張穎麗　梁蓉蓉　謝艾岑　史文倩　黃花榮

【摘要】目的 探討CC趨化因子受體5（CCR5）第一、第二胞外環(huán)特異性結(jié)合的拮抗短肽（拮抗短肽）對哮喘小鼠氣道炎癥和輔助性T淋巴細胞1（Th1）遷移的影響和機制。方法 40只健康野生型 BALB/c小鼠，分為空白對照組（對照組）、致敏組、模型組、GH拮抗短肽治療組（GH組）、HY拮抗短肽治療組（HY組），每組各8只。采用卵清白蛋白構(gòu)建BALB/c小鼠急性哮喘模型，并予CCR5第一、第二胞外環(huán)拮抗短肽（分別為GH和HY短肽）干預。通過制備小鼠肺組織切片評估氣道炎癥浸潤及黏液分泌程度，采用ELISA檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）IFN-γ表達水平，使用流式細胞儀分別檢測小鼠脾臟和外周血Th1比例。結(jié)果 對照組小鼠肺組織無或僅少量炎癥細胞浸潤，支氣管壁均勻無增厚，無黏液栓;致敏組支氣管周圍少量炎癥細胞浸潤，管壁及支氣管上皮細胞輕微損傷。與對照組比較，模型組可見大量炎癥細胞浸潤，以支氣管和動靜脈周圍明顯，管壁增厚，出現(xiàn)支氣管上皮細胞損傷。GH組、HY組小鼠肺組織炎癥浸潤程度明顯減輕。與模型組相比，GH組和HY組小鼠氣道炎癥浸潤程度明顯減輕、氣道黏液分泌下降、BALF中IFN-γ水平降低、脾臟中Th1比例上升、外周血中Th1比例下降（P均< 0.05）。其中，HY組小鼠脾臟中Th1比例高于GH組，外周血中Th1比例低于GH組（P均< 0.05）。結(jié)論 CCR5第一、第二胞外環(huán)拮抗短肽緩解哮喘小鼠的氣道炎癥可能是通過抑制Th1向炎癥部位趨化實現(xiàn)的。

【關鍵詞】CC趨化因子受體5;哮喘;干擾素-γ;輔助性T淋巴細胞1

【Abstract】Objective To investigate the effect and mechanism of antagonistic peptides specifically binding to the first and second extracellular loops of CC chemokine receptor 5 （CCR5） on airway inflammation and T-helper cell 1 （Th1） migration in the asthmatic mouse models. Methods Forty healthy wild-type BALB/cmice were evenly divided into the blank control group （control group）， sensitization group， model group， GH peptide group and HY peptide group. The experimental BALB/c mouse models of acute asthma were induced by OVA， and treated by antagonistic peptides of CCR5 （GH and YH peptide）. The degree of airway inflammation and mucus hypersecretion were assessed by HE and PAS staining， respectively. The expression level of IFN-γ in the bronchoalveolar lavage fluid （BALF） was detected by ELISA. Besides， the proportion of Th1 cells in the spleen and peripheral blood was detected by flow cytometry. Results In the control group， no or slight inflammatory cell infiltration was noted in the lung tissues， no bronchial wall thickening or mucus plug was observed. In the sensitization group， a slight amount of inflammatory cell infiltration was seen surrounding the bronchi， and mild injury was noted in the bronchial wall and epithelial cells. Compared with the control group， a larger quantity of inflammatory cell infiltration was observed， especially surrounding the bronchi and arteriovenous region in the model group. Besides， bronchial wall thickening and bronchial epithelial cell injury were observed. In the GH and HY peptide groups， the severity of inflammatory cell infiltration in the lung tissues was significantly attenuated. Compared with the asthmatic model group， two antagonistic peptides of CCR5 significantly mitigated the allergic airway inflammation and mucus secretion， down-regulated the expression level of IFN-γ， up-regulated the proportion of Th1 cells in the spleen and down-regulated the proportion of Th1 cells in the peripheral blood （all P < 0.05）. In the HY group， the proportion of Th1 cells in the spleen was significantly higher， whereas that in the peripheral blood was remarkably lower compared with those in the GH group （both P < 0.05）. Conclusion These findings suggest that antagonistic peptides of CCR5 can alleviate the airway inflammation in the asthmatic mouse models probably by suppressing the Th1 chemotaxis to inflammatory sites.

