謝廣發(fā)，樊世英，傅建偉，胡志明，陸 健，譚新勇，孫軍勇,*，傅祖康，王 蘭，毛青鐘，李國龍

（1.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 紹興 312028；2.紹興黃酒學(xué)院，浙江 紹興 312028；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；4.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；5.國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000；6.會(huì)稽山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興 312000；7.紹興鑒湖釀酒有限公司，浙江 紹興 312000）

黃酒混濁是黃酒在貯存過程中常見的問題之一，嚴(yán)重影響黃酒的外觀品質(zhì)和銷售。黃酒混濁分為生物混濁和非生物混濁[1]。生物混濁主要由微生物引起，可以通過黃酒的生產(chǎn)工藝優(yōu)化加以控制[2-3]。非生物混濁的形成過程比較復(fù)雜，主要是黃酒中蛋白質(zhì)、多肽、金屬離子、糊精、多酚等物質(zhì)，在溫度變化、光照、振動(dòng)、O2存在情況下會(huì)發(fā)生一系列變化，發(fā)生凝聚和絮凝使黃酒中膠體平衡遭到破壞，產(chǎn)生混濁現(xiàn)象[4-8]。從形成的機(jī)理來說，非生物混濁可以分為蛋白質(zhì)混濁、金屬離子混濁、氧化混濁、醬色混濁和糊精混濁[9-12]。

在瓶裝黃酒混濁沉淀物中蛋白質(zhì)的比例高達(dá)50.56%，而黃酒酒體中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為1%～2%，這說明在貯存的過程中，黃酒中的蛋白質(zhì)容易形成混濁[13-17]。Poklar[18]認(rèn)為蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)通過氫鍵或疏水鍵的作用形成締合物，可形成蛋白質(zhì)混濁，而形成混濁的程度與兩者的濃度有關(guān)。除此之外，外界溫度的變化也能引起黃酒中蛋白質(zhì)的變化而引起混濁[10]。在前期研究中[15-16]，本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在混濁蛋白中高分子蛋白質(zhì)比例可高達(dá)70%，且蛋白質(zhì)混濁的形成可能與某些特定的容易產(chǎn)生混濁的蛋白質(zhì)有關(guān)[19-21]。

黃酒的釀造原料主要為稻米（糯米、粳米、秈米）、黍米等，經(jīng)浸泡、蒸煮、加酒曲、糖化、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒（除菌）、貯存、勾兌而成[22]。從原料及工藝可分析出，其酒體中的蛋白質(zhì)來源主要為稻米和麥曲，因此通過分析發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的變化可為后續(xù)分析黃酒混濁中蛋白質(zhì)的來源提供一定理論基礎(chǔ)。

本研究通過雙向電泳以及基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）對(duì)黃酒沉淀中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離與鑒定，確定黃酒混濁沉淀中蛋白質(zhì)的種類。并采用N-三(羥甲基)甘氨酸-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine SDS-PAGE）分析不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液中蛋白質(zhì)分布情況，以期從發(fā)酵過程解釋黃酒混濁蛋白的來源情況，為解決黃酒蛋白質(zhì)混濁提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓶裝黃酒購于江蘇無錫當(dāng)?shù)爻?，產(chǎn)地均為浙江紹興。發(fā)酵過程中不同階段的黃酒發(fā)酵液均取樣于浙江古越龍山紹興酒股份有限公司。

3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、碘乙酰胺、二硫蘇糖醇、尿素、固相IPG膠條（7 cm，pI 3～10，非線性）、IPG緩沖液（pH 3～10，非線性）美國GE公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸、碳酸氫銨、三氟乙酸、胰蛋白酶、乙腈 美國Sigma公司；30%丙烯酰胺單體儲(chǔ)液、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、SDS、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、N-三(羥甲基)甘氨酸 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5415D高速離心機(jī) 德國Eppendorf股份公司；Mini-Protein 3 Cell蛋白電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Ultraflextreme串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 德國Bruker公司；UV-2100紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼克（上海）儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酒混濁蛋白的制備

