王 慧，陳 雄，林衛(wèi)潮，李曜靈，代 俊

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068）

在自然環(huán)境或工業(yè)環(huán)境中，微生物經(jīng)常會(huì)面臨各種脅迫，包括外界環(huán)境中的脅迫因素和微生物自身代謝過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物對(duì)細(xì)胞的脅迫作用[1]。自然界中廣泛存在Na＋，高鹽脅迫無(wú)論在食品還是在自然環(huán)境中都廣泛存在[2]。

酵母耐鹽性即酵母對(duì)高Na＋濃度溶液的適應(yīng)能力，是某些工業(yè)酵母所必需的特性之一[3]。溶液中的高濃度Na＋會(huì)降低水分活度，限制酵母在自然和工業(yè)環(huán)境中的生長(zhǎng)，并影響酵母的代謝水平。在高鹽環(huán)境中，維持胞內(nèi)相對(duì)低的Na＋濃度與細(xì)胞膜的流動(dòng)性息息相關(guān)[4]。質(zhì)膜中固醇的比例、組成和結(jié)構(gòu)是影響脂質(zhì)膜和脂筏流動(dòng)性的主要因素，固醇類型和含量的調(diào)控具有關(guān)鍵的生理調(diào)節(jié)作用[5]，這對(duì)許多細(xì)胞活動(dòng)（包括細(xì)胞分選、細(xì)胞骨架組織和交配）都很重要[6-7]。

研究表明，麥角固醇是酵母膜脂中的重要組分，主要合成途徑如圖1所示，而C-5固醇去飽和酶ERG3為合成過(guò)程中最關(guān)鍵的酶之一，對(duì)麥角固醇形成至關(guān)重要[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建敲除ERG3的菌株研究酵母固醇變化對(duì)其耐鹽性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

野生釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiaeBY4741（MATahis3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0），保藏于本實(shí)驗(yàn)室；工程菌株Bs-1采用Cre-loxP系統(tǒng)[9-10]通過(guò)同源重組方法敲除ERG3基因構(gòu)建[11]；過(guò)表達(dá)菌株Bs-2通過(guò)質(zhì)粒pYES2游離表達(dá)BY4741的ERG3基因構(gòu)建[12]；Escherichia coliDH5α用于構(gòu)建游離表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒pUG6、pSH47、pYES2均用于本研究菌株構(gòu)建。

氨芐青霉素、卡那霉素、遺傳霉素G418 廣州賽國(guó)生物科技有限公司；PC11-2×Pfu聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix 北京艾德萊生物科技有限公司；HindIII 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；D-半乳糖 上海麥克林生化科技有限公司；5-氟乳清酸 BBI生命科學(xué)有限公司；膽固醇（色譜級(jí)） 上海源葉生物科技有限公司；酵母DNA提取試劑盒 廣州捷倍斯生物科技有限公司；質(zhì)粒DNA小量試劑盒、PCR清潔試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；一步法快速克隆試劑盒上海翊圣生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

酵母菌株耐鹽性驗(yàn)證采用酵母浸出粉胨半乳糖（yeast extract peptone galactose，YPG）誘導(dǎo)培養(yǎng)基（20 g/L半乳糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、相應(yīng)含量NaCl、20 g/L瓊脂）；酵母菌株活化采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物）；鹽脅迫采用60 g/L NaCl-YPD培養(yǎng)基（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、60 g/L NaCl）用于搖瓶發(fā)酵；大腸桿菌質(zhì)粒擴(kuò)增采用LB培養(yǎng)基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，NaOH調(diào)pH值至7.0），根據(jù)對(duì)應(yīng)質(zhì)粒加入相應(yīng)抗生素；酵母質(zhì)粒篩選采用尿嘧啶省卻培養(yǎng)基（20 g/L葡萄糖、6.7 g/L不含氨基酸的細(xì)菌用酵母氮堿、2 g/L省卻尿嘧啶混合物（微量的各種氨基酸混合物））；酵母質(zhì)粒pSH47丟失篩選采用5-氟-乳清酸篩選培養(yǎng)基（20 g/L葡萄糖、6.7 g/L不含氨基酸的細(xì)菌用酵母氮堿、2 g/L省卻尿嘧啶的混合物（微量的各種氨基酸混合物）、50 μg/mL尿嘧啶、1 g/L 5-FOA、20 g/L瓊脂）。