【Key words】CC chemokine receptor 5;Asthma;Interferon-gamma;T-helper cell 1

支氣管哮喘是全球性影響人類生活質(zhì)量的公共衛(wèi)生問題，發(fā)病率未能得到很好地控制。其中多種細胞（杯狀細胞、肌細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等）及細胞成分參與了哮喘的發(fā)生發(fā)展過程[1-2]。自不同的輔助性T淋巴細胞（Th）亞群被發(fā)現(xiàn)以來，Th2就與過敏性哮喘聯(lián)系在一起，研究主要集中在Th2炎癥反應而忽略了Th1在哮喘免疫反應中的調(diào)節(jié)作用。最近有研究者在過敏原刺激后檢測到CD4+ T淋巴細胞來源的IFN-γ水平升高，參與過敏反應的發(fā)展[3]。此外，Th1表面會表達CC趨化因子受體5（CCR5）、CXCR3和CXCR6等趨化因子受體，感受其對應配體的濃度變化，從而募集到炎癥部位發(fā)揮作用。因此，本研究擬探索CCR5第一、第二胞外環(huán)特異性結(jié)合的活性拮抗短肽（拮抗短肽）對哮喘小鼠炎癥反應及Th1趨化的影響和機制。

材料與方法

一、動 物

健康野生型 BALB/c小鼠，6 ～ 8周齡，雌性，體質(zhì)量20 ～ 22 g，購自中山大學實驗動物中心（東校區(qū)），飼養(yǎng)于中山大學實驗動物中心（東校區(qū)）的SPF級環(huán)境，本實驗方案征得中山大學實驗動物管理與使用委員會及實驗動物倫理委員會的批準，動物實驗倫理委員會批準編號為IACUC-2019-000097。

二、主要試劑與儀器

CCR5第一、第二胞外環(huán)的拮抗短肽（GH短肽和HY短肽），由中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院消化內(nèi)科鐘英強教授惠贈;雞卵白蛋白（OVA，Ⅴ級）購自美國Sigma公司;IFN-γ的ELISA試劑盒購自美國R&D公司;異硫氰酸熒光素（FITC）-CD4、APC-CD3e、eFluor 450-IFN-γ流式抗體和Cell Stimulation Cocktail試劑購自美國eBioscience公司;固定破膜液購自美國BD公司。

三、實驗方法

1. 急性哮喘小鼠模型的建立及干預

急性哮喘小鼠模型構(gòu)建參考課題組前期模型構(gòu)建方式[4]。將40只小鼠編號，按隨機數(shù)表法分為5組，每組各8只小鼠。其中空白對照組（對照組）小鼠予等體積生理鹽水替代OVA腹腔致敏和滴鼻激發(fā);致敏組小鼠予等量OVA（50 μg）腹腔致敏，等體積生理鹽水滴鼻激發(fā);模型組小鼠予OVA（100 μg）致敏、激發(fā); GH拮抗短肽治療組（GH組）小鼠使用OVA致敏激發(fā)建立哮喘模型后，連續(xù)7 d通過尾靜脈注射GH短肽（35 mg/kg），

每日1次;HY拮抗短肽治療組（HY組）小鼠使用OVA致敏激發(fā)建立哮喘模型后，連續(xù)7 d通過尾靜脈注射HY短肽（25 mg/kg），每日1次。GH和HY拮抗短肽劑量根據(jù)預實驗小鼠肺部病理活組織檢查（活檢）結(jié)果確定。

2. 標本的收集

實驗第24日，予過量10%水合氯醛麻醉處死各組實驗小鼠。打開小鼠胸腔，仔細分離暴露氣管，插入靜脈留置針，行肺泡灌洗得肺泡灌洗液（BALF），并進行炎癥因子檢測。然后用生理鹽水沖洗肺部至發(fā)白后，取一部分用于HE染色和過碘酸雪夫（PAS）染色分析。最后取脾臟組織和外周血用于流式細胞術檢測。