按照文獻(xiàn)[23]方法進(jìn)行樣品制備，提取粗蛋白質(zhì)，TCA-丙酮法去除雜質(zhì)，得到混濁蛋白質(zhì)樣品。

1.3.2 黃酒釀造過程發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的收集

取發(fā)酵過程中不同階段的黃酒發(fā)酵液50 mL，濾紙過濾，濾液4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液與等體積的預(yù)冷20% TCA溶液混合，振蕩混勻后在冰浴條件下放置2 h沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，在沉淀中加入-20 ℃預(yù)冷的丙酮，振蕩混勻，-20 ℃放置1 h，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，如此重復(fù)洗滌3 次。收集沉淀，放于-20 ℃冰箱中至丙酮完全揮發(fā)。

1.3.3 釀造原料中蛋白質(zhì)樣品的制備

1.3.3.1 黃酒釀造原料浸提液的獲得

分別稱取5 g生麥曲、熟麥曲、蒸熟的大米于燒杯中，加入pH 4.2的0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液20 mL和一片Complete蛋白酶抑制劑混合物，攪拌混勻，置于4 ℃冰箱中浸提過夜，然后用濾紙過濾，將濾液轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清液即為黃酒原料中麥曲、大米的浸提液。

1.3.3.2 原料中蛋白質(zhì)樣品的制備

取一定量的原料浸提液于離心管內(nèi)，加入同等體積的預(yù)冷20% TCA溶液，振蕩混勻后在冰浴條件下放置2 h沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，在沉淀中加入-20 ℃預(yù)冷的丙酮，振蕩混勻，-20 ℃放置1 h，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，重復(fù)洗滌3 次。收集沉淀，置于-20 ℃冰箱中至丙酮完全揮發(fā)。

1.3.4 雙向電泳

將去除雜質(zhì)后的混濁蛋白用樣品水化液進(jìn)行溶解，考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測(cè)定蛋白濃度。參照GE公司的《雙向電泳操作手冊(cè)》水化上樣，水化12 h左右，進(jìn)行第一向等電聚焦，按照參考文獻(xiàn)[24]設(shè)定等電聚焦程序，等電聚焦完成后，用平衡液對(duì)膠條進(jìn)行平衡，采用14%的變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行第二向SDS-PAGE，電泳結(jié)束后進(jìn)行染色、脫色直至背景清晰，拍照分析。

1.3.5 MALDI-TOF-MS

質(zhì)譜鑒定參考文獻(xiàn)[25]進(jìn)行。

1.3.6 蛋白質(zhì)的PAGE

參考文獻(xiàn)[25]進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)

采用軟件Image j對(duì)SDS-PAGE膠中的蛋白條帶進(jìn)行灰度分析及定量計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒混濁蛋白的雙向電泳分析

通過對(duì)不同樣品進(jìn)行離心去雜、TCA-丙酮沉淀獲得蛋白樣品，使用7 cm、pH 3～10、非線性的IPG膠條進(jìn)行雙向電泳實(shí)驗(yàn)，獲得的雙向電泳圖譜見圖1。結(jié)果表明，不同瓶裝黃酒中混濁蛋白的分布基本相近，主要分為酸性蛋白區(qū)和低分子堿性蛋白區(qū)。

圖 1 不同酒樣混濁蛋白的雙向電泳圖譜Fig. 1 2-DE profiles of haze-active proteins in different Chinese yellow rice wine samples

