郭葉青 王曉艷

(1.三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 宜昌 443003；2.中南大學(xué) 湘雅三醫(yī)院 消化內(nèi)科，湖南 長沙 410013)

結(jié)腸癌是臨床上最常見的消化道惡性腫瘤之一，早期結(jié)腸癌患者預(yù)后尚可，晚期患者治療效果與預(yù)后極差[1]。如何準(zhǔn)確地判斷結(jié)腸癌患者的預(yù)后，并及時采取相應(yīng)的治療是當(dāng)前研究的熱點。Rho即Ras類似物，主要有Rho(RhoA、RhoB、RhoC)、Rac(Rac1、Rac2、Rac3)和Cdc42三個亞家族，是一類小G蛋白，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要的作用[2]。RhoA為Rho蛋白中最常見的一種，其下游效應(yīng)分子包括Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated curl-forming protein kinases，ROCK1)、蛋白激酶A(protein kinase A，PAK)、蛋白激酶N(protein kinase N，PKN)、磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K)等，這些分子介導(dǎo)了RhoA的作用[3]。研究表明，RhoA和ROCK1蛋白在多種惡性腫瘤中的表達水平均升高，在促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中具有重要意義，對腫瘤患者的預(yù)后影響較大[4-6]。目前有關(guān)RhoA和ROCK1蛋白在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，鮮有報道。本文運用免疫組化方法，檢測結(jié)腸癌組織芯片中RhoA和ROCK1蛋白表達，分析其與結(jié)腸癌臨床病理特征間的關(guān)系，并進行生存分析，探討RhoA和ROCK1蛋白與結(jié)腸癌生物學(xué)行為的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織芯片

本研究所用的2張組織芯片購自上海芯超公司，芯片的編號是OD-CT-DgCo101-102。每張組織芯片上含75例結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織及癌旁的正常黏膜各1點，共150點，75例患者均在2012年1月～2013年1月行手術(shù)治療。所有患者均具備完整隨訪資料，以最后一次的隨訪日期或者患者死亡的日期為隨訪結(jié)束點，隨訪的時間以月算，隨訪截止日期為2018年10月。以手術(shù)的日期到隨訪結(jié)束的日期或患者死亡的日期為生存期，最短的隨訪時間是1個月，最長的隨訪日期是66個月。組織芯片上每塊組織直徑1.5 mm，厚4 μm，其中男性38例，女性37例；年齡分布為30～82歲，>60歲患者49例，<60歲患者26例；所有患者術(shù)前均未接受放化療，其中Dukes A期12例，Dukes B期23例，Dukes C期31例，DukesD期9例；高分化10例，中分化53例，低分化12例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例；標(biāo)本均通過HE染色驗證。

1.1.2 主要試劑

鼠抗人單克隆抗體RhoA購于美國Sigma公司，鼠抗人單克隆抗體ROCK1購于美國Santa Cruz公司，DAB顯色試劑盒、即用型免疫組化試劑盒購于福州邁新公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法

結(jié)腸癌組織芯片經(jīng)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、PBS液漂洗之后，以3%過氧化氫孵育；PBS液漂洗后滴加非免疫動物血清封閉，室溫孵育；PBS沖洗后滴加1∶200 RhoA和1∶10 ROCK1抗體，4℃過夜；PBS液漂洗后滴加二抗，室溫30 min；PBS液漂洗、DAB試劑顯色、蘇木精進行復(fù)染，再行脫水、透明、封片。用已知的陽性染色結(jié)腸癌組織切片作陽性對照，用PBS液替代一抗為陰性對照，顯微鏡下拍照。

1.2.2 免疫組化評判標(biāo)準(zhǔn)及觀察評分

根據(jù)目的蛋白表達陽性的細胞比例及染色強度評分。陽性細胞計數(shù)<5%，記0分；陽性細胞計數(shù)5%～25%，記1分；陽性細胞計數(shù)26%～50%，記2分；陽性細胞計數(shù)51%～75%，記3分；陽性細胞計數(shù)>75%，記4分。陰性染色，為0分；淡黃色染色，為1分；棕黃色染色，為2分；呈棕褐色染色，為3分。由兩位病理專家分別根據(jù)上述陽性細胞比例和染色進行評分，兩項相加后記為最終評分。結(jié)果的評判：0分為陰性表達(-)；1～2分為弱陽性表達(+)；3～5分為中等陽性表達(++)；6～7分為強陽性表達(+++)。

1.2.3 臨床病理特征和生存分析

分別分析RhoA蛋白和ROCK1蛋白的表達與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系，并進行生存分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組間率的比較通過卡方檢驗或者Fisher確切概率法，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，生存分析方法采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoA蛋白在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達及與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

由于脫片原因，本實驗分析了69例結(jié)腸癌組織及67例癌旁正常粘膜組織中RhoA蛋白的表達。結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織及癌旁正常粘膜組織中RhoA蛋白表達定位在胞漿、胞膜，陽性的染色呈棕黃色或者棕褐色(圖1A～1D)。RhoA蛋白在結(jié)腸癌組織的表達陽性率達68.12%，而癌旁正常黏膜組織是44.78%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。進一步分析RhoA蛋白的表達與結(jié)腸癌患者各項臨床病理特征間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RhoA蛋白的表達與結(jié)腸癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期明顯相關(guān)(均P<0.05)，而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度等無明顯相關(guān)(均P>0.05)，見表2。

表1 RhoA蛋白在結(jié)腸癌及癌旁正常粘膜組織中的表達

注：兩組陽性率比較，χ2=7.54,P<0.01

表2 RhoA蛋白表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2 RhoA蛋白表達對結(jié)腸癌患者術(shù)后生存時間的影響