1.2 儀器與設(shè)備

圖 1 麥角固醇合成步驟Fig. 1 Synthetic pathway of ergosterol

WFJ2000型可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；7890B型氣相色譜 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；YXQ-LS-100S II型高壓蒸汽滅菌鍋上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；5810R型高速冷凍離心機(jī)、PCR儀德國(guó)Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；SBA-90型生物分析傳感儀 山東省科學(xué)院生物研究所；氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 敲除菌株Bs-1的構(gòu)建

ERG3敲除所用引物見表1，由上海生物工程有限公司合成，構(gòu)建ERG3基因敲除盒步驟如下：1）以S. cerevisiaeBY4741的DNA為模板，以ERG3-UF和ERG3-UR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增構(gòu)建上游同源臂，以ERG3-DF和ERG3-DR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增構(gòu)建下游同源臂；2）以質(zhì)粒pUG6的DNA為模板，以kanMX-f和kanMX-r為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物loxP-kanMX-loxP；3）以ERG3-UF和ERG3-DR為引物，以上述3 種PCR產(chǎn)物為模板，通過(guò)融合PCR構(gòu)建ERG3基因敲除盒[9-10]。

表 1 本實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Sequences of primers used in this experiment

利用LiAc轉(zhuǎn)化法[13-14]將獲得的ERG3基因敲除盒轉(zhuǎn)化到S. cerevisiaeBY4741感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含100 μg/mL G418的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)2～4 d。挑選單菌落轉(zhuǎn)移到含100 μg/mL G418的液體YPD中，30 ℃培養(yǎng)2 d進(jìn)行菌落PCR，擴(kuò)增結(jié)果送南京金唯智公司測(cè)序驗(yàn)證，獲得轉(zhuǎn)化成功的重組菌株（ERG3::kanMX）。

為防止kanMX篩選標(biāo)記表達(dá)對(duì)菌株的代謝產(chǎn)生影響，構(gòu)建菌株時(shí)將kanMX篩選標(biāo)記刪除。將本實(shí)驗(yàn)室保藏的pSH47質(zhì)粒[15]用LiAc轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到重組菌株（ERG3::kanMX）感受態(tài)細(xì)胞中，利用尿嘧啶省卻平板篩選陽(yáng)性克隆子。陽(yáng)性菌落利用YPG培養(yǎng)基誘導(dǎo)pSH47質(zhì)粒中的Cre酶表達(dá)，刪除kanMX抗性篩選標(biāo)記。再利用5-氟-乳清酸平板，篩選pSH47質(zhì)粒丟失重組菌株[16]。通過(guò)尿嘧啶省卻液體培養(yǎng)基驗(yàn)證pSH47質(zhì)粒丟失成功。

1.3.2 過(guò)表達(dá)菌株Bs-2的構(gòu)建

將本實(shí)驗(yàn)室保藏的pYES2質(zhì)粒[12]用HindIII酶切線性化；用表1中pYES2 UF和pYES2 UR為引物，以S. cerevisiaeBY4741的DNA為模板，采用PCR擴(kuò)增ERG3基因。用一步法快速克隆試劑盒將線性化的pYES2質(zhì)粒DNA和ERG3基因連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYES2-ERG3[17]。利用LiAc轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到S. cerevisiaeBY4741感受態(tài)細(xì)胞。同樣利用尿嘧啶省卻液體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化成功的過(guò)表達(dá)菌株。

1.3.3 菌株的耐鹽性驗(yàn)證

BY4741、Bs-1、Bs-2活化菌液按10%接種量接種到5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、200 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)至OD600nm均為3.0。再將每種菌株的菌液用無(wú)菌水稀釋成4 個(gè)梯度，即稀釋10、50、250、1 250 倍。將每種菌株的每個(gè)梯度菌液取0.8 μL點(diǎn)在YPG平板上，于28 ℃培養(yǎng)，每天觀察它們的生長(zhǎng)狀態(tài)并拍照。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3 次，并顯示代表性結(jié)果。

