賴燕華，汪軍霞*，陶 紅，柴國璧，史清照，毛 健，張啟東，范 武，劉俊輝，王 予，林寶敏

1. 廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，廣州市荔灣區(qū)東沙環(huán)翠南路88 號 510385

2. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

刺激性是卷煙舒適感的主要表征參數(shù)之一，在中式卷煙感官評價方法關(guān)于舒適感特征的6 個指標(biāo)中，口腔刺激/舌面灼燒、喉部刺激和鼻腔刺激3 個指標(biāo)均與刺激性直接相關(guān)[1]，但是引起卷煙刺激性的物質(zhì)基礎(chǔ)目前尚不明確。在日常生活中，人們對香味的體驗(yàn)主要來自嗅覺、味覺和化學(xué)感覺的共同作用[2]，其中能引發(fā)刺激的最典型感官特征為辣感。目前，關(guān)于煙草制品中引起辣感的關(guān)鍵成分研究尚無報道。感官導(dǎo)向分析是近年來食品科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展較快的研究領(lǐng)域之一，通過將分離分析技術(shù)與人類的感官判斷相結(jié)合，研究者可以定位食物提取物分離過程中的感官活性區(qū)段，從而找到?jīng)Q定食品特定感官特征的成分組成，并且可以確定其含量與貢獻(xiàn)[3]。在食品科學(xué)領(lǐng)域，研究者已通過感官導(dǎo)向分析定位了不同食品中嗅覺[4-6]、味覺[7-9]和化學(xué)感覺[10-12]的關(guān)鍵成分，并闡明了卷煙煙氣中的烤甜香[13]和煙葉中的酸味[14]及甜味[15]來源。目前，感官導(dǎo)向分析技術(shù)在煙葉辣感物質(zhì)基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用鮮見報道。因此，本研究中對一種濃香型初烤煙葉的提取物進(jìn)行感官導(dǎo)向分離、定位和辣感成分的定性分析，并依據(jù)定性分析結(jié)果進(jìn)行煙堿的定量分析、滋味分析比較實(shí)驗(yàn)和加香注射實(shí)驗(yàn)，旨在明確初烤煙葉中的辣感關(guān)鍵成分，了解辣感關(guān)鍵成分同卷煙刺激性的關(guān)系，為卷煙舒適感的調(diào)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙葉樣品：中煙100 濃香型初烤煙葉（B2F 等級，許昌產(chǎn)區(qū)）；加香注射空白卷煙：煙草添加劑安全性評估參比卷煙（上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司提供）。

煙堿（99%，加拿大TRC 公司）；2-甲基喹啉（98%，百靈威科技有限公司）；無水甲醇、無水乙醇（色譜純，德國Merck 公司）；蒸餾水（10 MΩ/cm，廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；Sephadex LH-20填料（瑞典GE Healthcare 公司）。

7890A/5975C 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）；NGC Quest 10 Plus 型中高壓層析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；8894 型超聲儀（美國Cole Parmer 公司）；R-210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、凝膠色譜柱（2.6 cm×100 cm）（瑞士Büchi 公司）；Alpha 1-2 LDplus 型冷凍干燥機(jī)（德國Christ 公司）；WGL-30B 電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）；RHP-800 型高速多功能粉碎機(jī)（浙江榮浩工貿(mào)有限公司）；CIJECTOR 型自動注射加香儀（德國Burghart 公司）；超濾膜（0.22 μm，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙葉提取物的制備和分離

按照文獻(xiàn)[14-15]所報道的方法，制備煙葉提取物，采用凝膠滲透色譜（GPC）進(jìn)行分離。

1.2.2 辣感特征流份的定位和特征組分富集

由10 位經(jīng)過味覺校正和訓(xùn)練[16]的評價人員評價各流份的滋味特征，從中篩選出具有辣感的特征流份。將確定的辣感特征流份合并，冷凍干燥后得到的淺黃色固體即為辣感特征組分。滋味評價結(jié)果在8 位以上評價人員的意見一致時被視為有效結(jié)果。

1.2.3 辣感特征組分的定性分析

將辣感特征組分溶于甲醇中，用0.22 μm 尼龍濾頭過濾后進(jìn)行GC/MS 分析。GC/MS 條件為：

色譜柱：DB-5MS（60 m×250 μm×0.25 μm）；載氣：He；柱流量：1 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度50 ℃，以3 ℃/min 速率升至240 ℃并保持3 min；進(jìn)樣量：1 μL；分流模式：不分流；傳輸線溫度：250 ℃；離子源：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描模式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：33～450 amu；溶劑延遲：8.2 min。利用NIST17 和Wiley 譜庫，以匹配度高于85%者定性。

1.2.4 辣感特征組分溶液中煙堿含量的定量分析

按YC/T 383—2010[17]推薦的煙堿測定方法，將辣感特征組分用含有內(nèi)標(biāo)2-甲基喹啉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%）的三乙胺-三氯甲烷配制為溶液，采用GC/MS 測定其中的煙堿，平行測定2 次，結(jié)果取平均值。

