任麗君，王軍杰，馬豪莉，侯會娟，司馬盼盼，宋瑞捧

糖尿病傳統(tǒng)上被稱為“無癥狀疾病”，直到進展到靶器官嚴重損傷時才表現(xiàn)出癥狀［1］。作為成年人發(fā)病最普遍的糖尿病—2型糖尿?。═2DM），是一種由環(huán)境、遺傳因素、生活方式共同相互作用而產(chǎn)生的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾?。?］。同時T2DM能夠?qū)χT多，如：心血管疾病、神經(jīng)性疾病、腦卒中、腎病、視力障礙、潰瘍性疾病、消化系統(tǒng)疾病和抑郁癥等代謝并發(fā)癥起到潛在的貢獻作用［3］。

利拉魯肽與人體內(nèi)源性酰化胰高血糖素樣肽1（GLP-1）氨基酸序列組成高度相似，既保持了天然GLP-1的功效，又增加了其代謝穩(wěn)定性［4］。在利拉魯肽的Ⅲ期臨床試驗中，無論是單藥治療還是聯(lián)合其他藥物治療，利拉魯肽均能有效降低患者血糖水平，目前已經(jīng)成為臨床上常用的腸促胰島素激素藥物［5］。但臨床應用過程中尚存在較大的個體差異，研究發(fā)現(xiàn)某些候選基因的多態(tài)性可能影響T2DM患者對疾病進展的易感性或風險，因此對于T2DM的基因多態(tài)性研究具有重要意義。

通過候選基因和全基因組關聯(lián)性分析研究至少發(fā)現(xiàn)了近100個遺傳變異對T2DM有貢獻作用的相關位點［6］。目前發(fā)現(xiàn)位于6Q14-Q15位置的內(nèi)源性大麻素受體1型基因（CNR1）在糖尿病及其并發(fā)癥中發(fā)揮重要作用［7］，全基因包括了8個外顯子，在不同人群中具有較大的差異。其中CNR1基因密碼子435的沉默基因的多態(tài)性位點1260G＞A與肥胖、T2DM以及代謝綜合征等多種疾病有關［8］。因此CNR1基因1260G＞A的單核苷酸多態(tài)性被認為是T2DM的重要關聯(lián)易感基因，由于不同個體基因組的差異既影響T2DM發(fā)生、發(fā)展的風險，也影響個體對于相同治療藥物的不同反應。目前在中國人群中尚未見關于CNR1基因1260G＞A位點和利拉魯肽治療T2DM療效的關聯(lián)研究。因此本研究旨在探討真實世界中利拉魯肽治療早期T2DM患者的臨床療效及CNR1基因多態(tài)性分析，以期找到可以影響利拉魯肽降糖療效個體差異的基因多態(tài)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究設計為回顧性分析，選取2016年3月—2018年10月河南省直第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的早期T2DM患者作為研究對象。納入標準：（1）確診T2DM病程≤2年，且單用二甲雙胍不能達到有效的血糖控制，使用利拉魯肽進行糖尿病治療；（2）體質(zhì)指數(shù)（BMI）為23.0～32.0 kg/m2；（3）空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L，或餐后2 h血糖（2 hPG）≥11.1 mmol/L，糖化血紅蛋白（HbA1c）≥6.5%［9］。排除標準：（1）既往接受GLP-1類藥物治療；（2）使用利拉魯肽進行治療的同時合并其他降糖藥物治療；（3）經(jīng)臨床診斷的其他類型糖尿病、肝腎疾病、心肌梗死或腦卒中等心腦血管疾病及惡性腫瘤。根據(jù)納入與排除標準最終納入230例患者。選取同期本院健康受試者200例，未服用影響糖脂代謝的藥物，排除有糖尿病家族史者。本研究經(jīng)河南省直第三人民醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者或家屬均知曉本研究計劃并簽署知情同意書。

1.2 治療方式 患者均皮下注射利拉魯肽〔諾和諾德（中國）制藥有限公司分包裝，國藥準字：J20160037，規(guī)格：3 ml：18 mg〕進行治療，初始劑量0.6 mg/d，隨后調(diào)整劑量為1.2 mg/d，治療期間可根據(jù)患者的血糖水平以及耐受情況進行調(diào)整，但最大劑量＜1.8 mg/d。

