董 杰，劉 鷺，甲承立，朱俊玲,，呂加平,

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030800；2.北京市營養(yǎng)源研究所系統(tǒng)營養(yǎng)工程技術(shù)研究中心，北京 100069；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

糖尿病是一種由多種原因引起的代謝紊亂性疾病，主要是由于體內(nèi)的胰島素分泌不足或胰島素抵抗導(dǎo)致血糖過高或過低，其顯著特點(diǎn)是長(zhǎng)期高血糖[1]。長(zhǎng)期高血糖容易造成大血管、微血管的損害，進(jìn)而使腦、腎、心、眼、神經(jīng)等多個(gè)器官受損，最終可能導(dǎo)致患者失明，引起尿毒癥、腦中風(fēng)、心肌梗塞等并發(fā)癥，甚至危及生命[2]。2017年底，國際糖尿病聯(lián)盟公布了第八版全球糖尿病地圖，結(jié)果顯示，全球糖尿病患者從2000年的1.51億到2017年的4.25億，增加了近2 倍，平均每11 個(gè)人中就有1 位患病者。其中，中國患病人數(shù)達(dá)1.14億，是全球糖尿病患病人數(shù)最多的國家[3]。

現(xiàn)已有幾類降糖藥可用于治療糖尿病，包括磺酰脲類、甲格列奈類、噻唑烷二酮類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑等。但它們具有共同的副作用，即體重增加和低血糖，這使得長(zhǎng)期治療無法控制最佳血糖[4]。因此，為改善治療效果，降低副作用，出現(xiàn)了治療II型糖尿病的新方法。其中，二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制劑是目前比較新穎且有前途的抗糖尿病藥物。

DPP-4又稱T細(xì)胞表面抗原CD26，是廣泛存在于細(xì)胞膜上的一類具有潛在的調(diào)節(jié)免疫、內(nèi)分泌以及神經(jīng)系統(tǒng)等功能的膜結(jié)合絲氨酸蛋白酶，其存在于多種器官中且家族成員眾多[5]，在腸道中高表達(dá)，于肝臟、胰腺、胎盤、胸腺等處也有表達(dá)，部分以可溶形式存在于循環(huán)血液中[6]。凡是N端第2位存在脯氨酸（Pro）或丙氨酸（Ala）的多肽均是該類酶的底物，其可以從肽鏈的N端將這兩個(gè)氨基酸殘基水解使該活性多肽失活[7]。如胃腸道激素、神經(jīng)肽、細(xì)胞因子等都是DPP的底物，但在人體中DPP-4的底物只有葡萄糖依賴性促胰島素釋放多肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）和胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）[8-9]。生成GLP-1的腸道L細(xì)胞主要位于回腸下段，所有存貯在L細(xì)胞微粒中的GLP-1都是有活性的，但DPP-4使GLP-1快速失活且不可逆，因而GLP-1在體內(nèi)的半衰期極短，其中大約75%的GLP-1離開腸道前已經(jīng)被降解為無活性的代謝產(chǎn)物，此后40%～50%的門靜脈血GLP-1在肝臟中降解，因此，僅10%～15%有活性的GLP-1能到達(dá)體循環(huán)[10-11]。DPP-4抑制劑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合GLP-1和GIP中與DPP-4作用部分，從而延緩GLP-1和GIP在體內(nèi)的降解，增強(qiáng)其促胰島素分泌和葡萄糖調(diào)節(jié)活性。此外，在某些情況下，抑制DPP-4同時(shí)可以降低糖尿病患者的心血管危險(xiǎn)因素，降低血壓，改善餐后高血糖，減少炎癥標(biāo)志物、氧化應(yīng)激、血小板聚集以及改善內(nèi)皮功能等[12]。目前市場(chǎng)上DPP-4抑制劑類藥物多為列汀類，但是據(jù)一些藥物上市后的檢測(cè)結(jié)果顯示，西格列汀可引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)以及出血性或壞死性急性胰腺炎；維格列汀有肝毒性報(bào)道。因此，列汀類DPP-4抑制劑的長(zhǎng)期安全性仍然需要更多的臨床研究來評(píng)價(jià)[13]。尋找天然來源的DPP-4抑制劑被提上日程。

