萬 濤，熊偉杰，王云濤

胃癌是臨床常見惡性腫瘤，近年來隨飲食結(jié)構(gòu)的變化及生活方式的改變，胃癌發(fā)病率逐年上升[1]。目前尚未完全明確胃癌的發(fā)病機(jī)制，多認(rèn)為與環(huán)境因素、基因突變、幽門螺桿菌感染等存在密切聯(lián)系，上述因子均可通過影響機(jī)體功能基因及蛋白表達(dá)導(dǎo)致胃癌發(fā)病[2]。RLIP76為癌基因Ras家族關(guān)鍵成員，屬Ral結(jié)合蛋白，為腺嘌呤核苷三磷酸(adenine nucleoside triphosphate,ATP)依賴非ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可簡化細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，參與ATP水解，早期認(rèn)為RLI76擔(dān)負(fù)谷胱甘肽結(jié)合物轉(zhuǎn)運(yùn)，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥的關(guān)鍵機(jī)制[3]。近年來發(fā)現(xiàn)，RLIP76在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過程中有重要作用，可參與細(xì)胞分裂、增殖、分化及凋亡等過程，且在乳腺癌、肺癌中呈明顯高表達(dá)[4-5]。但對其在胃癌中的作用尚未見報道。CD44則為腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物，屬特殊跨膜糖蛋白，參與淋巴細(xì)胞再循環(huán)過程，目前認(rèn)為CD44蛋白與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為存在密切聯(lián)系，一般正常條件下，胃黏膜組織無CD44蛋白表達(dá)，而一旦檢出CD44高表達(dá)則通常提示患者預(yù)后不佳[6]?；诖耍狙芯炕仡櫺苑治鑫赴┗颊吲R床資料，為進(jìn)一步探討RLI76與CD44在胃癌血清及病理組織中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年3月—2016年5月于成都市第五人民醫(yī)院行手術(shù)治療的82例胃癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理確診為胃腺癌；術(shù)前未接受放化療、靶向治療或生物治療等抗腫瘤治療；手術(shù)嚴(yán)格遵循無瘤原則；術(shù)中均留取癌旁組織及癌組織標(biāo)本；術(shù)后均完成2年隨訪調(diào)查，且病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后3個月內(nèi)死亡者；存在嚴(yán)重圍術(shù)期并發(fā)癥者；其他器官惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至胃部者。其中男52例，女30例；年齡32～76(46.5±9.7)歲；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期34例；腫瘤分化程度：低分化32例，高、中分化50例。

1.2 主要試劑及儀器 鼠抗人CD44單克隆抗體、鼠抗人RLIP76單克隆抗體(均購自美國Abcam公司)，免疫組化試劑盒及通用型二抗試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)、牛血清白蛋白(blood serum albumin,BSA)、枸緣酸、二甲苯(均購自上海信然生物科技有限公司)，生物素化山羊抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)(購自武漢博士德生物工程有限公司)，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(streptavidin-biotin-peroxidase complex,SABC)(購自上海源葉生物科技有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)(購自上海研拓生物科技有限公司)，CD44、RLIP76酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(均購自法國Diaclone公司)；37 ℃恒溫烤箱(購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司)，CX31型光學(xué)顯微鏡(購自日本Olympus公司)，RM-2135型組織切片機(jī)(購自德國Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1 血清RLIP76及CD44表達(dá)測定 術(shù)前3 d、術(shù)后2周均留取患者空腹外周血標(biāo)本2 mL，采用ELISA法測定血清RLIP76及CD44表達(dá)，均嚴(yán)格參照試劑使用說明進(jìn)行操作，酶標(biāo)板每孔包被抗原，37 ℃孵育30 min，甩干液體，吸凈液體，每孔加入兔抗人RLIP76及CD44單克隆抗體100 μL，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次×5 min，加入酶標(biāo)二抗每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，洗板3次，加入底物，避光反應(yīng)10 min，終止反應(yīng)，DAB顯色劑顯色，中性樹膠封片，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算RLIP76及CD44表達(dá)情況。