3. 小鼠肺組織的HE染色及評價

將肺組織置于4%多聚甲醛中固定過夜，制備石蠟切塊，切片厚度為5 μm。經(jīng)HE染色后于顯微鏡下觀察組織病理學改變，包括支氣管黏膜及氣道上皮細胞的改變、炎癥細胞浸潤程度，并根據(jù)浸潤程度評分[5]。標準如下：0分，氣道周圍無炎癥細胞浸潤;1分，氣道周圍有少量炎癥細胞浸潤;2分，大部分氣道周圍有1層炎癥細胞浸潤;3分，大部分氣道周圍有2 ～ 4層炎癥細胞浸潤;4分，大部分氣道周圍有超過4層炎癥細胞浸潤;5分，幾乎全部氣道周圍均有多層炎癥細胞浸潤。

4. 小鼠肺組織的PAS染色及評價

將肺組織置于4%多聚甲醛中固定過夜，制備石蠟切塊，切片厚度為5 μm。經(jīng)PAS染色后于顯微鏡下觀察并評估氣道黏液分泌程度，評分標準如下：0分，PAS陽性的杯狀細胞占整個氣道上皮細胞數(shù)≤5%;1分，PAS陽性的杯狀細胞占整個氣道上皮細胞數(shù)6% ～ 25%;2分，PAS陽性的杯狀細胞占整個氣道上皮細胞數(shù)26% ～ 50%;3分，PAS陽性的杯狀細胞占整個氣道上皮細胞數(shù)51% ～ 75%;4分，PAS陽性的杯狀細胞占整個氣道上皮細胞數(shù)≥76%;5分，幾乎所有氣道均有大量PAS陽性的杯狀細胞[5]。

5. 小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IFN-γ表達水平的檢測

將取得的BALF離心，收集上清液，采用ELISA法測定上清液中IFN-γ的表達水平。具體操作嚴格按照試劑盒說明書步驟進行。

6. 小鼠脾臟和外周血中Th1比例的檢測

用淋巴細胞分裂液提取小鼠脾臟及外周血中的淋巴細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸。取1×106淋巴細胞于24孔板中，加入刺激劑2 μl后置于含5% CO2 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。取出用PBS洗滌后加入0.5 μl FITC-CD4、1 μl APC-CD3e抗體，4℃避光孵育30 min。加入150 μl固定破膜液混勻，4 ℃避光孵育30 min。用PBS洗滌后加入2.5 μl eFluor 450-IFN-γ抗體，4℃避光孵育30 min。200 μl 2%多聚甲醛重懸后用流式細胞儀檢測。FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

一、CCR5第一、第二胞外環(huán)拮抗短肽對哮喘小鼠肺組織炎癥浸潤的影響

顯微鏡下觀察，對照組小鼠肺組織無或僅少量炎癥細胞浸潤，支氣管壁均勻無增厚，無黏液栓;致敏組支氣管周圍少量炎癥細胞浸潤，管壁及支氣管上皮細胞輕微損傷，見圖1A、B。與對照組比較，模型組可見大量炎癥細胞浸潤，以支氣管和動靜脈周圍明顯，管壁增厚，出現(xiàn)支氣管上皮細胞損傷，見圖1C。GH組、HY組小鼠肺組織炎癥浸潤程度明顯減輕，見圖1D、E。5組小鼠間炎癥評分比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 29.98，P < 0.01）。與對照組及致敏組相比，模型組氣道炎癥呈現(xiàn)高水平狀態(tài)（圖1F，P < 0.05）。GH組、HY組炎癥浸潤程度均低于模型組（P均< 0.05），GH組和HY組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。

二、CCR5第一、第二胞外環(huán)拮抗短肽對哮喘小鼠肺組織黏液分泌的影響

5組小鼠黏液分泌程度比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 28.53，P < 0.01）。在PAS染色中，對照組小鼠氣道基底膜未見杯狀細胞。與對照組及致敏組相比，模型組出現(xiàn)明顯的杯狀細胞增生與黏液分泌。與模型組相比，GH組和HY組黏液分泌程度明顯減輕、杯狀細胞減少（P均< 0.05），GH組和HY組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），見圖2。