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果示，RhoA陽性表達組的術(shù)后生存時間為41.78±4.26月，患者的5年生存率為42.70%；而RhoA陰性表達組的術(shù)后生存時間為54.59±2.78月，患者的5年生存率為59.61%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.76，P<0.05)，見圖2。

2.3 ROCK1蛋白在結(jié)腸癌和癌旁正常粘膜中的表達及與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

由于脫片原因，本實驗分析了69例結(jié)腸癌組織及64例癌旁正常粘膜組織中ROCK1蛋白的表達。結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織及癌旁正常粘膜組織中ROCK1蛋白表達定位在胞漿，陽性染色呈棕黃色或者棕褐色(圖3A～3D)。結(jié)腸癌組織ROCK1蛋白表達的陽性率達69.57%，而癌旁正常黏膜組織中ROCK1蛋白表達的陽性率是42.19%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表3。進一步分析ROCK1蛋白表達與結(jié)腸癌患者各項臨床病理特征間的關(guān)系，結(jié)果顯示ROCK1蛋白的表達與結(jié)腸癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期明顯相關(guān)(均P<0.05)；而與患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度等無明顯相關(guān)(均P>0.05)，見表4。

表3 ROCK1蛋白在結(jié)腸癌及癌旁正常粘膜組織中的表達

注：兩組陽性率比較，χ2=10.12，P<0.01

表4 ROCK1蛋白表達與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4 ROCK1蛋白表達對結(jié)腸癌患者術(shù)后生存時間的影響

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果示，ROCK1陽性表達組的術(shù)后生存時間為36.33±4.13月，患者的5年生存率為38.10%；而ROCK1陰性表達組的術(shù)后生存時間為50.13±3.71月，患者的5年生存率為59.60%。兩組間的生存率經(jīng)Log-rank檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.81，P<0.01)，見圖4。

2.5 結(jié)腸癌組織中RhoA蛋白與ROCK1蛋白表達的相關(guān)性分析

在47例RhoA蛋白表達陽性結(jié)腸癌組織中，40例ROCK1蛋白表達陽性；22例RhoA蛋白表達陰性組織中，14例ROCK1蛋白表達陰性。Spearman等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，RhoA蛋白與ROCK1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達呈正相關(guān)(r=0.60，P<0.05)，見表5。

表5 結(jié)腸癌組織中RhoA蛋白與ROCK1蛋白表達的關(guān)系

3 討論

Rho蛋白家族是一類小G蛋白，RhoA具備GTP酶的活性，并具有與GTP結(jié)合的活化態(tài)及與GDP結(jié)合的非活化態(tài)這兩種構(gòu)像，通過在這兩種活性狀態(tài)間的轉(zhuǎn)換，使RhoA蛋白扮演著類似“分子開關(guān)”的角色[7]。目前的研究已證實，RhoA下游的效應(yīng)分子包括ROCK1、PAK、PI3K、PKN等。ROCK1是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，ROCK1蛋白的一級結(jié)構(gòu)自氮末端依次具備激酶催化的結(jié)構(gòu)域、與Rho蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)區(qū)及碳末端的Pleckstrin同源區(qū)，ROCK1蛋白激活后能夠進一步磷酸化下游的靶分子[8]。已有大量研究證實，RhoA/ROCK1信號通路可調(diào)節(jié)細胞骨架相關(guān)蛋白從而促進腫瘤細胞的運動[9]；可調(diào)節(jié)細胞周期相關(guān)蛋白表達從而促進腫瘤增殖[10]；可增強基質(zhì)金屬蛋白酶活性而促進腫瘤轉(zhuǎn)移[11]；可使腫瘤細胞分泌更多血管生成因子從而促進腫瘤血管生成[12]。

已有較多的研究證明，RhoA、ROCK1的高表達能夠促進細胞增殖、抵抗凋亡、加速侵襲轉(zhuǎn)移，且其表達的改變與腫瘤的惡性程度、不良預(yù)后密切相關(guān)。Liu等[13]研究證實，過表達RhoA可促進肺癌細胞系SPCA1的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。Nishizawa等[14]研究發(fā)現(xiàn)，RhoA、ROCK1的過表達可導(dǎo)致胃癌細胞抵抗凋亡，并增強胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力。Ghasemi等[15]研究顯示，RhoA、ROCK1抑制劑可降低卵巢癌細胞的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力。周密等[16]研究證實，RhoA可通過肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer 1，DLC1)介導(dǎo)RhoA-ROCK1信號通路活化，促進乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Shokri等[17]研究表明，在乳腺癌中過表達RhoA可促進乳腺癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致不良預(yù)后。

目前有關(guān)RhoA蛋白及ROCK1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達及臨床意義的研究鮮有報道。本研究結(jié)果顯示，RhoA和ROCK1在癌組織中的蛋白表達陽性率明顯高于癌旁正常黏膜組織，證實了結(jié)腸癌中存在RhoA及ROCK1蛋白的高表達。RhoA及ROCK1蛋白表達與結(jié)腸癌患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期明顯相關(guān)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，RhoA與ROCK1在結(jié)腸癌組織中的蛋白表達呈正相關(guān)，說明RhoA及ROCK1可能在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，可能促進結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。生存分析結(jié)果示，RhoA及ROCK1蛋白陽性表達組的生存率明顯低于陰性表達組，說明RhoA及ROCK1的高表達可能預(yù)示結(jié)腸癌患者的不良預(yù)后。隨著對RhoA/ROCK1相關(guān)信號通路在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的研究深入，RhoA蛋白及ROCK1蛋白有可能作為一項新型的腫瘤標(biāo)志物，在結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后判斷方面具有一定的臨床指導(dǎo)意義。