1.3.4 菌株生理特性的測(cè)定

BY4741和Bs-1接種于YPD、60 g/L NaCl-YPD培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min的恒溫培養(yǎng)。菌液樣品于5 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清液和菌體保存于-20 ℃，用于生理特性測(cè)定。

菌體烘干12 h計(jì)數(shù)菌體干質(zhì)量濃度，菌體干質(zhì)量濃度/（g/L）=菌體干質(zhì)量/菌液體積。OD600nm用可見光分光光度計(jì)檢測(cè)[2]。葡萄糖含量用二硝基水楊酸法測(cè)定[18]。乙醇含量用生物傳感儀測(cè)定[19]。乙酸用氣相色譜測(cè)定，檢測(cè)條件為：安捷倫7890B，火焰離子化檢測(cè)器；Agilent HP-5毛細(xì)管柱（30 m×320 μm，0.25 μm）；程序升溫條件：40 ℃保留時(shí)間5 min，后以20 ℃/min升到120 ℃，再以10 ℃/min升到220 ℃，220 ℃保留時(shí)間6 min；分流比10∶1，分流流量50 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器280 ℃，進(jìn)樣體積1 μL。甘油濃度用甘油試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）測(cè)定，比甘油產(chǎn)率/（mmol/g）=甘油濃度/菌體干質(zhì)量濃度。

1.3.5 固醇分析

將BY4741、Bs-1、Bs-2菌株接種到Y(jié)PD、60 g/L NaCl-YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。將菌液于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，棄上清液，菌體用去離子水水洗2 次，于液氮罐中速凍，再置于-80 ℃冰箱冰凍24 h，于冷凍干燥機(jī)中制成凍干菌粉。稱取20 mg凍干菌粉，加入7 mL溶劑（甲醇-異丙醇1∶1）、50 μg色譜級(jí)膽固醇內(nèi)標(biāo)和0.5 μm的玻璃珠渦旋破碎10 min，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，轉(zhuǎn)速100 r/min、40 ℃水浴蒸發(fā)約2 min，濃縮為約1 mL的溶液，0.2 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣到GC-MS檢測(cè)。

GC-MS檢測(cè)條件：7890/5977 GC-MS系統(tǒng)；HP-5 ms色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件：GC-爐溫度以5 ℃/min從180 ℃（2 min）至300 ℃（4 min）；載氣流速1 mL/ min，進(jìn)樣量1 μL，界面溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電子碰撞電離70 eV，全掃描范圍m/z30～550，溶劑延遲3.5 min[20]。目標(biāo)化合物的峰識(shí)別基于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究所（NIST 14）數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

搖瓶實(shí)驗(yàn)做3 次重復(fù)，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，用Origin 9.0軟件作圖。固醇含量和比甘油產(chǎn)率進(jìn)行3 次測(cè)定，運(yùn)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌株的獲得

2.1.1kanMX同源敲除ERG3基因

利用引物對(duì)ERG3-UF和ERG3-DR，分別以野生型S. cerevisiaeBY4741 DNA和重組菌株（ERG3::kanMX）DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如圖2所示，野生型菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物為2 497 bp，重組菌株（ERG3::kanMX）的擴(kuò)增產(chǎn)物為2 960 bp。

圖 2 kanMX敲除菌株的PCR驗(yàn)證Fig. 2 PCR validation of knockout strain with kanMX markers

2.1.2kanMX篩選標(biāo)記的刪除

圖 3 刪除kanMX標(biāo)記的敲除菌株的PCR驗(yàn)證Fig. 3 PCR validation of knockout strain with kanMX markers being deleted

以Bs-1菌株的DNA為模板，以引物對(duì)ERG3-UF和ERG3-DR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Bs-1的擴(kuò)增產(chǎn)物為1 500 bp（圖3）。