乳酸菌作為定居腸道中的有益菌群具有多種生理功能，如緩解乳糖不耐受癥、改善便秘和腹瀉、維持腸道微生態(tài)平衡和腸管機(jī)能、增強(qiáng)免疫功能和抗腫瘤、影響心血管疾病的發(fā)展、緩解過敏反應(yīng)等[14-15]。近年來，一些研究報(bào)道乳酸菌還具有抑制DPP-4和α-葡萄糖苷酶的作用，因而已經(jīng)成為控制糖尿病、緩解高血糖和增加胰島素敏感性的潛在新型和天然治療藥物。本研究的目的是篩選出1 株對(duì)DPP-4有良好抑制作用的乳酸菌，并用多種方法對(duì)乳酸菌的代謝物進(jìn)行分離純化，最終鑒定出乳酸菌代謝物中抑制DPP-4的主要物質(zhì)，為以后實(shí)施代謝調(diào)控提供理論基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用菌株均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所乳品實(shí)驗(yàn)室保藏。

重組人源DPP-4（D4943）、N-甘氨酰脯氨酰-對(duì)硝基苯胺鹽酸鹽（N-glycyl-prolyl-p-nitroanilide hydrochloride，Gly-Pro-pNA，0513-100MG） 美國Sigma公司；抑二肽素A 英國Abcam公司；西格列汀杭州默沙東制藥有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 北京廣達(dá)恒益科技有限公司；甲醛、丙酮、石油醚、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Spark 20M全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；3K15離心機(jī) 美國Sigma公司；MB-102高通量組織恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；DL-CJ-1N超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；蛋白分離純化系統(tǒng) 美國GE公司；半制備液相色譜儀 美國安捷倫公司；超高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)美國AB SCIEX 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將實(shí)驗(yàn)室保藏的植物乳桿菌BLP12和1.6970分別接入無菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)16 h，活化3 代后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將活化好的菌株以4%（V/V）接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，收集菌液，根據(jù)GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行菌株菌落總數(shù)的測(cè)定，將菌液濃度調(diào)節(jié)為1×109CFU/mL。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1 無細(xì)胞發(fā)酵上清液（cell-free excretory supernatant，CFS）的制備[16]

將保藏的益生菌菌種活化3 代后，按4%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，以4 ℃、10 000 r/min離心15 min，倒掉培養(yǎng)基收集菌體。將收集到的菌體用無菌0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 6.8）洗滌3 次，再重懸于PBS中，調(diào)節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL，渦旋混勻。接著于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16 h，以同樣的條件離心15 min，收集上清液，用0.22 μm水系微濾膜過濾得到CFS，-80 ℃保存以備使用。

1.3.2.2 無細(xì)胞胞內(nèi)提取物（cell-free intracellular extract，CFE）的制備[17]

將所用的益生菌菌種活化3 代后，按4%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，以4 ℃、10 000 r/min離心15 min，倒掉培養(yǎng)基收集菌體。將收集到的菌體用無菌0.1 mol/L PBS（pH 6.8）洗滌3 次，再重懸于PBS中，調(diào)節(jié)菌液濃度至1×109CFU/mL，渦旋混勻，用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞。超聲破碎的條件為：在冰浴的條件下，功率200 W，以3～5 s（工作3 s，停5 s）的脈沖破碎12 min。將超聲后得到的液體于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，收集上清液，以0.22 μm水系微濾膜過濾得到CFE，-80 ℃保存以備使用。

1.3.2.3 豬小腸中DPP-4的制備[18]

將新鮮豬小腸的內(nèi)容物雜質(zhì)清理干凈，用冷藏過的pH 6.8的PBS沖洗。在冰浴環(huán)境下切開，用干凈的載玻片分別刮取十二指腸、空腸、回腸黏膜及其表面黏液。將刮取下的黏膜及黏液加入等體積的pH 6.8 PBS，低溫下勻漿，然后將混合物在 4 ℃、12 000 r/min離心20 min收集上清液，凍存于-20 ℃以備用。 將豬小腸黏膜液的上清液用pH 6.8 PBS稀釋90 倍，作為DPP-4使用。

