王 楠 郭 霞 武俊平 賈 璐 雍 雯 劉 穎 肖慶博 劉美玉 吳麗娥

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，內(nèi)蒙古 包頭 014010

腦微出血(cerebral microbleeds，CMBs)是指腦小血管壁損害，血液從血管壁滲出形成含鐵血黃素，在腦實(shí)質(zhì)沉積為主要特征的亞臨床性腦實(shí)質(zhì)損害[1]。由于其出血量少，臨床上無明顯癥狀和體征，因此，目前診斷主要依靠影像學(xué)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，目前研究發(fā)現(xiàn)，腦微出血的發(fā)生是導(dǎo)致腦出血、缺血性腦卒中、死亡和癡呆發(fā)病的高危因素[2]。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是一種視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分泌的蛋白，具有多種生物學(xué)功能，且其啟動(dòng)子區(qū)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP)可能通過影響基因轉(zhuǎn)錄活性而改變蛋白的表達(dá)。研究顯示，PEDF可能與黃斑變性、糖尿病微血管病變、慢性腎病微血管病變等存在相關(guān)性[3]。目前關(guān)于PEDF及其基因多態(tài)性與腦微出血的相關(guān)性研究尚無報(bào)道，本研究探討血清PEDF及其基因啟動(dòng)子區(qū)rs12948385的多態(tài)性與腦微出血的關(guān)系，旨在為腦微出血的防治提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 研究對象 納入2017-12—2019-09包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科收治的CMBs患者55例為病例組，同期55例健康體檢者為對照組。CMBs診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2015年《中國腦小血管病診治專家共識》[4]，磁共振SWI序列上圓形或卵圓形、質(zhì)地均一，直徑2～5 mm且周圍無水腫的低信號病灶，并除外顱內(nèi)鈣化。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡>18歲；(2)完成常規(guī)MR和SWI檢查確診為CMBs的入院患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)頭部MRI或CT證實(shí)有動(dòng)靜脈畸形、海綿狀血管瘤、毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、急性腦梗死及腦腫瘤患者；(2)影像學(xué)疑似多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎、進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病等白質(zhì)變性疾??；(3)有明確腦外傷史；(4)合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎衰竭，嚴(yán)重感染、自身免疫性疾病；(5)有心臟起搏器、惡性腫瘤者，有血液系統(tǒng)、糖尿病微血管疾病者。

1．2 方法 患者入院后，完成SWI檢查(圖1)。登記患者一般資料和既往史，第2天空腹抽血，完成血常規(guī)、生化、凝血、血糖、尿酸等相關(guān)檢查。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定血清PEDF濃度(江蘇酶免公司)。使用基因組DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)提取全血DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性核酸內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性法(PCR-RFLP)進(jìn)行PEDF-rs12948385基因分型用Prime5.0設(shè)計(jì)引物，由博邁德生物技術(shù)有限公司合成。上游引物為5’-CTACAGGTGCGCGCCAAC-3’，下游引物為5’-CTAAGGCGCACACATTTGCACA-3’。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶HincⅡ 37 ℃水浴20 min消化。根據(jù)酶切后出現(xiàn)片段的大小得出rs12948385的基因分型結(jié)果：GG：351 bp；AA：280 bp、71 bp；GA：351 bp、280 bp、71bp。

2 結(jié)果

2．1 2組一般資料及PEDF濃度比較 CMBs組與健康對照組血小板計(jì)數(shù)和低密度膽固醇比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2組年齡、空腹血糖、同型半胱氨酸、血清PEDF濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較Table 1 Comparison of general information of two groups

注：PLT：血小板；LDL-C：低密度脂蛋白；Hcy：同型半胱氨酸；PEDF：色素上皮衍生因子

圖1 頭顱SWI示雙側(cè)大腦皮質(zhì)多個(gè)直徑2～5 mm的微出血灶(如箭頭所示)Figure 1 SWI of the skull shows multiple microbleeds with diameters of 2 to 5 mm on both sides of the cerebral cortex (showing by the arrows)