2.1.3 過(guò)表達(dá)菌株的驗(yàn)證

利用一步法克隆試劑盒將ERG3和pYES2質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到野生型S. cerevisiaeBY4741中，構(gòu)建過(guò)表達(dá)菌株Bs-2。從構(gòu)建成功的過(guò)表達(dá)菌株中，提取pYES2質(zhì)粒DNA，用HindⅢ酶切驗(yàn)證，得到2 個(gè)條帶，分別為1 097 bp的ERG3基因條帶和5 900 bp的線性化pYES2質(zhì)粒DNA條帶（圖4）。

圖 4 過(guò)表達(dá)菌株的PCR驗(yàn)證Fig. 4 PCR validation of overexpressing strains

2.2 菌株的耐鹽性平板驗(yàn)證

如圖5a所示，在YPG平板上，3 個(gè)菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)良好且各稀釋梯度的菌落大小基本相同。在60 g/L NaCl-YPG培養(yǎng)基中，BY4741、Bs-2均生長(zhǎng)良好，但Bs-1的生長(zhǎng)狀態(tài)較差且隨稀釋梯度菌落生長(zhǎng)不明顯；在80 g/L NaCl-YPG培養(yǎng)基中，BY4741和Bs-2均能生長(zhǎng)，但Bs-1基本不生長(zhǎng)，在高稀釋倍數(shù)下幾乎觀察不到菌落。由此可見，Bs-1的耐鹽性與野生菌株BY4741相比，耐鹽性能明顯下降。Bs-2與野生菌株BY4741相比，在所有鹽質(zhì)量濃度條件下生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致。

圖 5 構(gòu)建菌株的進(jìn)一步驗(yàn)證Fig. 5 Further verification of the constructed strain

2.3 固醇分析

用GC-MS測(cè)定各菌株中固醇含量，如圖5b所示，從這些菌株中主要檢測(cè)出了兩種固醇麥角固醇和5,6-二氫麥角固醇。Bs-1中沒有產(chǎn)生麥角固醇，卻產(chǎn)生了新固醇5,6-二氫麥角固醇，結(jié)構(gòu)如圖5c所示。上述結(jié)果主要因?yàn)镋RG3是麥角固醇合成過(guò)程中關(guān)鍵的去飽和酶，ERG3基因的敲除導(dǎo)致麥角固醇的前體物質(zhì)糞固醇的C-5和C-6不能脫氫形成雙鍵，只能生成中間物5,6-二氫麥角固醇。在60 g/L NaCl-YPD下，Bs-1菌株合成5,6-二氫麥角固醇的量為（6.30±0.40）μg/mg，略高于無(wú)脅迫條件下（5.89±0.04）μg/mg。BY4741在YPD和60 g/L NaCl-YPD中，產(chǎn)生的麥角固醇量相當(dāng)，為（3.50±0.50）μg/mg（圖5b）。Bs-2菌株在YPD下，產(chǎn)生的麥角固醇量為（3.30±0.10）μg/mg，和BY4741相當(dāng)。工程菌株Bs-1敲除了ERG3基因，不能合成麥角固醇，其耐鹽性明顯下降。由此可見，酵母的耐鹽特性可能主要與固醇種類相關(guān)。

2.4 菌株的生理特性

由于工程菌Bs-2與BY4741在耐鹽性方面的表現(xiàn)相似，所以后期只取BY4741和耐鹽能力減弱的工程菌Bs-1在YPD和60 g/L NaCl-YPD中搖瓶發(fā)酵，檢測(cè)其代謝特性。如圖6所示，BY4741在YPD中的最大OD600nm為13.90±0.02，在60 g/L NaCl-YPD中的最大OD600nm為10.19±0.13，它在無(wú)脅迫條件下的最大OD600nm是鹽脅迫條件下的1.36 倍，表明鹽脅迫會(huì)使菌株的生長(zhǎng)能力變?nèi)?，菌株需要消耗自身生長(zhǎng)的部分能量用于對(duì)抗鹽脅迫。在60 g/L NaCl-YPD和YPD條件下，BY4741的乙醇產(chǎn)量都隨生長(zhǎng)曲線的趨勢(shì)而增加，至穩(wěn)定期不再增加，保持穩(wěn)定。但BY4741在YPD中的乙醇最高產(chǎn)量為（10.75±0.25）g/L，在60 g/L NaCl-YPD中的乙醇最高產(chǎn)量為（6.50±0.00）g/L，它在無(wú)脅迫下的最高乙醇產(chǎn)量是鹽脅迫條件的1.65 倍。在YPD培養(yǎng)基中，BY4741的乙酸產(chǎn)量與糖耗趨勢(shì)保持一致，葡萄糖7 h耗完，乙酸產(chǎn)量也在第7小時(shí)不再下降，保持穩(wěn)定。在60 g/L NaCl-YPD條件下，BY4741 13 h葡萄糖基本耗完，耗時(shí)比在YPD中多1 倍，而乙酸產(chǎn)量保持在0.48～0.75 g/L范圍內(nèi)波動(dòng)。在鹽脅迫下，BY4741的生長(zhǎng)明顯變緩慢，糖耗減慢，生長(zhǎng)周期延長(zhǎng)，乙醇產(chǎn)量降低，生長(zhǎng)受到抑制。