三、CCR5第一、第二胞外環(huán)拮抗短肽對哮喘小鼠BALF中IFN-γ表達水平的影響

5組小鼠BALF間IFN-γ表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 75.59，P < 0.01）。對照組與致敏組小鼠BALF中IFN-γ表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。模型組IFN-γ表達水平約為對照組的1.35倍（P < 0.05）。與模型組相比，GH組和HY組IFN-γ表達水平均有所下降（P均< 0.05），GH組的IFN-γ表達水平與HY組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），見圖3。

四、CCR5第一、第二胞外環(huán)拮抗短肽對哮喘小鼠脾臟Th1比例的影響

5組小鼠脾臟間Th1比例比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 126.85，P < 0.01）。對照組與致敏組小鼠脾臟Th1比例比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。模型組小鼠脾臟CD4+ T淋巴細胞中Th1比例高于對照組（P < 0.05），約為對照組的1.16倍。此外，GH組和HY組Th1比例均高于模型組（P均< 0.05），分別約為模型組的1.13倍和1.17倍。其中，HY組上升效果最為明顯，與GH組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），見圖4。

五、CCR5第一、第二胞外環(huán)拮抗短肽對哮喘小鼠外周血Th1比例的影響

5組小鼠外周血Th1比例比較差異有統(tǒng)計學意義（F = 493.07，P < 0.01）。對照組與致敏組小鼠外周血Th1比例比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。模型組小鼠外周血CD4+ T淋巴細胞中Th1比例高于對照組，約為對照組的1.64倍（P < 0.05）。與模型組相比，GH組和HY組外周血Th1均有所下降（P均< 0.05），分別約為模型組的86%、71%。同樣地，HY組下降效果最為明顯，與GH組比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），見圖5。

討論

目前，全球哮喘的發(fā)病率與病死率仍居高不下，嚴重影響患者生活質(zhì)量。但其分子機制涉及范圍廣，其中多種免疫細胞和介質(zhì)參與其發(fā)生發(fā)展。探索哮喘潛在發(fā)病機制并開創(chuàng)精準的靶向治療策略具有重要的現(xiàn)實意義。

相關研究認為，Th1/Th2失衡與免疫炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。其中Th2及其分泌的IL-4、IL-5、IL-13和與其相關的IgE在氣道炎癥中水平升高，并且具備Th1的抑制作用[6]。對于Th1及其分泌的IFN-γ在免疫調(diào)節(jié)中的作用尚不能明確。研究顯示，過敏性哮喘中Th1分泌的IFN-γ能拮抗Th2反應，恢復Th1/Th2平衡，有效緩解氣道炎癥并減少黏液分泌。在過敏性氣道炎癥誘導前或誘導中使用IFN-γ干預，可觀察到IFN-γ的保護作用[7]。但是，IFN-γ如何減輕哮喘炎癥反應的具體機制尚不清楚，而且相關結(jié)果相反的研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ或IFN-γ誘導的細胞因子在動物模型中引起了類似哮喘的炎癥反應[8]。在嚴重哮喘患者的BALF中發(fā)現(xiàn)，該類型哮喘以IFN-γ、IL-17等炎癥因子升高為特點，對糖皮質(zhì)激素治療反應不明顯[9-10]。此外在哮喘患兒的外周血上清液中，Th1型IFN-γ和Th2型IL-5水平均增高。上述研究均提示，哮喘患者體內(nèi)Th1促炎功能增強。本研究使用OVA構(gòu)建急性哮喘小鼠模型，與對照組對比發(fā)現(xiàn)，模型組炎癥水平明顯，肺部主要以淋巴細胞和嗜酸性粒細胞浸潤為主，伴有大量的黏液分泌，符合OVA構(gòu)建的哮喘模型特征[11]。此外，模型組BALF中亦發(fā)現(xiàn)IFN-γ表達水平的升高，與前述研究相符，表明IFN-γ在哮喘中可能發(fā)揮著重要的促炎作用。

