欒順蓮，李玉娜，金丹，高勇，王德強，邵翠杰*

急性炎性痛是目前臨床工作中最為常見的病理性疼痛之一，是嚴重影響人類身體健康和生活質(zhì)量的臨床難題，而其如果不能被充分控制，就有可能轉(zhuǎn)化成為慢性炎性痛。因此探討其發(fā)病機制和治療措施有重要的臨床意義。

甲硫氨酸為人體必需氨基酸之一，人體內(nèi)不能合成，必須依靠外源補充。天然得到的甲硫氨酸為L-甲硫氨酸（L-MET）。甲硫氨酸在人體內(nèi)與ATP結(jié)合生成S-腺苷氨酸（SAM），其是體內(nèi)甲基的最重要的直接供體，修飾DNA、RNA及組蛋白，進而影響DNA復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，在表觀遺傳調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用［1］。DNA甲基化作為DNA序列的修飾方式，是一種重要的表觀遺傳調(diào)節(jié)機制，能夠在不改變DNA分子一級結(jié)構(gòu)的情況下調(diào)節(jié)基因組的功能，在生命活動中起著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化參與調(diào)控學習記憶能力［2］，而疼痛敏感化調(diào)節(jié)的細胞學基礎(chǔ)與細胞記憶密切相關(guān)［3］，DNA甲基化很有可能參與急性疼痛的調(diào)控過程［4-7］。而甲硫氨酸作為人體必需氨基酸之一，能夠參與并影響體內(nèi)DNA甲基化，對治療或預防急性炎性痛是否有作用則未見報道。本研究采用甲醛溶液誘導急性炎性痛模型大鼠，觀察注射L-MET是否會減輕大鼠足底急性炎性痛并探討其機制，以期為尋找新的疼痛生物標志物和開發(fā)理想的鎮(zhèn)痛新藥提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗時間 本研究時間為2017年7月—2018年12月。

1.2 實驗動物 健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g，清潔級，由濟南實驗動物中心提供〔合格證號SYXK（魯）2018 0022〕。12 h晝夜交替環(huán)境飼養(yǎng)，飲水、食物自由攝取，所有動物適應環(huán)境72 h后開始實驗。本實驗經(jīng)濱州醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準，所有操作遵守國際疼痛研究會相關(guān)指南及《實驗動物機構(gòu)認可標準法規(guī)實用手冊》［8］，所有動物實驗符合醫(yī)學倫理學標準。

1.3 實驗儀器與試劑 Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀（美國 Bio-Rad公司），大鼠疼痛自主活動記錄儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司），甲硫氨酸（北京索萊寶科技有限公司），甲醛溶液（國藥集團化學試劑有限公司），全基因組DNA甲基化定量試劑盒（北京艾德科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒〔寶生物工程（大連）有限公司〕，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，動物組織基因組提取試劑盒（美國Axygen公司）。

1.4 實驗動物分組以及給藥方法 將大鼠按照隨機數(shù)字表法分為A組（0.9%氯化鈉溶液+0.9%氯化鈉溶液組）、B組（L-MET+0.9%氯化鈉溶液組）、C組（0.9%氯化鈉溶液+2 g/L甲醛溶液組）、D組（L-MET+2 g/L甲醛溶液組），每組6只。B組、D組采用1 ml注射器抽取L-MET（應用超純水將L-MET配置成飽和溶液），腹腔注射，2次/d，總量不超過0.18 mg/kg，連續(xù)注射3 d；A組、C組注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.5 行為學檢測 將大鼠置于透明塑料觀察箱（30 cm×30 cm×30 cm），箱體潔凈消毒干燥，距離箱體1 m處裝攝像機，可準確完整拍攝動物疼痛行為反應。注射甲醛溶液前30 min將大鼠置于箱內(nèi)熟悉環(huán)境。C組、D組左后足足跖部皮下注射2 g/L甲醛溶液20 μl，制作甲醛溶液所致急性炎性痛模型，大鼠足部腫脹并會出現(xiàn)相應的抬足舔足行為視為模型制作成功；A組、B組注射等量0.9%氯化鈉溶液。注射完畢后立即將大鼠置入觀察箱內(nèi)，全程記錄給藥后60 min大鼠行為學，并記錄疼痛次數(shù)（以舔/抬足次數(shù)為準），每隔3 min為1個觀察時段，共分20個觀察時段。