圖 6 BY4741在YPD（A）和60 g/L NaCl-YPD（B）培養(yǎng)基中生理特性Fig. 6 Physiological characteristics of BY4741 when cultured in YPD (A) and YPD (B) with 60 g/L NaCl

Bs-1菌株在YPD培養(yǎng)基中的最大OD600nm為11.4±0.14，在60 g/L NaCl-YPD培養(yǎng)基中的最大OD600nm為5.56±0.30，它在無(wú)脅迫條件下的最大OD600nm是鹽脅迫的2.06 倍。進(jìn)一步證明，Bs-1比BY4741的耐鹽性能差，并且應(yīng)對(duì)鹽脅迫的滯后期更長(zhǎng)。Bs-1在有或無(wú)鹽脅迫條件下，乙醇產(chǎn)生的趨勢(shì)也與生長(zhǎng)趨勢(shì)一致。Bs-1在YPD中的最高乙醇產(chǎn)量為（5.90±0.10）g/L，在60 g/L NaCl-YPD中的最高乙醇產(chǎn)量為（4.20±0.00）g/L，Bs-1在無(wú)鹽脅迫下的最高乙醇產(chǎn)量均低于鹽脅迫下BY4741的最高乙醇產(chǎn)量，表明ERG3的敲除對(duì)釀酒酵母的乙醇產(chǎn)量也有一定的影響。在無(wú)脅迫條件下，Bs-1的乙酸產(chǎn)量與糖耗趨勢(shì)一致。在鹽脅迫條件下，Bs-1的乙酸產(chǎn)量在0.52～0.77 g/L范圍內(nèi)波動(dòng)，沒有明顯的增加或減少趨勢(shì)，如圖7所示。Bs-1在YPD中的生長(zhǎng)狀態(tài)相比于BY4741有所減弱，乙醇產(chǎn)量明顯降低；Bs-1在60 g/L NaCl-YPD中的生長(zhǎng)狀態(tài)更差，相比于YPD中，生物量降低一半，乙醇產(chǎn)量進(jìn)一步降低。

野生菌株BY4741和工程菌株Bs-1在60 g/L NaCl-YPD中時(shí)，生長(zhǎng)均受到抑制。在60 g/L NaCl-YPD中，BY4741的最大OD600nm為10.19±0.13，Bs-1的最大OD600nm為5.56±0.30，BY4741的最大OD600nm是Bs-1的1.83 倍；BY4741的最高乙醇產(chǎn)量為（6.50±0.00）g/L，Bs-1的最高乙醇產(chǎn)量為（4.20±0.00）g/L，BY4741的最高乙醇產(chǎn)量是Bs-1的1.55 倍；BY4741的乙酸產(chǎn)量保持在0.48～0.75 g/L范圍內(nèi)，Bs-1的乙酸產(chǎn)量在0.52～0.77 g/L范圍內(nèi)。

圖 7 Bs-1在YPD（A）和60 g/L NaCl-YPD（B）培養(yǎng)基中的生理特性Fig. 7 Physiological characteristics of Bs-1 when cultured in YPD (A) and YPD (B) with 60 g/L NaCl

