系小鼠中樣本33～36 表現(xiàn)為以變形菌門(mén)（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌群，與之相一致的是在屬水平上Enterobacteriaceae_unclassified 豐度較高，而同樣來(lái)源于ICR 品系的小鼠52 號(hào)樣本，其腸道內(nèi)容物則以厚壁菌門(mén)（Firmicutes）為優(yōu)勢(shì)菌群。以上5 個(gè)樣本與本實(shí)驗(yàn)中其他ICR 品系小鼠相比較，OTU 聚類(lèi)在門(mén)水平上的樣本序列有明顯差異。由此提示，即使飼養(yǎng)環(huán)境和條件相同，相同品系的SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠腸道菌群在物種組成、豐度及Alpha 多樣性方面也會(huì)表現(xiàn)出顯著差異。越來(lái)越多的研究已經(jīng)關(guān)注實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境對(duì)其所應(yīng)用研究范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性的影響。盡管實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸道菌群在飼養(yǎng)和管理過(guò)程中受諸多因素的影響，由于很難使其標(biāo)準(zhǔn)化，人們?nèi)灾铝τ谘芯扛鞣N方法使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腸道菌群在可控和可監(jiān)測(cè)范圍內(nèi)[3]。對(duì)于SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠的微生物項(xiàng)目的監(jiān)測(cè)，本研究建立的方法可以快速提供實(shí)驗(yàn)小鼠的腸道菌群組成、豐度、Alpha 多樣性指數(shù)及種屬篩查結(jié)果，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確率和可重復(fù)性，尤其適合較大樣本微生物項(xiàng)目的篩選、監(jiān)測(cè)。按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)（GB 14922.2-2011）》的微生物檢測(cè)項(xiàng)目的要求[17]，本研究因初次嘗試，存在諸多條件限制，只檢測(cè)了上述國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的部分項(xiàng)目，其余項(xiàng)目會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中展開(kāi)。

總之，本研究首次使用高通量測(cè)序技術(shù)分析了SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠回盲部腸道內(nèi)容物的菌群結(jié)構(gòu)及組成，為提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)水平，進(jìn)一步補(bǔ)充完善我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制體系提供更精確的研究手段，并為生產(chǎn)高質(zhì)量的SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。