1.6 大鼠脊髓組織的提取 行為學檢測結(jié)束后，將大鼠處死，用剪刀剪斷大鼠脊柱，取脊髓L4～L6之間脊髓組織，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 大鼠脊髓全基因組DNA的提取 采用AXYGEN公司動物組織基因組提取試劑盒（離心柱法）提取大鼠脊髓組織DNA，步驟簡述如下：取約100 mg脊髓組織，剪碎置于1.5 ml離心管中并標記相應序號。每個離心管中加入裂解液150 μl、蛋白酶K 20 μg，混勻。將離心管置于56 ℃恒溫水浴箱中，放置4 h，每隔10 min震蕩1次離心管，促使樣品充分混合裂解。加入200 μl平衡緩沖液，震蕩混勻；加入200 μl無水乙醇，震蕩混勻。將所有溶液轉(zhuǎn)移至帶有離心柱的離心管中，8 000 r/min離心1 min（離心半徑50 cm），棄上清液。向帶有離心柱的離心管中加入500 μl的沖洗緩沖液1，8 000 r/min離心2 min（離心半徑50 cm），棄上清液。向帶有離心柱的離心管中加入500 μl的沖洗緩沖液2，14 000 r/min離心2 min（離心半徑50 cm），棄上清液。再將帶有離心柱的離心管放回收集管中，12 000 r/min離心2 min（離心半徑50 cm），室溫下靜置10 min，將殘余沖洗緩沖液2徹底晾干去除。將吸附柱轉(zhuǎn)入新的離心管中，向吸附膜的中間滴加200 μl 56 ℃ Buffer GE。旋緊管蓋，室溫下靜置8 min，8 000 r/min離心2 min（離心半徑50 cm），收集溶液至離心管中，以增加DNA產(chǎn)量。將提取的全基因組DNA置于-20 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 大鼠脊髓全基因組DNA甲基化水平測定 采用北京艾德科技有限公司全基因組DNA甲基化試劑盒（比色法），按照說明書進行操作。簡單描述如下：應用試劑盒提供的陽性對照做出標準曲線。提取全基因組DNA，將試劑盒中提供的陽性和陰性對照樣本加入試劑盒中經(jīng)過預先處理的96孔板中，室溫放置90 min，使樣本DNA與試劑盒中物質(zhì)充分結(jié)合，充分洗滌后加入捕獲液體，室溫避光放置60 min，抽吸并洗滌5次，然后加入檢測液體，室溫避光孵育30 min，抽吸并洗滌5次，最后加入顯影液，室溫避光孵育5 min，監(jiān)測樣本孔以及對照孔中顯色變化，當標準孔中對照的顏色變成藍色，并由藍色開始向黃色轉(zhuǎn)變時，每孔中加入阻止液，并在450 nm處用熒光分光光度計在2～15 min讀取光密度值（OD值）。每個樣品有3個復孔，實驗重復最少3次。按照下列公式計算DNA甲基化水平。DNA甲基化水平=〔（樣本OD值-陰性對照OD值）/X〕/〔（陽性對照OD值-陰性對照OD值）×10〕×100%，其中X表示不同種屬DNA的GC構(gòu)成比，大鼠是42。