1.3.2 病理組織RLIP76及CD44表達(dá)測定 術(shù)中取癌組織、癌旁組織(距原發(fā)灶邊緣5 cm以上組織)標(biāo)本，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)組織切片，烤箱內(nèi)固定，溫度為60 ℃，60 min取出，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，去除標(biāo)本內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)，PBS沖洗3次，滴加5% BSA封閉，室溫放置20 min，去除多余液體，滴入一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗，滴入生物素化山羊抗小鼠IgG，5～10 min后PBS沖洗，滴加SABC，37 ℃反應(yīng)20 min，PBS沖洗，DAB顯色，反應(yīng)20 min，蘇木精復(fù)染，脫水后固定，PBS為陰性對照。RLIP76陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿，CD44蛋白陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜，呈棕褐色或棕黃色。每切片隨機(jī)取5個高倍視野進(jìn)行觀察，以免疫積分半定量法[7]評定組織RLIP76、CD44表達(dá)水平。染色強(qiáng)度：無著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；黃褐色為3分。染色比例：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分；陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%為1分；陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%為2分；陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分；陽性細(xì)胞數(shù)≥76%為4分。最終評分=染色比例×染色強(qiáng)度，評分≥8分為陽性。并收集所有患者臨床病理資料及預(yù)后情況，觀察胃癌組織RLIP76、CD44表達(dá)與胃癌臨床病理特點(diǎn)及預(yù)后的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者手術(shù)前后血清RLIP76、CD44表達(dá)水平變化 胃癌患者血清RLIP76表達(dá)水平術(shù)前3 d(46.51±12.25)ng/mL比術(shù)后2周(24.15±9.77)ng/mL高，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.390，P<0.05)；胃癌患者血清CD44表達(dá)水平術(shù)前3 d(445.26±54.74)ng/mL比術(shù)后2周(310.25±38.26)ng/mL高，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(t=26.291，P<0.05)。

2.2 胃癌患者癌組織及癌旁組織RLIP76、CD44陽性表達(dá)情況比較 胃癌患者癌組織RLIP76陽性41例，陽性率為50.00%，CD44陽性48例，陽性率為58.54%，患者癌組織RLIP76、CD44陽性率均高于癌旁組織(χ2=48.681，65.063；均P<0.05)，圖1，圖2。

圖1 胃癌組織與癌旁組織RLIP76表達(dá)(SP×200)

圖2 胃癌組織與癌旁組織CD44表達(dá)(SP×200)

2.3 胃癌患者癌組織RLIP76、CD44表達(dá)與臨床病理參數(shù)單因素分析 不同性別、年齡、腫瘤直徑胃癌患者RLIP76陽性率、CD44陽性率差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；組織分化程度為低分化、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者RLIP76陽性率、CD44陽性率高于組織分化程度為高、中分化、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期及不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表1。

表1 胃癌患者癌組織RLIP76、CD44表達(dá)與臨床病理參數(shù)單因素分析[n(%)]

2.4 胃癌預(yù)后多因素分析 82例患者均完成術(shù)后2年隨訪調(diào)查，RLIP76陽性、CD44陽性與RLIP76陰性、CD44陰性胃癌患者2年生存情況見圖3、圖4，RLIP76陽性、CD44陽性胃癌患者生存時間短于陰性者，但Log-Rank檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.057，P=0.151；χ2=0.452，P=0.501)；Cox分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、RLIP76陽性、CD44陽性均為影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險因素(P<0.05)，表2。

圖3 RLIP76陽性、陰性患者生存分析

圖4 CD44陽性、陰性患者生存分析

表2 胃癌預(yù)后影響因素多因素分析

3 討論

胃癌是臨床高發(fā)惡性腫瘤，死亡率高[8]，目前尚未完全明確其發(fā)生、進(jìn)展、浸潤及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的確切機(jī)制，對發(fā)生廣泛淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌患者尚缺乏有效治療手段。近年來，隨著對腫瘤干細(xì)胞研究的不斷深入，越來越多報道指出，腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物具備自我更新及分化功能，且具備高致瘤性，可為腫瘤細(xì)胞群提供生長及增殖的條件，同時腫瘤干細(xì)胞具備運(yùn)動及遷徙功能，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，在腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中有重要作用[9-10]。Xu等[11]指出，正常狀態(tài)下，腫瘤干細(xì)胞維持穩(wěn)定休眠狀態(tài)，且有較強(qiáng)的耐藥性，對治療敏感性低，導(dǎo)致臨床放化療過程中無法完全殺滅腫瘤干細(xì)胞，是造成其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的原因。