1.2.5 辣感特征組分溶液和復(fù)配溶液的TDA 比較

將辣感特征組分配制為水溶液（溶液A），并依據(jù)1.2.4 節(jié)所得定量結(jié)果復(fù)配煙堿水溶液（溶液B），使溶液A 和B 中煙堿的濃度相同，并對其進(jìn)行TDA 比較研究。

TDA 比較方法：將溶液A 和溶液B 分別逐級等比稀釋5 次，獲得兩組各6 個濃度等比降低的溶液序列，記錄各溶液的稀釋倍數(shù)。參照文獻(xiàn)[14-15]報道的方法，由10 位味覺評價人員對上述兩組溶液序列進(jìn)行滋味特征辨識：針對每個溶液，評價人員僅通過滋味特征評價，從溶液和2 個空白水樣中辨識出該溶液；8 位以上評價人員結(jié)論一致時的辨識結(jié)果為有效結(jié)果，否則即認(rèn)為該濃度下待評價溶液無法與空白水樣品區(qū)分。對比兩組溶液序列中可辨識最小濃度溶液的稀釋倍數(shù)。

1.2.6 辣感成分在卷煙中的作用評價

將辣感關(guān)鍵成分煙堿以乙醇為溶劑配制成溶液，采用加香注射機(jī)向空白卷煙中加香，注射量為4 mg/支。由15 位具有省級或以上資質(zhì)的評吸人員組成卷煙感官評價小組，依據(jù)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 497—2014[1]推薦的中式卷煙風(fēng)格感官評價方法，從香氣風(fēng)格（包含嗅香和評吸）、口味風(fēng)格、舒適感特征、煙氣特征4 個方面對空白卷煙及加香卷煙進(jìn)行感官評價，各指標(biāo)最終評吸結(jié)果為15位評委所給出分值的均值；香氣風(fēng)格嗅香指標(biāo)（評判分值0～3）、香氣風(fēng)格評吸指標(biāo)（0～10）、口味風(fēng)格指標(biāo)（分值0～10）、煙氣特征指標(biāo)（分值0～10）強(qiáng)度與分值呈正比，分值越高，強(qiáng)度越大；舒適感特征指標(biāo)（分值0～10）強(qiáng)度與分值呈反比，分值越高，刺激越小。

2 結(jié)果與討論

2.1 煙葉提取物的GPC 感官導(dǎo)向分離、定位和定性分析

通過煙葉提取物的GPC 分離共得到40 個流份，各流份的滋味特征評價結(jié)果如前期研究中所述[14-15]。流份F15～F17 具有明顯的辣感特征，將其合并后冷凍干燥，得到的組分表現(xiàn)出強(qiáng)烈辣感。將辣感特征組分溶于甲醇后按1.2.3 節(jié)所述方法進(jìn)行GC/MS 定性分析，所得總離子流圖如圖1 所示。

圖1 煙葉提取物辣感特征組分GC/MS 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram（GC/MS）of SCC obtained from tobacco extract

利用NIST17 和Wiley 譜庫對辣感特征組分進(jìn)行定性分析，得到4 個質(zhì)譜匹配度大于85%的色譜峰，定性結(jié)果見表1。利用4 種物質(zhì)的標(biāo)樣進(jìn)行感官評價，發(fā)現(xiàn)癸烷、十一烷和十二烷對所分離組分的辣感特征無貢獻(xiàn)，而煙堿則表現(xiàn)出明顯的辣感特征，這說明煙堿對所分離組分的辣感特征有直接貢獻(xiàn)。值得注意的是，關(guān)于煙堿在口腔中的感官特征文獻(xiàn)中的報道并不一致，部分文獻(xiàn)報道煙堿會產(chǎn)生辣感或刺痛感[18-20]，而也有文獻(xiàn)報道煙堿會產(chǎn)生苦味[21-22]。在本研究中，逐級稀釋煙堿水溶液直至閾值以下，發(fā)現(xiàn)煙堿均表現(xiàn)為辣感特征。

表1 辣感特征組分的GC/MS 分析結(jié)果Tab.1 GC/MS analysis result of SCC

2.2 辣感特征組分中煙堿含量的定量分析

按照YC/T 383—2010[17]推薦的煙堿測定方法，對辣感特征組分煙堿含量進(jìn)行定量測定：將辣感特征組分用0.01%的三乙胺-三氯甲烷配制質(zhì)量濃度為1 764 μg/mL 的溶液，采用GC/MS 測定其中煙堿濃度，樣品在選擇離子監(jiān)測（Selected ion monitoring，SIM）模式下的掃描圖見圖2。結(jié)果表明，煙堿濃度為126.7 μg/mL，計(jì)算可得煙堿特征組分煙堿的含量為71.8 mg/g。

圖2 辣感特征組分中煙堿的GC/MS 選擇離子掃描圖Fig.2 SIM chromatogram of nicotine in SCC by GC/MS

2.3 辣感特征組分溶液和煙堿復(fù)配水溶液的TDA 實(shí)驗(yàn)