2.2 黃酒混濁蛋白的MALDI-TOF-MS分析

通過表1質(zhì)譜鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿性端的蛋白主要為類燕麥蛋白和水稻的假定蛋白，酸性端的蛋白為二聚α-淀粉酶抑制劑。類燕麥蛋白是小麥的貯存蛋白，分為A亞型和B亞型2 種蛋白質(zhì)。A亞型蛋白質(zhì)含有168 個(gè)氨基酸，其中谷氨酸數(shù)量為36 個(gè)，占氨基酸總量的21%，B亞型蛋白質(zhì)含有284 個(gè)氨基酸，其中谷氨酸數(shù)量為80 個(gè)，占氨基酸總量的28%。類燕麥蛋白前體是形成燕麥蛋白的前體蛋白，含有181 個(gè)氨基酸，其中谷氨酸含量為44 個(gè)，占氨基酸總量的24%。這些蛋白中含大量谷氨酸，與氨基酸分析中谷氨酸含量偏高相符合[26]，說明黃酒混濁中谷氨酸含量偏高與小麥的類燕麥蛋白有關(guān)。類燕麥蛋白含有一定數(shù)目的半胱氨酸，存在分子內(nèi)和分子間的二硫鍵，可以形成高分子聚合體，對(duì)混濁形成有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)[27-29]類燕麥蛋白來源于小麥胚乳，屬于低分子質(zhì)量谷蛋白，對(duì)小麥的加工品質(zhì)有重要影響。

表 1 黃酒混濁蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 1 Identification of haze-active proteins of Chinese yellow rice wine by MALDI TOF-MS

對(duì)鑒定結(jié)果中不同來源的蛋白點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)，如表2所示。在33 個(gè)蛋白點(diǎn)中來源于小麥的有21 個(gè)蛋白點(diǎn)，水稻的有12 個(gè)蛋白點(diǎn)，小麥蛋白在混濁蛋白中占有較大比重。來源于小麥的混濁蛋白有5 種，分別為類燕麥蛋白A、類燕麥蛋白B、類燕麥蛋白前體、二聚α-淀粉酶抑制劑、胰蛋白酶前體，以二聚α-淀粉酶抑制劑、類燕麥蛋白前體為主，來源于水稻的混濁蛋白有3 種，分別為假定蛋白OSJ_04535、假定蛋白OSI_17439和蛋白H0313F03.18，以2 種假定蛋白為主。

表 2 黃酒混濁蛋白來源分析Table 2 Source analysis of haze-active proteins in Chinese yellow rice wine

二聚α-淀粉酶抑制劑是普遍存在于植物種子中的一種酶抑制劑，可以控制內(nèi)生性淀粉酶的活性，也可以防御病原菌和昆蟲的侵害[28,30-31]。研究發(fā)現(xiàn)[32-34]α-淀粉酶抑制劑在pH 4～11時(shí)性質(zhì)穩(wěn)定，在80 ℃作用30 min后活性僅降低10%左右，由于熱穩(wěn)定性強(qiáng)，在黃酒加熱殺菌過程中，α-淀粉酶抑制劑沒有失活變性，仍會(huì)殘留在酒液中，在貯存過程中因?yàn)橥饨绛h(huán)境的變化導(dǎo)致其逐漸析出形成混濁。

有5 種混濁蛋白來源于小麥，說明小麥對(duì)黃酒蛋白質(zhì)混濁有重要影響。小麥自身含有的α-淀粉酶抑制劑在發(fā)酵過程中會(huì)抑制淀粉酶活性，導(dǎo)致淀粉分解不徹底，部分糊精會(huì)殘留在酒液中，隨著環(huán)境變化糊精會(huì)析出，加重黃酒的非生物混濁，但對(duì)于其具體的作用過程還需要進(jìn)一步研究。假定蛋白是功能未知的蛋白，對(duì)于水稻中鑒定出的假定蛋白，對(duì)其功能以及在混濁形成過程中的作用還有待研究。

2.3 黃酒混濁蛋白質(zhì)Tricine-SDS-PAGE分析

圖 2 發(fā)酵原料及過程中黃酒蛋白質(zhì)Tricine-SDS-PAGEFig. 2 Tricine-SDS-PAGE profiles of proteins from Chinese yellow rice wine precipitants, raw materials and fermented mash