1.9 大鼠脊髓DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b RNA水平檢測 每100 mg脊髓組織樣品中加入TRIZOL 1 ml，采用電動勻漿器勻漿。用TAKARA公司試劑盒提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，調(diào)節(jié)每組樣品到濃度一致，-20 ℃保存?zhèn)溆?。DNMT1上游引物為5'-CTCGTGGTCTCCTTCCTCAG-3'，下游引物為5'-AGGGGAAGAGAGATGGCATT-3'；DNMT2上游引物為5'- GCAGTCCGTAGCAGAGTC-3'，下游引物為5'-GGCGGAACAAGAATTACA-3'；DNMT3a上游引物為5'-ACGCCAAAGAAGTGTCTGCT-3'，下游引物為5'-CTTTGCCCTGCTTTATGGAG-3'；DNMT3b上游引物為5'-CATAAGTCGAAGGTGCGTCGT-3'，下游引物為5'-ACTTTTGTTCTCGCGTCTCCT-3'。進行實時熒光定量PCR，總反應體系為10 μl，包括目的基因或β-actin 引物 1.0 μl、cDNA 0.5 μl、5×SYBR GREEN 2.0 μl、焦碳酸二乙酯（DEPC）水6.5 μl。反應條件為：95 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，進行PCR擴增，共35個循環(huán)，具體溫度、時間按照引物設(shè)計說明書和擴增情況進行調(diào)整。記錄各個基因和β-actin的CT值，二者比值越大說明該樣品含目的基因拷貝數(shù)越大。實驗獨立重復3次。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學比較 A組、B組大鼠無明顯不適異常反應；C組、D組大鼠出現(xiàn)躁動不安、注射足抬起不著地、舔咬或抖動注射足等反應，其疼痛行為反應呈典型的雙相變化，從注射后即刻開始，持續(xù)3～5 min的急性疼痛時相（第一時相），5～10 min的靜息期，隨后出現(xiàn)可持續(xù)0～45 min的繼發(fā)性疼痛時相（第二時相）（見圖1）。各組大鼠不同時間點疼痛次數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；C組、D組大鼠各時間點疼痛次數(shù)均多于A組、B組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；D組大鼠6～39 min疼痛次數(shù)少于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 各組大鼠脊髓全基因組DNA甲基化水平比較各組大鼠脊髓全基因組DNA甲基化水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；B組、D組大鼠脊髓全基因組DNA甲基化水平高于A組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；C組、D組大鼠脊髓全基因組DNA甲基化水平低于B組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；D組大鼠脊髓全基因組DNA甲基化水平高于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.3 各組大鼠脊髓 DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b RNA水平比較 各組大鼠脊髓DNMT1、DNMT2 RNA水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各組大鼠脊髓DNMT3a、DNMT3b RNA水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。C組、D組大鼠脊髓DNMT3a、DNMT3b RNA水平高于A組、B組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；D組大鼠脊髓DNMT3a RNA水平低于C組，DNMT3b RNA水平高于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表3）。

圖1 各組大鼠疼痛抬足頻率Figure 1 The pain-induced lift frequency of each group

3 討論

急性炎性痛是臨床常見癥狀，如果不及時控制會轉(zhuǎn)化成為慢性炎癥，增加患者痛苦并加重醫(yī)療負擔，因此及時治療并預防急性炎性痛有重要的臨床意義。

L-MET與生物體內(nèi)各種含硫化合物的代謝密切相關(guān)，缺乏時會引起食欲減退、生長減緩或體質(zhì)量減輕、腎臟腫大和肝臟鐵堆積等現(xiàn)象，最后導致出現(xiàn)肝壞死或纖維化。外源性補充L-MET可以通過參與調(diào)節(jié)體內(nèi)某些DNA的甲基化，從而維持人體健康。L-MET作為甲基供體參與體內(nèi)DNA甲基化，CpG結(jié)合蛋白（MeCP2）結(jié)合DNA上甲基化的CpG位點后，可抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控慢性炎性痛模型造成的傷害性疼痛［5］。那么急性疼痛狀態(tài)下，作為疼痛初級傳入中樞的脊髓甲基化程度是怎么變化的？外源性補充L-MET對疼痛是否有影響，對DNA甲基化是否有影響？其通過什么方式/機制改善疼痛的？因此，本研究通過體外補充人體必需氨基酸L-MET，觀察L-MET是否對甲醛溶液所致的大鼠急性炎性痛有減輕作用，其減輕疼痛作用的機制的是否跟DNA甲基化有關(guān)。

表1 各組大鼠不同時間點疼痛次數(shù)比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of pain frequency of each group at different time points