1.3.3 DPP-4抑制率的測(cè)定

底物Gly-Pro-pNA在DPP-4的作用下發(fā)生降解，生成的對(duì)硝基苯胺在405 nm波長(zhǎng)下具有強(qiáng)烈光吸收，因此可依據(jù)單位時(shí)間內(nèi)吸光度的改變程度表示酶促反應(yīng)速率[19]。

取96 孔板，用微量移液器在反應(yīng)孔中加入25 μL 1.6 mmol/L的底物Gly，接著加入25 μL待測(cè)樣品（對(duì)照加入0.1 mol/L PBS（pH 8），37 ℃反應(yīng)10 min，加入DPP-4（豬小腸）50 μL，金屬浴37 ℃反應(yīng)1 h，加入100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)樣品的吸光度，每組3 個(gè)平行。抑制率的計(jì)算公式如下[20]：

式中：A為Gly＋樣品＋酶＋Na2CO3；B為Gly＋樣品＋PBS＋Na2CO3；C為Gly＋PBS＋酶＋Na2CO3；D為Gly＋PBS＋PBS＋Na2CO3。

1.3.4 樣品的分離純化

1.3.4.1 超濾

取適量樣品加入到50 mL的超濾管中，依次用10、5、3 kDa的超濾管進(jìn)行逐步分離，按不同的分子質(zhì)量范圍對(duì)樣品進(jìn)行收集：＜3 kDa，3～5 kDa，5～10 kDa，＞10 kDa。測(cè)定各個(gè)部分的DPP-4抑制活性。選擇活性強(qiáng)的一部分進(jìn)行下一步分離純化。

1.3.4.2 有機(jī)溶劑提取

取100 mL發(fā)酵上清液置于分液漏斗，分別用甲醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。萃取體積按照1∶1進(jìn)行，萃取后分別收集水相部分和有機(jī)相部分，對(duì)收集到的樣品用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至干，接著用5 mL超純水反復(fù)洗脫壁上的殘留物質(zhì)，將收集到的洗脫液進(jìn)行活性測(cè)定[21]。

1.3.4.3 凝膠色譜柱分離

選擇抑制活性強(qiáng)的部分進(jìn)一步用AKTA蛋白分離純化系統(tǒng)按不同分子質(zhì)量對(duì)樣品進(jìn)行分離，流動(dòng)相使用0.5 mmol/L的PBS，收集出峰，并對(duì)每個(gè)收集到的峰進(jìn)行活性檢測(cè)。使用Superdex peptide柱進(jìn)行分離，分離分子質(zhì)量范圍0.1～7 kDa，進(jìn)樣量1 mL，流速2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

1.3.4.4 半制備高效液相色譜進(jìn)一步純化

選出活性較高的部分，用半制備高效液相色譜進(jìn)一步分離純化活性物質(zhì)，檢測(cè)使用Innoval C18柱（21.2 mm×250 mm），進(jìn)樣量1.5 mL，流速5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，流動(dòng)相A為超純水溶液，流動(dòng)相B為乙腈溶液，梯度條件如表1所示。收集每一個(gè)出峰部分，對(duì)收集到的峰物質(zhì)進(jìn)行活性檢測(cè)。

表 1 半制備高效液相色譜流動(dòng)相洗脫梯度Table 1 Mobile phase gradient elution program of semi-preparative high performance liquid chromatography

1.3.5 超高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜分析

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；載氣（He）流速：0.40 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫45 ℃；流動(dòng)相A為水（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（含0.1%甲酸）。

1.3.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正負(fù)離子掃描模式，進(jìn)樣電壓和碰撞電壓分別為10 000、40 V和6 eV。離子源溫度和去溶劑溫度分別為120 ℃和500 ℃，載氣流量900 L/h，質(zhì)譜掃描范圍m/z50～1 000，掃描時(shí)間和間隔時(shí)間分別為：0.1 s和0.02 s。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)預(yù)處理在進(jìn)行模式識(shí)別之前，原始數(shù)據(jù)經(jīng)代謝組學(xué)處理軟件QI（Waters，Milford，USA）進(jìn)行基線過濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化，最終得到一個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣，并與Metlin、HMDB、本地庫等譜庫進(jìn)行對(duì)比，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性。