1.3 療效評定 治療16周后評估患者治療前后的BMI、FPG、2 hPG和HbA1c水平。其中身高為患者入院時的身高，體質(zhì)量為患者治療前和治療16周后空腹狀態(tài)下的體質(zhì)量。治療前及治療16周后抽取患者靜脈血2 ml，送至醫(yī)院檢驗科進行測定，其中，F(xiàn)PG和2 hPG采用己糖激酶法測定，HbA1c采用低壓液相色譜法測定。

1.4 DNA提取及基因分型 抽取研究對象外周靜脈 血 5 ml， 采 用 Chelex-100（Bio-Rad，Hercules，CA）從全血中提取基因組DNA，于-20 ℃冰箱保存，用于聚合酶鏈反應（PCR）擴增。設計1260G＞A位點（rs1049353）的上下游PCR引物，對該位點及附近的DNA片段進行擴增，上游引物序列5'-GAAAGCTGCATCAAGAGCCC-3'，下游引物序列5'-TTTTCCTGTGCTGCCAGGG-3'，擴增條件：95 ℃初始變性6 min，隨后35個94 ℃循環(huán)30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，72 ℃延伸 7 min。37 ℃用 5 U MSP Ⅰ限制性核酸內(nèi)切酶（德國圣萊昂羅特酵素股份有限公司）將10 μl的PCR產(chǎn)物過度消化。通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離消化產(chǎn)物，A等位基因被切割成92、19 bp兩個片段，G等位基因保持未切割，產(chǎn)生111 bp的片段。

1.5 PCR擴增及mRNA表達分析 收集患者新鮮外周血標本，但由于新鮮的外周血單核細胞（peripheral blood monouclear cells，PBMC）標本較難獲取，最終納入125例新鮮外周血標本采用淋巴細胞分離液Histopaque-1077對樣本進行PBMC提取。用Trizol試劑提取PBMC中的RNA，real-time PCR儀器進行mRNA表達實驗，引物序列如下：CNR1-1260G＞A上游引物5'-TTCACAGGGCCGCAGAAAG-3'，下游引物5'-GAGGCATCAGGCTCACAGAG-3'。探針序列如下：野生型探針5'-Fam-ATCAAGAGCACGGTCAAGATTGCC-TAMRA-3'，突變型探針5'-VIC-ATCAAGAGCACAGTCAAGATTGCCTAMRA-3'。mRNA采用相對定量法2-ΔΔCt進行計算。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，同組治療前后的比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料的分析采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 入組患者基線臨床資料 230例患者中，男119例，女111例；年齡27～59歲，中位年齡43歲；BMI為（26.6±1.2）kg/m2；FPG 為（10.6±1.2）mmol/L；2 hPG為（14.2±1.2）mmol/L；HbA1c為（9.0±0.9）%。

1260G＞A位點的基因分型結果為：GG型188例（81.7%），GA型39例（17.0%），AA型3例（1.3%），最小等位基因頻率為0.098，三種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.550）。由于AA型例數(shù)較少，后期分析將GA型和AA型患者合并。該位點不同基因型患者性別、年齡、BMI、FPG、2 hPG、HbA1c水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 利拉魯肽對早期T2DM的療效 治療16周后，230例患者BMI為（23.6±1.0）kg/m2，F(xiàn)PG為（5.8±0.8）mmol/L，2 hPG 為（9.9±1.3）mmol/L，HbA1c為（6.4±0.8）%。治療16周后患者BMI、FPG、2 hPG、HbA1c水平均低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義（t配對=29.127、50.475、36.860、32.746；P＜0.001）。

表1 1260G＞A位點不同基因型T2DM患者基線資料比較Table 1 Comparison of baseline clinical characteristics among T2DM patients with different CNR1 1260G＞A genotypes

2.3 CNR1基因多態(tài)性位點易感性分析 對200例健康志愿者的CNR1基因1260G＞A位點進行基因分析，基因型分布頻率如下：GG型163例（81.5%），GA型35例（17.5%），AA型2例（1.0%），最小等位基因頻率為0.10，三種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.937）。T2DM患者和健康志愿者基因型分布比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.104，P=0.949）。