對(duì)混濁蛋白、發(fā)酵原料（生麥曲、熟麥曲、大米）及釀造過程中的發(fā)酵液進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖2。泳道1的混濁蛋白有兩條比較明顯的條帶，經(jīng)軟件計(jì)算分子質(zhì)量分別約為14.1 kDa和27.6 kDa，對(duì)2 個(gè)條帶所占混濁蛋白的百分含量進(jìn)行積分光密度計(jì)算，分別為75.4%和24.6%。從圖2可以看出，在麥曲和大米中存在與混濁蛋白分子質(zhì)量一致的27.6 kDa的蛋白質(zhì)，說明分子質(zhì)量在27.6 kDa左右的混濁蛋白質(zhì)主要來源于麥曲和大米，14.6 kDa的條帶存在于混濁蛋白和麥曲中，因此麥曲是分子質(zhì)量14.6 kDa左右混濁蛋白的主要來源，這與表1鑒定結(jié)果中各蛋白質(zhì)的來源一致。

在黃酒發(fā)酵的前2 d，原料中的大部分蛋白質(zhì)溶于發(fā)酵液中，主要包括5.6～14.4、23.5、27.6～35.0 kDa和55.4 kDa的蛋白質(zhì)，從第3天開始，發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)變化較為明顯，分子質(zhì)量8.0 kDa以下的小分子蛋白質(zhì)顯著減少，直至完全消失，8.0～14.4、23.5 kDa和35 kDa的蛋白質(zhì)也隨著發(fā)酵時(shí)間的推移逐漸減少，當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后完全消失。在第21天的發(fā)酵液中，僅存在5 個(gè)條帶，標(biāo)記為a～e，其中a、d、e 3 個(gè)條帶在發(fā)酵過程中被降解逐漸減少，而b和c兩個(gè)條帶的剛開始發(fā)酵時(shí)含量較低，但在發(fā)酵過程中并未減少，一直存留至發(fā)酵結(jié)束，這說明b和c這2 個(gè)條帶所含有的蛋白質(zhì)難以被降解，而條帶c也是組成混濁蛋白的主要蛋白質(zhì)。經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定，條帶a～e分別為β-淀粉酶、木聚糖酶抑制蛋白I、幾丁質(zhì)酶II、α-淀粉酶抑制劑、病程相關(guān)蛋白，除了木聚糖酶抑制蛋白I之外，其他幾種蛋白質(zhì)都在混濁蛋白中出現(xiàn)[25]，由此可見，原料帶入發(fā)酵過程的未完全降解的蛋白質(zhì)為蛋白質(zhì)混濁提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

黃酒混濁蛋白主要分布為酸性蛋白區(qū)和低分子堿性蛋白區(qū)，質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)黃酒的混濁蛋白主要來源于小麥和水稻，分子質(zhì)量在13～37 kDa之間，其中5 種來源于小麥，包括富含谷氨酸的類燕麥蛋白A、類燕麥蛋白B和類燕麥蛋白前體，還有二聚α-淀粉酶抑制劑和胰蛋白酶前體，來源于水稻的假定蛋白OSJ_04535、假定蛋白OSI_17439和蛋白H0313F03.18。這些蛋白共同構(gòu)成了黃酒的混濁蛋白。

Tricine-SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)混濁蛋白的分子質(zhì)量約為14.1 kDa和27.6 kDa，占比分別為75.4%和24.6%。在黃酒釀造過程中，原料中的蛋白質(zhì)種類隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少，黃酒中蛋白質(zhì)的條帶越來越少，但與混濁蛋白質(zhì)分子質(zhì)量一致的條帶始終存在，這說明黃酒混濁蛋白質(zhì)主要來源于黃酒釀造原料麥曲和大米，這與質(zhì)譜鑒定的結(jié)果一致，并且在黃酒的釀造過程中一直存留于發(fā)酵液中。因此，對(duì)黃酒原料或工藝進(jìn)行優(yōu)化，減少發(fā)酵過程中混濁蛋白的含量，可以有效地控制黃酒的蛋白質(zhì)混濁。