所有數(shù)據(jù)用 ±s的形式表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Excel進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CFS和CFE對(duì)DPP-4的抑制力

表 2 益生菌對(duì)DPP-4的抑制率Table 2 DPP-4 inhibitory rates of probiotics

由表2可以看出，陽性對(duì)照組對(duì)DPP-4的抑制率最高，為32.33%；除菌株1.6970外，其余菌株的CFE均對(duì)DPP-4有較弱的抑制作用，抑制活性最強(qiáng)的為菌株1.1881，但抑制活性僅為9.5%左右。6 株菌株的CFS對(duì)DPP-4均具有抑制活性，而且除菌株1.6970外其余菌株的CFS抑制率都比其CFE的抑制率高；其中植物乳桿菌BLP12的抑制率最高，抑制率為27%左右，其次是ST-2；對(duì)于菌株1.6970不論是CFS還是CFE其抑制率都是最低的，所以選擇其作為抑制活性最高菌株BLP12的對(duì)照菌株。Panwar等[12]從嬰兒糞便中分離出15 株乳酸菌，并對(duì)比了乳酸菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌對(duì)DPP-4的抑制率，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)從嬰兒糞便中分離的乳酸菌對(duì)DPP-4的抑制力最高，抑制率達(dá)25%，而對(duì)照菌株對(duì)DPP-4的抑制率均很弱，有些甚至有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)所選菌株的CFS中具有良好的DPP-4抑制能力；而CFE中不含或含有極少的該類抑制物，所以選取BLP12的CFS做下一步的研究。

2.2 不同萃取溶劑CFS萃取物對(duì)DPP-4抑制活性的影響

圖 1 不同有機(jī)溶劑CFS萃取物對(duì)DPP-4的抑制率Fig. 1 DPP-4 inhibition rates of extracts obtained with different organic solvents

經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后，甲醇和丙酮與水互溶形成的萃取液不分層，石油醚和乙酸乙酯與水不溶或部分溶解，所以形成的萃取液分為上下兩層，上層為有機(jī)相部分，下層為水相部分。從圖1可以看出，對(duì)于植物乳桿菌1.6970，本實(shí)驗(yàn)所選用的有機(jī)溶劑的萃取液對(duì)DPP-4均有抑制活性，其中甲醇、丙酮、乙酸乙酯萃取液水相部分對(duì)DPP-4的抑制活性較高，而且均高于原液；石油醚萃取液水相部分和有機(jī)相部分、乙酸乙酯萃取液有機(jī)相部分的抑制活性低于原液，石油醚萃取液水相部分對(duì)DPP-4的抑制活性最弱，抑制率僅有3%左右；對(duì)于植物乳桿菌BLP12，除石油醚外其他有機(jī)溶劑的萃取液對(duì)DPP-4均有抑制作用，其中乙酸乙酯萃取液水相部分對(duì)DPP-4的抑制活性最高，顯著高于原液，抑制率高達(dá)50%左右；其次是丙酮萃取液，抑制率為27%左右；甲醇、乙酸乙酯萃取液有機(jī)相部分的抑制活性均低于原液；石油醚萃取液對(duì)DPP-4沒有抑制作用，反而有促進(jìn)作用。

通過圖1可以看出，植物乳桿菌BLP12的乙酸乙酯萃取液水相部分對(duì)DPP-4的抑制活性最高，所以最終選擇乙酸乙酯作為萃取劑。

2.3 CFS萃取液的分級(jí)分離及其分離組分的DPP-4抑制活性

圖 2 CFS萃取液不同分子質(zhì)量組分對(duì)DPP-4的抑制率Fig. 2 DPP-4 Inhibition rates of fractions with different molecular masses