CD44屬特殊跨膜糖蛋白，為重要的細(xì)胞粘附分子，其蛋白可介導(dǎo)淋巴細(xì)胞歸巢及向炎癥、黏膜淋巴組織趨化，并粘附細(xì)胞外基質(zhì)，又被稱為巢受體，可與透明質(zhì)酸、膠原蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞與細(xì)胞外機(jī)制粘附[12]。研究發(fā)現(xiàn)，在較多惡性腫瘤中均可見CD44表達(dá)[13-14]。Hirata等[15]報道，胃癌患者血清CD44水平明顯高于正常健康人。本研究對手術(shù)前后胃癌患者血清CD44水平進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，術(shù)前患者CD44水平處于較高水平，明顯高于Wang等[16]檢測的正常健康人血清CD44水平及患者術(shù)后2周CD44水平，提示胃癌患者血清CD44呈明顯異常上調(diào)表現(xiàn)。同時對胃癌患者癌旁組織及癌組織CD44蛋白水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，癌組織CD44蛋白陽性率明顯高于癌旁組織。行病理相關(guān)因素分析發(fā)現(xiàn)，隨腫瘤臨床分期的上升、腫瘤分化程度的降低，癌組織CD44蛋白陽性率上升，且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者癌組織CD44陽性率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，與早期研究結(jié)論相符，表明癌組織CD44水平的變化在一定程度上反映了胃癌浸潤深度及侵襲、轉(zhuǎn)移能力。此外，進(jìn)行Cox預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，CD44陽性表達(dá)為影響胃癌患者術(shù)后生存的獨(dú)立危險因素，表明腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44不僅參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程，同樣與患者預(yù)后存在密切關(guān)聯(lián)，而通過檢測胃癌組織CD44蛋白表達(dá)狀況，則可科學(xué)預(yù)測胃癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險，指導(dǎo)臨床治療。

RLIP76則為ATP依賴非ABC轉(zhuǎn)運(yùn)型多功能轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬Ral效應(yīng)蛋白，連接Ral鳥嘌呤三核苷酸磷酸(GTP)酶與Rho通路，可將Ral激活后自細(xì)胞漿內(nèi)募集至細(xì)胞膜，調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能[17]。RLIP76初次定位發(fā)現(xiàn)于紅細(xì)胞，近年來發(fā)現(xiàn)，人類心臟、腎臟、白細(xì)胞、卵巢、肺部、肝臟等組織均可見RLIP76表達(dá)，且在肺癌、子宮內(nèi)膜癌患者癌組織均可見RLIP76表達(dá)上調(diào)[18]。張正娥[19]研究發(fā)現(xiàn)，RLIP76物質(zhì)轉(zhuǎn)移功能是導(dǎo)致癌細(xì)胞化療耐藥的關(guān)鍵機(jī)制。也有動物實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，敲除RLIP76基因可影響腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷徙及轉(zhuǎn)移過程[20]。RLIP76為Ras超家族成員，參與脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)控細(xì)胞內(nèi)過氧化脂質(zhì)水平，同時可與Ral、Hsf-1結(jié)合影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡，而下調(diào)RLIP76表達(dá)可抑制癌細(xì)胞侵襲，阻滯細(xì)胞周期。本研究檢測手術(shù)前胃癌患者血清RLIP76水平發(fā)現(xiàn)，術(shù)前胃癌患者RLIP76水平異常上調(diào)，術(shù)后有明顯降低，提示手術(shù)切除胃癌病灶可下調(diào)血清RLIP76水平。同時對癌組織及癌旁組織RLIP76蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，癌組織RLIP76陽性率明顯高于癌旁組織。對RLIP76蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期越高、分化程度越低且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者RLIP76蛋白陽性率較高。預(yù)后監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，RLIP76蛋白陽性為影響患者術(shù)后生存率的獨(dú)立危險因素，提示RLIP76表達(dá)與胃癌發(fā)病、侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測其機(jī)制可能為RLIP76在細(xì)胞形態(tài)改變及細(xì)胞遷徙過程中有重要作用，持續(xù)RLIP76高表達(dá)可能通過影響細(xì)胞生長、遷移、分化、增殖及凋亡而導(dǎo)致胃癌發(fā)病及侵襲、轉(zhuǎn)移。

綜上所述，胃癌患者血清及癌組織RLIP76、CD44表達(dá)水平均較高，兩者均與胃癌臨床分期、腫瘤分化程度及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，為影響胃癌術(shù)后生存的獨(dú)立危險因素。