CCR5是CC趨化因子受體的一種，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，包括3個胞外環(huán)和3個胞內(nèi)環(huán)。在功能上不僅能促進炎癥介質(zhì)的分泌，還參與包括樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、T淋巴細胞等白細胞向炎癥組織的趨化和遷移[12-13]。已有研究表明CCR5在多種炎癥性疾?。ㄑ装Y性腸病、支氣管哮喘等）和自身免疫性疾?。⊿LE、類風濕關節(jié)炎、銀屑病等）中發(fā)揮重要作用[14-15]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CCR5第二胞外環(huán)拮抗肽作用于哮喘小鼠能緩解肺部炎癥反應[4]。上述研究表明拮抗CCR5能達到抗炎的效果，而細胞膜表面表達CCR5的Th1是否受拮抗短肽調(diào)控從而減輕炎癥，并未見相關報道。為深入探討CCR5特異性拮抗短肽與Th1的關系，本研究使用CCR5第一、第二胞外環(huán)拮抗短肽干預哮喘小鼠，以觀察作用效果及相關機制。

在炎癥性疾病如支氣管哮喘、COPD中，CCR5大量表達于白細胞表面，并且能夠介導白細胞激活向炎癥部位趨化[16]。本研究顯示，經(jīng)GH和HY短肽干預的小鼠肺部炎癥浸潤及黏液分泌程度均有所下降。因此，GH和HY短肽可能對炎癥細胞向肺部的趨化有直接的阻斷作用，但也不排除協(xié)同其他方式達到共同緩解炎癥的效果[17]。另有研究顯示，初始CD4+ T淋巴細胞從胸腺遷移到次級淋巴組織（例如淋巴結(jié)和脾臟），在次級淋巴組織中與抗原提呈細胞接觸并誘導分化為Th1、Th2、Th17等，隨后在趨化因子等的作用下遷移到炎癥部位[18]。此外，CCR5對于Th1趨化到炎癥部位并發(fā)揮生物學作用起著重要作用。本研究也證實了CCR5第一、第二胞外環(huán)拮抗短肽能降低主要由Th1分泌的IFN-γ的表達水平，同時經(jīng)過短肽干預后，脾臟的Th1水平增高而外周血中降低?？赡苁荂CR5第一、第二胞外環(huán)拮抗短肽阻斷了次級淋巴組織中Th1的趨化，即導致脾臟中Th1遷移受阻而表現(xiàn)出輕度升高，進一步引起外周血及肺部Th1數(shù)量的減少。因此，GH和HY拮抗短肽可能是通過抑制Th1的趨化作用減輕哮喘小鼠炎癥反應的。

本研究中，GH組與HY組BALF中IFN-γ比

較差異無統(tǒng)計學意義，而2組在脾臟和外周血Th1比例比較差異有統(tǒng)計學意義，表現(xiàn)為HY短肽干預效果較GH短肽明顯。研究認為，CCR5的天然配體如調(diào)節(jié)激活正常T淋巴細胞表達分泌因子、巨噬細胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）、MIP-1β等主要與CCR5的N端或第二胞外環(huán)結(jié)合發(fā)揮生物學效應[19]。但具體結(jié)果仍需加大樣本量以進一步明確。本研究使用的GH、HY短肽由噬菌體肽庫展示技術篩選合成，具有特異性高、安全性高和成本低的特點，具備較好應用前景[20]。本研究也為CCR5拮抗短肽用于精準治療支氣管哮喘提供了一定的實驗依據(jù)。

綜上所述，本研究探討了CCR5第一、第二胞外環(huán)拮抗短肽對哮喘小鼠Th1趨化的影響，驗證了CCR5拮抗短肽可能是通過阻斷Th1遷移減輕哮喘炎癥反應的，提示支氣管哮喘中針對CCR5的拮抗抑制可作為新的研究方向和策略。

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（收稿日期：2020-01-24）

（本文編輯：林燕薇）