如圖2所示，樣品經(jīng)過不同分子質(zhì)量的分級(jí)后，所得部分的抑制率均有所下降。植物乳桿菌1.6970不同分子質(zhì)量大小的CFS對(duì)DPP-4均具有抑制活性，其中分子質(zhì)量小于5 kDa的樣品抑制活性最強(qiáng)，分子質(zhì)量大于10 kDa和5～10 kDa的樣品的抑制活性較弱，因此推測(cè)具有DPP-4抑制作用的物質(zhì)分子質(zhì)量小于5 kDa。植物乳桿菌BLP12不同分子質(zhì)量大小的CFS對(duì)DPP-4均具有抑制活性，而且均比1.6970的抑制活性高；分子質(zhì)量小于5 kDa的CFS的抑制活性遠(yuǎn)大于分子質(zhì)量5～10 kDa，因此，推測(cè)植物乳桿菌BLP12的CFS中抑制DPP-4的活性物質(zhì)主要為小于5 kDa的物質(zhì)。這與Huang等[22]研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)在豬皮明膠的水解產(chǎn)物中分子質(zhì)量在1～1.25 kDa之間的物質(zhì)對(duì)DPP-4的抑制率最高，達(dá)35%。分析降糖物質(zhì)可能大多數(shù)為小分子物質(zhì)。

圖 3 植物乳桿菌1.6970（a）和BLP12（b）凝膠色譜柱分離圖Fig. 3 Chromatographic separation profiles of metabolites of Lactobacillus plantarum 1.6970 (a) and BLP12 (b) on Superdex peptide column

將超濾后分子質(zhì)量小于5 kDa的溶液進(jìn)行收集，并利用Superdex peptide層析柱對(duì)樣品進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。從圖3可以看出，植物乳桿菌1.6970分出9 個(gè)組分，BLP12分出10 個(gè)組分，對(duì)每個(gè)組分進(jìn)行收集，并標(biāo)記1.6970的9 個(gè)組分為A-1～A-9，BLP12的10 個(gè)組分為B-1～B-10。測(cè)定各個(gè)組分的DPP-4抑制活性。

圖 4 柱層析各個(gè)組分對(duì)DPP-4的抑制率Fig. 4 DPP-4 inhibition rates of fractions separated by column chromatography

如圖4所示，植物乳桿菌1.6970的所有組分對(duì)DPP-4均具有抑制活性，但抑制活性都較弱，其中抑制活性較高的有A-4，經(jīng)過2 次柱子的稀釋后仍具有14%抑制率。對(duì)于BLP12菌株，收集到的10 個(gè)組分均具有抑制活性，且每個(gè)組分的抑制活性都較高，其中組分B-5的抑制活性最高，抑制率高達(dá)46%，比原液的抑制率高19%；其次是組分B-9，抑制率為37%。所以最終選擇植物乳桿菌BLP12的組分B-5和組分B-9進(jìn)行下一步的分離純化。

圖 5 B-9（a）和B-5（b）半制備液相色譜分離圖Fig. 5 Semi-preparative liquid chromatograms of B-9 (a) and B-5 (b)

將樣品B-5和B-9用半制備高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步分分離純化，如圖5所示，B-5分離出4 個(gè)組分，分別記為B-5-1、B-5-2、B-5-3、B-5-4；B-9分離出2 個(gè)組分，分別記為B-9-1和B-9-2。對(duì)分離得到各個(gè)組分進(jìn)行收集并測(cè)定對(duì)DPP-4的抑制率，以便選擇最終進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的樣品。

圖 6 半制備液相各組分對(duì)DPP-4的抑制率Fig. 6 DPP-4 inhibition rate of subfractions separated from B-9 and B-5

從圖6可以看出，組分B-9-1的抑制活性很低，組分B-9-2沒有抑制活性；B-5經(jīng)分離得到的4 個(gè)組分除B-5-4外，其余組分都有較弱的抑制活性，B-5-3的抑制活性最高，抑制率為8%左右。盡管組分B-5-3的抑制活性最高，但是由于樣品經(jīng)過多次分離純化，已經(jīng)被稀釋很多倍，樣品中可以抑制DPP-4的活性物質(zhì)含量已十分稀少，所以在進(jìn)行下一步的質(zhì)譜鑒定前，將樣品用冷凍濃縮機(jī)進(jìn)行濃縮。

2.4 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

表 3 質(zhì)譜鑒定的物質(zhì)Table 3 Metabolites of strain BLP12 identified by LC-MS-MS

植物乳桿菌BLP12的細(xì)胞代謝物經(jīng)分離純化后用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定代謝物中的物質(zhì)種類，共鑒定出61 種物質(zhì)，表3為鑒定出的物質(zhì)名稱以及相對(duì)分子質(zhì)量。