表1 各組大鼠不同時間點疼痛次數(shù)比較（±s，n=6）Table 1 Comparison of pain frequency of each group at different time points

注：A組=0.9%氯化鈉溶液+0.9%氯化鈉溶液組，B組=L-甲硫氨酸+0.9%氯化鈉溶液組，C組=0.9%氯化鈉溶液+2 g/L甲醛溶液組，D組=L-甲硫氨酸+2 g/L甲醛溶液組；與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

時間（min） A組 B組 C組 D組 F值 P值3 11.12±1.10 9.23±2.01 174.67±10.31ab 167.37±9.47ab1 495.00 ＜0.01 6 10.58±1.23 8.34±2.01 37.39±4.31ab 75.7±4.67abc 355.50 ＜0.01 9 9.12±1.32 10.57±3.20 60.27±5.67ab 36.39±1.47abc 416.60 ＜0.01 12 8.01±2.30 12.38±2.14 65.79±6.47ab 42.79±4.37abc 326.80 ＜0.01 15 12.01±3.01 10.34±2.01 169.49±11.34ab 35.38±4.31abc 3 945.00 ＜0.01 18 10.30±2.01 9.65±1.32 132.37±4.57ab 37.79±2.13abc 1 352.00 ＜0.01 21 13.01±3.21 8.31±1.02 89.34±3.79ab 42.45±3.69abc 552.30 ＜0.01 24 15.32±1.3 7.05±1.68 75.37±5.13ab 40.37±1.39abc 162.70 ＜0.01 27 10.31±1.32 9.34±3.14 69.19±3.79ab 32.79±1.39abc 250.10 ＜0.01 30 9.30±1.36 6.47±1.64 79.37±4.97ab 37.48±4.78abc 639.40 ＜0.01 33 7.24±3.01 9.27±2.01 73.68±6.79ab 30.56±3.58abc 4 253.50 ＜0.01 36 6.01±1.01 10.31±2.47 70.67±5.64ab 31.13±2.34abc 332.80 ＜0.01 39 8.36±2.01 11.31±2.03 38.47±3.79ab 29.89±2.37abc 382.20 ＜0.01 42 10.32±3.64 13.56±2.47 35.34±2.97ab 31.27±1.69ab 23.16 ＜0.01 45 11.36±4.14 12.69±2.34 27.17±3.14ab 29.37±4.37ab 19.98 ＜0.01 48 10.54±2.13 10.33±2.01 25.19±3.47ab 26.37±3.25ab 29.18 ＜0.01 51 9.47±1.31 8.69±1.35 26.19±3.16ab 27.79±2.13ab 59.09 ＜0.01 54 8.46±3.01 7.46±1.34 25.16±2.37ab 23.49±3.12ab 95.97 ＜0.01 57 7.31±2.07 6.21±1.38 18.67±3.79ab 21.46±2.37ab 49.71 ＜0.01 60 6.31±1.31 8.47±2.14 22.15±2.13ab 22.27±2.37ab 50.44 ＜0.01

表2 各組大鼠脊髓全基因組DNA甲基化水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of the whole genome DNA methylation level in spinal cord in 4 groups of rats

表2 各組大鼠脊髓全基因組DNA甲基化水平比較（±s，n=6）Table 2 Comparison of the whole genome DNA methylation level in spinal cord in 4 groups of rats

注：與A組比較，aP＜0.05；與B組比較，bP＜0.05；與C組比較，cP＜0.05

組別 脊髓全基因組DNA甲基化A組 0.57±0.02 B組 1.77±0.36a C組 0.45±0.01b D組 1.22±0.14abc F值 60.32 P值 ＜0.01

表3 各組大鼠脊髓DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b RNA水平比較（x ±s，n=6）Table 3 Expression of DNMT1，DNMT2，DNMT3a，and DNMT3b RNA in 4 groups of rats