配制濃度為8.705 mg/mL 的辣感特征組分水溶液（溶液A），其中煙堿濃度為8.705 mg/mL×71.8 μg/mg = 625 μg/mL；配制濃度為625 μg/mL 的煙堿復(fù)配水溶液（溶液B）。按照1.2.5 節(jié)所述方法，對溶液A 和B 進(jìn)行TDA 比較分析，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯觯?dāng)稀釋倍數(shù)為8 時，辣感特征組分溶液A 和復(fù)配溶液B 均不再表現(xiàn)出辣感特征。同時，對序列起始溶液（稀釋倍數(shù)為0）的辣感強(qiáng)度的比較顯示，兩溶液的辣感強(qiáng)度相當(dāng)。盡管由于GC/MS 定性的局限性，辣感特征組分中可能存在其他具有辣感的物質(zhì)，但是溶液A 和B 在相同的稀釋倍數(shù)下表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)睦备袕?qiáng)度，說明煙堿仍可基本代表辣感特征組分的物質(zhì)，是初烤煙葉辣感的關(guān)鍵成分。

表2 辣感特征組分溶液及煙堿復(fù)配水溶液的TDA 結(jié)果Tab.2 TDA results of SCC solution and recombined nicotine solution

2.4 辣感成分煙堿在卷煙中的感官作用評價

煙堿是煙草制品的核心成分之一，它不僅具有使煙草消費(fèi)者產(chǎn)生生理滿足感的作用，還對卷煙的感官特征有很大影響。目前煙堿感官作用相關(guān)研究集中于煙堿與煙氣勁頭的關(guān)系上，如陳建潭等[23]分析了煙氣粒相物水溶液的pH、煙氣總煙堿及游離煙堿含量與煙氣勁頭的關(guān)系，結(jié)果表明煙氣勁頭與煙氣游離煙堿含量密切相關(guān)，游離煙堿含量越高，勁頭越大。外部堿源如碳酸鉀[24]、氫氧化鈉[25-26]的加入也會使卷煙主流煙氣的pH 升高，主流煙氣中游離煙堿的量增加，進(jìn)而導(dǎo)致煙氣勁頭增大。在明確煙堿是初烤煙葉辣感關(guān)鍵成分后，針對煙堿對卷煙其他感官品質(zhì)，尤其是卷煙刺激性的影響進(jìn)行了系統(tǒng)考察。

空白卷煙和添加辣感成分卷煙的嗅香香氣風(fēng)格對比如圖3 所示，加入辣感成分后，卷煙的嗅香特征完全不受影響。

空白卷煙和添加辣感成分卷煙的煙氣香氣風(fēng)格對比如圖4 所示。加入辣感成分后，除烘焙香和清香有稍許下降外，煙氣的香氣特征基本保持不變。卷煙嗅香和煙氣香氣幾乎不發(fā)生變化，符合煙堿本身揮發(fā)性不強(qiáng)的性質(zhì)。

圖3 空白卷煙（a）和添加辣感成分卷煙（b）的嗅香香氣風(fēng)格對比Fig.3 Comparing aroma style between reference cigarette（a）and cigarette flavored with nicotine（b）

空白卷煙和添加辣感成分卷煙的味覺風(fēng)格對比如圖5 所示，辣感成分的加入對卷煙煙氣的味覺風(fēng)格沒有影響，這符合煙堿主要產(chǎn)生化學(xué)感覺而不是味覺的特征。從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的感官評價和添加卷煙后的評吸驗(yàn)證可知，煙堿均表現(xiàn)為辣感而不產(chǎn)生苦味。

空白卷煙和添加辣感成分卷煙的舒適感和煙氣特性對比如圖6 所示，辣感成分的加入顯著提升了煙氣勁頭，但口腔、喉部和鼻腔的刺激明顯增強(qiáng)，煙氣細(xì)膩程度受到影響，透發(fā)性下降。

圖5 空白卷煙（a）和添加辣感成分卷煙（b）的味覺風(fēng)格特征對比Fig.5 Comparing taste characteristics between reference cigarette（a）and cigarette flavored with nicotine（b）

圖6 空白卷煙和添加辣感成分卷煙的舒適感特征和煙氣特征對比Fig.6 Comparing comfortableness characteristics and smoking characteristics between reference cigarette and cigarette flavored with nicotine

3 結(jié)論

利用凝膠滲透色譜對煙葉提取物進(jìn)行了感官導(dǎo)向分離，獲得了初烤煙葉中辣感最強(qiáng)烈的部分辣感特征組分；利用GC/MS 對所得特征組分進(jìn)行了定性分析，發(fā)現(xiàn)煙堿是其主要成分，標(biāo)樣感官評價證明煙堿對辣感特征有直接貢獻(xiàn)；對辣感特征組分中煙堿含量進(jìn)行了定量分析，并通過TDA 實(shí)驗(yàn)明確了煙堿是辣感特征組分中辣感的主要來源。卷煙加香實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，煙堿與卷煙刺激性有密切關(guān)系，煙堿的加入可在顯著提升煙氣勁頭的同時，使口腔、喉部和鼻腔的刺激明顯增強(qiáng)。