2．2 Logistic 回歸分析 將CMBs作為因變量，以年齡、空腹血糖、Hcy、血PEDF作為自變量，做多因素非條件Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，血PEDF、年齡與CMBs明顯相關(guān)(血PEDF，OR=0.980，95%CI0.962～0.998，P<0.05；年齡OR=1.070，95%CI1.000～1.144，P<0.05)。

2．3 基因型分析 PEDF-rs12948385位點(diǎn)的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。2組PEDF-rs12948385的基因型(GG、GA、AA)和等位基因(G/A)的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。由于AA基因型出現(xiàn)頻率小，將AA與GA基因型合并，校正年齡、性別、空腹血糖后與GG基因型相比，AA+GA基因型增加腦微出血的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是GG組的6.443倍(OR=6.443，95%CI=1.082～38.351)。

表2 2組基因型與等位基因的分布頻率比較 [n(%)]Table 2 Comparison of the distribution frequencies of genotypesand alleles of the two groups [n(%)]

3 討論

PEDF是一種多功能蛋白，與多種微血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，但其相關(guān)研究大多局限于視網(wǎng)膜病變、糖尿病微血管病變和腫瘤等疾病。在2005年的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在1型糖尿病大鼠腎臟的腎小球和腎小管上皮細(xì)胞、間質(zhì)組織中PEDF及mRNA的表達(dá)均顯著降低[5]，但2014年一篇報(bào)道通過對2型糖尿病患者平均4 a的隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病腎病患者血清PEDF水平可代償性升高[6]。但對于PEDF的作用機(jī)制還不甚明確，相關(guān)學(xué)者認(rèn)為PEDF通過減少新生血管生成，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性減少蛋白尿漏出[7]。CMBs是一種常見的腦小血管病，與糖尿病腎病同屬于微小血管疾病，同時(shí)，腦和腎臟的小血管系統(tǒng)在整個(gè)心動(dòng)周期中均暴露在高血流、高壓力的血流沖擊下，屬于應(yīng)變血管，具有相似的血管調(diào)控機(jī)制和解剖結(jié)構(gòu)[8]，因此推測PEDF與CMBs的發(fā)生同樣密切相關(guān)。

本研究顯示，CMBs組PEDF血清濃度低于健康對照組，且進(jìn)一步多因素非條件Logistic回歸因分析顯示，血PEDF水平是發(fā)生CMBs的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。眾所周知，PEDF具有抗炎和抗氧化作用[9]，抑制內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生發(fā)展，相關(guān)研究認(rèn)為內(nèi)皮功能障礙可能是CMBs發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，是腦小血管病的根本[10]，因此推測PEDF可能通過抑制內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生從而抑制CMBs的發(fā)生，由于PEDF的降低導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙的抑制作用降低導(dǎo)致微出血的發(fā)生。

本研究提示，2組間年齡、空腹血糖、同型半胱氨酸、血清PEDF濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。目前，相關(guān)研究認(rèn)為，血同型半胱氨酸與腦小血管病的發(fā)生密切相關(guān)[11]，本研究中單因素分析顯示其在CMBs組與健康對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但多因素非條件Logistic回歸因分析顯示血同型半胱氨酸并不是CMBs發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

在PEDF基因多態(tài)性的相關(guān)研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PEDF-rs12948385與視網(wǎng)膜微小血管相關(guān)[12-13]。而CMBs同屬于微小血管疾病，目前關(guān)于CMBs與PEDF-rs12948385d的相關(guān)性目前尚無報(bào)道。rs12948385是PEDF基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游358 bp處存在的G→A突變，CMBs組攜帶A基因的頻率高于健康對照組。在校正年齡、性別及空腹血糖后，與GG基因型相比，GA+AA基因型發(fā)生CMBs的風(fēng)險(xiǎn)高，且GA+AA基因型發(fā)生CMBs的風(fēng)險(xiǎn)是GG型基因的6.271倍。

血PEDF濃度及其啟動(dòng)子區(qū)基因多態(tài)性與腦微出血的發(fā)生可能存在相關(guān)性，但本研究為單中心研究，樣本量相對有限，易產(chǎn)生測量偏倚，且目前關(guān)于PEDF與CMBs的相關(guān)研究尚無相關(guān)報(bào)道，我們的研究需要進(jìn)一步驗(yàn)證。