2.4 CNR1基因多態(tài)性位點對利拉魯肽療效的影響治療前，GG型和GA/AA型患者BMI、FPG、2 hPG、HbA1c水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療16周后，GG型和GA/AA型患者2 hPG水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；GA/AA型患者BMI、FPG、HbA1c水平均低于GG型，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。GG型和GA/AA型患者治療16周后BMI、FPG、2 hPG、HbA1c水平均低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.5 CNR1基因多態(tài)性位點對CNR1基因mRNA表達的影響 通過提取PBMC標本中的RNA測定各組CNR1 mRNA的表達情況，并與1260G＞A位點的基因型進行相關性分析。在125例病例樣本中，GG型102例，GA型22例，AA型1例，三種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.876）。AA型患者相對較少，將GA型和AA型合并，共計23例。GG型患者CNR1 mRNA表達水平為（4.2±1.3），高于GA/AA型患者的（2.8±1.2），差異有統(tǒng)計學意義（t=4.728，P＜0.001）。

2.6 不同基因型患者的不良反應情況 使用利拉魯肽治療過程中，患者出現(xiàn)不同程度的惡心嘔吐、低血糖等不良反應。不同基因型患者惡心嘔吐、低血糖及總體不良反應發(fā)生率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表3）。

3 討論

本研究納入了230例接受利拉魯肽治療的早期T2DM患者，通過對CNR1基因1260G＞A位點基因分型并與患者的療效進行關聯(lián)分析。發(fā)現(xiàn)該位點攜帶A等位基因的GA/AA基因型患者相對于野生型GG型患者來說具有更好的控制血糖的相關療效，并通過125例PBMC標本的CNR1 mRNA表達水平分析發(fā)現(xiàn)了該位點不同基因型患者的mRNA表達水平呈現(xiàn)較大的差異。CNR1基因1260G＞A位點可能通過影響該基因mRNA的表達進而影響利拉魯肽對T2DM患者的臨床效果。

表2 1260G＞A位點不同基因型T2DM患者治療前后BMI、FPG、2 hPG和HbA1c水平比較（±s）Table 2 Comparison of BMI，F(xiàn)PG，2 hPG，HbA1c among T2DM patients with different CNR1 1260G＞A genotypes before and after treatment

表2 1260G＞A位點不同基因型T2DM患者治療前后BMI、FPG、2 hPG和HbA1c水平比較（±s）Table 2 Comparison of BMI，F(xiàn)PG，2 hPG，HbA1c among T2DM patients with different CNR1 1260G＞A genotypes before and after treatment

注：與同組治療前比較，aP＜0.05

images/BZ_66_964_485_985_515.pngimages/BZ_66_1407_485_1428_515.pngimages/BZ_66_1844_485_1865_515.png基因型 例數(shù) BMI（kg/m2） FPG（mmol/L） 2 hPG（mmol/L） HbA1c（%）治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后GG 型 188 26.7±1.2 23.6±1.0a 10.6±1.2 5.9±0.7a 14.2±1.2 9.9±1.4a 9.0±0.9 6.4±0.8a GA/AA 型 42 26.3±1.0 22.9±0.7a 10.4±1.1 5.3±0.6a 13.9±1.1 9.5±1.2a 8.8±1.0 6.1±0.7a t值 2.009 4.304 0.991 5.147 1.486 1.716 1.275 2.245 P值 0.068 ＜0.001 0.323 ＜0.001 0.139 0.088 0.204 0.026

表3 1260G＞A位點不同基因型T2DM患者不良反應發(fā)生率比較〔n（%）〕Table 3 Comparison of adverse reactions among T2DM patients with different CNR1 1260G＞A genotypes

目前CNR1基因在T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)病機制和作用靶點仍然不完全清楚，但是越來越多的證據(jù)表明，CNR1系統(tǒng)失調(diào)與多種代謝性疾病有關，如肥胖、血脂異常、胰島素抵抗和炎癥，這些因素也是T2DM的危險因素［10-12］。據(jù)報道，CNR1基因中1260G＞A位點的多態(tài)性與多種病理學相關，如代謝綜合征等［12］、冠狀動脈疾?。?3］和克羅恩?。?4］等。