3 討論與結(jié)論

本研究測(cè)定6 株益生菌的細(xì)胞代謝物和細(xì)胞內(nèi)容物的DPP-4抑制作用，結(jié)果顯示植物乳桿菌BLP12的細(xì)胞代謝物對(duì)DPP-4的抑制效果最為顯著，將BLP12的代謝物進(jìn)行分離純化并用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)樣品中物質(zhì)種類，最終得到61 種物質(zhì)，經(jīng)查證其中11 種物質(zhì)與治療糖尿病相關(guān)，其中有4 種DPP-4抑制劑，其余7 種與治療糖尿病相關(guān)物質(zhì)。這11 種物質(zhì)分別是十二烷基硫酸鹽、煙酸、環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)、亮氨酸脯氨酸、十二烷二酸、吡啶羧酸、十八碳三烯酸、別嘌呤醇、鳥嘌呤、鄰苯三酚、曲酸。

早在2006年，Ellison等[23]發(fā)現(xiàn)(2R)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氫[l,2,4]三唑[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-l-(2,4,5-三氟苯基)丁胺的十二烷基硫酸鹽是DPP-4的有效抑制劑，可用于治療II型糖尿??；Miyamoto等[24]在煙酸的衍生物中發(fā)現(xiàn)了DPP-4抑制劑；Garg等[25]在1990年就發(fā)現(xiàn)煙酸可以治療二型糖尿病的血脂異常；同時(shí)煙酸類藥物還可以通過升高高密度脂蛋白、降低血漿甘油三酯和低密度脂蛋白等作用來調(diào)節(jié)糖尿病人的血脂異常情況[26]；有研究表明，具有xaa-pro序列（xaa代表氨基酸）的二肽可以作為DPP-4抑制劑；所以環(huán)(苯丙氨酸-脯氨酸)和亮氨酸脯氨酸是可能的DPP-4抑制劑。

十二烷二酸可以降低機(jī)體對(duì)葡萄糖攝取和氧化，改善糖尿病患者的代謝不靈活。Mingrone等[27]發(fā)現(xiàn)十二烷二酸可以通過底物競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制降低胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取和氧化，從而節(jié)省葡萄糖利用和增加糖原貯存；同時(shí)Salinari等[28]發(fā)現(xiàn)十二烷二酸在促進(jìn)脂肪氧化的同時(shí)不刺激胰島素分泌，這意味著對(duì)于II型糖尿病患者，可以減少胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取和氧化，從而節(jié)省葡萄糖的利用和增加糖原的貯存。吡啶羧酸與麥芽酚、L-蘇氨酸的復(fù)合物具有降血糖的作用。Kojima[29]每日向小鼠腹腔注射麥芽酚、L-蘇氨酸和吡啶酸鋅（II）復(fù)合物，14 d后測(cè)定其口服葡萄糖耐量和HbA1c水平，發(fā)現(xiàn)糖尿病情況有所改善。十八碳三烯酸可以激活脂肪細(xì)胞過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）γ[30]。已知過氧化物酶體增殖劑激活受體活化劑具有有效的抗高血糖活性，用于治療糖尿病相關(guān)的胰島素抵抗。因此，許多天然和合成的PPARγ激動(dòng)劑被用于治療葡萄糖疾病。別嘌呤醇具有降低II型糖尿病患者蛋白尿的作用，Momeni等[31]通過向?qū)嶒?yàn)者給予別嘌呤醇（100 mg/d），發(fā)現(xiàn)在接受藥物治療4 個(gè)月后，受試者的血清尿酸水平尿蛋白水平顯著降低，因此，別嘌呤醇可作為糖尿病腎病患者經(jīng)濟(jì)有效的輔助治療。鄰苯三酚可以抑制α-葡萄糖苷酶，Zheng Li等[32]通過動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鄰苯三酚可以競(jìng)爭(zhēng)性的與α-葡萄糖苷酶的活性位點(diǎn)相連接來抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

從植物乳桿菌BLP12的代謝物中分離出的這些物質(zhì)充分說明，植物乳桿菌不僅具有抑制DPP-4的作用，還可以通過其他多種方式改善糖尿病的癥狀。