DNA甲基化要在DNMT的作用下才能夠完成［9］。DNA甲基化模式形成、穩(wěn)定與維持受DNMT的精確調(diào)控，DNMT可分為DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b等不同亞型。其中DNMT3a、DNMT3b負責甲基化的建立，DNMT1負責維持DNA甲基化，DNMT1單獨下調(diào)會導致基因去甲基化并重新激活轉(zhuǎn)錄［10］。DNMT1、DNMT3a與DNA甲基化CpG結(jié)合蛋白2（MeCP2）協(xié)同調(diào)節(jié)DNA正常甲基化的維持與基因表達，控制軸突生長和突觸形成，對突觸可塑性與中樞神經(jīng)系統(tǒng)情緒行為的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用［11］。以上證據(jù)以及本研究組前期研究結(jié)果提示，DNMT和甲基化結(jié)合蛋白（MBDs）好比控制神經(jīng)功能失調(diào)的“分子開關(guān)”，外源性調(diào)控DNMT和MBDs的差異性表達可以改變DNA甲基化模式，實現(xiàn)可逆甲基化表觀遺傳修飾而影響神經(jīng)行為學，這可能與疼痛的發(fā)生發(fā)展與維持有關(guān)［5-7］。

本研究結(jié)果顯示，A組、B組大鼠無明顯不適異常反應；C組、D組大鼠出現(xiàn)躁動不安、注射足抬起不著地、舔咬或抖動注射足等反應，其疼痛行為反應呈典型的雙相變化，從注射后即刻開始，持續(xù)3～5 min的急性疼痛時相（第一時相），5～10 min的靜息期，隨后出現(xiàn)可持續(xù)0～45 min的繼發(fā)性疼痛時相（第二時相）。C組、D組大鼠各時間點疼痛次數(shù)均多于A組、B組；D組大鼠6～39 min疼痛次數(shù)少于C組。說明L-MET能夠減輕急性炎性痛大鼠的主觀疼痛感覺。B組、D組大鼠脊髓全基因組DNA甲基化水平高于A組，C組、D組大鼠脊髓全基因組DNA甲基化水平低于B組，D組大鼠脊髓全基因組DNA甲基化水平高于C組，說明L-MET促使一些基因發(fā)生了甲基化，而DNA甲基化參與了甲醛溶液誘導急性炎性痛的發(fā)生發(fā)展過程，從而導致大鼠疼痛程度減輕，舔/抬足次數(shù)減少。但是具體信號通路是什么，參與的基因蛋白各是什么？還有待于進一步研究。

DNA甲基化受到DNMT精確調(diào)控，那么疼痛狀態(tài)下或者外源性給予L-MET后DNMT是否有變化？本研究結(jié)果顯示，各組大鼠脊髓DNMT1、DNMT2 RNA水平無差異；C組、D組大鼠脊髓DNMT3a、DNMT3b RNA水平高于A組、B組；D組大鼠脊髓DNMT3a RNA水平低于C組，DNMT3b RNA水平高于C組；說明不同DNMT在疼痛中發(fā)揮作用不同。但本研究并未深入研究L-MET具體的調(diào)節(jié)基因，哪一些基因甲基化水平增高，哪一些基因甲基化水平降低，激活或者抑制哪一些基因表達可參與疼痛調(diào)節(jié)，這些均有待于進一步的研究證實。

綜上所述，甲醛溶液誘導的急性炎性痛大鼠脊髓DNA甲基化水平降低，DNMT同時發(fā)生不同程度改變；腹腔注射L-MET能夠改變基因甲基化水平并減輕甲醛溶液誘導的急性炎性痛大鼠行為學表現(xiàn)。這為臨床急性炎性痛的治療提供了理論基礎(chǔ)和實驗研究基礎(chǔ)。

志謝：本實驗在濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床實驗中心完成，感謝實驗室王曉紅博士、劉曉晨碩士在實驗上給予的幫助，感謝徐州醫(yī)學院曹君利教授、楊俊霞碩士給予的理論指導。

作者貢獻：欒順蓮進行研究設(shè)計與實施、資料收集整理，撰寫論文并對文章負責；李玉娜、金丹、高勇、王德強進行研究實施與評估、資料收集；邵翠杰進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。