本研究結果表明，利拉魯肽治療早期T2DM的治療效果良好，治療16周后各項指標與治療前相比，差異存在統(tǒng)計學意義，且不良反應發(fā)生率較低。其中發(fā)現(xiàn)，治療16周后各組基因型患者的各項指標與治療前相比均下降。同時發(fā)現(xiàn)，治療16周后GA/AA型患者的BMI、FPG和HbA1c水平低于GG型患者，表現(xiàn)出優(yōu)于GG型的治療效果。對于GA和AA型患者，GG型患者的mRNA相對表達明顯較高。綜上推斷CNR1基因1260G＞A位點多態(tài)性直接或間接與T2DM的治療效果相關。其作用途徑可能是由于內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)可以通過中樞和外周兩種機制影響患者的攝食行為，過多的CNR1的表達，會直接增加患者的食欲，這從一方面也解釋了GG型患者由于mRNA較高的表達量，影響治療效果。同時攜帶A等位基因的患者在使用利拉魯肽治療后，會減輕對胰島素的抵抗，隨著代謝值的提高而減輕了更多的體質(zhì)量，從而影響利拉魯肽對T2DM治療的臨床效果，與相關研究結果基本一致［15］。此外，臨床中應用利拉魯肽改善T2DM合并肥胖存在其他多種機制［16］，如：直接激活胰島β細胞上的相關肽，促進胰島素的分泌與合成；延長患者胃排空時間，控制患者食欲；抑制胰高血糖素的分泌，降低血糖水平等。已明確報道β細胞功能障礙和胰島素分泌受損是導致T2DM患者出現(xiàn)慢性高血糖的關鍵因素，而不是由胰島素抵抗所致。最新研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可作用于p-AMPKα/NOX2/JNK1/2信號通路對抑制β細胞凋亡，從而改善患者的血糖水平［17-18］。同時，利拉魯肽通過作用于線粒體ATP-鉀等離子通道，對T2DM患者在治療過程中減輕血管損傷，對抗動脈粥樣硬化、降低心血管疾病風險起到保護作用，降低了不良反應的發(fā)生率［19］。

本研究通過對T2DM患者的基因型進行分析，發(fā)現(xiàn)CNR1基因1260G＞A位點可能直接或間接與T2DM的遺傳易感性相關，其GA/AA型可能通過影響該基因mRNA的表達影響利拉魯肽對T2DM患者治療的臨床效果。當然，糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生取決于不同風險等位基因、環(huán)境因素和生活方式之間的相互作用，幾個因素的相互作用可能導致低估或高估所研究多態(tài)性在確定表型中的作用［20］。本研究的數(shù)據(jù)只是本院的臨床數(shù)據(jù)，可能在群體的代表性上存在一定的局限性，不適用于不同遺傳或環(huán)境背景的人群，但為進一步研究CNR1基因1260G＞A位點多態(tài)性對T2DM治療效果的影響提供基礎，并在臨床預測中為藥物治療和藥理學臨床試驗提供了可能的靶點。

利拉魯肽在Ⅲ期臨床試驗中被證實可以有效降低糖尿病患者血糖水平，然而在臨床應用過程中利拉魯肽的降糖效果仍存在較大的個體差異。研究表明，基因多態(tài)性是造成眾多藥物出現(xiàn)個體差異的原因之一。本研究的結果表明CNR1基因1260G＞A位點的GA/AA型可能通過影響該基因mRNA的表達進而影響利拉魯肽對T2DM患者的療效。

作者貢獻：任麗君、宋瑞捧進行文章的構思與設計，對文章整體負責，監(jiān)督管理；任麗君、王軍杰、馬豪莉進行研究的實施與可行性分析；任麗君、侯會娟進行數(shù)據(jù)收集及整理；任麗君、侯會娟、司馬盼盼進行統(tǒng)計學處理；任麗君、侯會娟、司馬盼盼、宋瑞捧進行結果的分析與解釋；任麗君撰寫論文；任麗君、司馬盼盼進行論文的修訂；宋瑞捧負責文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。