2.5 甘油的積累和保留

甘油是酵母應(yīng)對(duì)鹽脅迫產(chǎn)生的主要的滲透調(diào)節(jié)物，它能保持胞內(nèi)水平衡、穩(wěn)定酶系統(tǒng)正常代謝功能以及恢復(fù)正常細(xì)胞容積。Herrera等[21]研究發(fā)現(xiàn)漢遜酵母主要通過(guò)產(chǎn)生甘油作為滲透調(diào)節(jié)物和將Na＋隔離在液泡中兩種策略應(yīng)對(duì)鹽脅迫。在鹽脅迫下，為確保高濃度的胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物，酵母細(xì)胞會(huì)采取調(diào)整細(xì)胞周期，限制氧化還原元素和能耗的方式實(shí)現(xiàn)。測(cè)定酵母在YPD和60 g/L NaCl-YPD中胞內(nèi)外比甘油產(chǎn)率（圖8）。在YPD中，BY4741在指數(shù)期和穩(wěn)定期產(chǎn)生的胞內(nèi)比甘油產(chǎn)率分別為（0.015 4±0.000 1）mmol/g和（0.007 0±0.000 8）mmol/g；BY4741在指數(shù)期和穩(wěn)定期產(chǎn)生的胞外比甘油產(chǎn)率分別為（0.110 0±0.002 0）mmol/g和（0.064 0±0.002 0）mmol/g。在YPD中，Bs-1在指數(shù)期和穩(wěn)定期產(chǎn)生的胞內(nèi)比甘油產(chǎn)率分別為（0.008 0±0.001 8）mmol/g和（0.011 8±0.000 1）mmol/g；Bs-1在指數(shù)期和穩(wěn)定期產(chǎn)生的胞外比甘油產(chǎn)率分別為（1.260 0±0.060 0）mmol/g和（1.250 0±0.010 0）mmol/g。在無(wú)鹽脅迫條件下，BY4741和Bs-1產(chǎn)生的胞外比甘油產(chǎn)率均高于胞內(nèi)比甘油產(chǎn)率，因此釀酒酵母對(duì)甘油的保留能力較差，大部分甘油都被外排到培養(yǎng)基中。在YPD培養(yǎng)基中，BY4741產(chǎn)生的總比甘油產(chǎn)率在指數(shù)期約為0.125 0 mmol/g，穩(wěn)定期約為0.071 0 mmol/g；Bs-1產(chǎn)生的總比甘油產(chǎn)率在指數(shù)期約為1.268 0 mmol/g，穩(wěn)定期約為1.260 0 mmol/g。由此可見，Bs-1在無(wú)鹽脅迫條件下產(chǎn)生的甘油量比BY4741高。

在60 g/L NaCl-YPD中，BY4741在指數(shù)期和穩(wěn)定期的胞內(nèi)比甘油產(chǎn)率分別為（0.228 0±0.009 0）mmol/g和（0.165 0±0.005 0）mmol/g；BY4741在指數(shù)期和穩(wěn)定期產(chǎn)生的胞外比甘油產(chǎn)率分別為（8.900 0±1.100 0）mmol/g和（6.750 0±0.250 0）mmol/g。在60 g/L NaCl-YPD中，Bs-1在指數(shù)期和穩(wěn)定期產(chǎn)生的胞內(nèi)比甘油產(chǎn)率分別為（0.200 0±0.040 0）mmol/g和（0.076 0±0.010 0）mmol/g；Bs-1在指數(shù)期和穩(wěn)定期產(chǎn)生的胞外比甘油產(chǎn)率分別為（24.500 0±3.500 0）mmol/g和（13.100 0±0.100 0）mmol/g。在鹽脅迫下，BY4741和Bs-1產(chǎn)生比YPD中更多的甘油響應(yīng)鹽脅迫；在指數(shù)期和穩(wěn)定期，Bs-1產(chǎn)生的總比甘油產(chǎn)率比BY4741更多，但大部分為胞外，胞內(nèi)甘油濃度低于BY4741。

圖 8 菌株胞內(nèi)外比甘油產(chǎn)率Fig. 8 Ratio between intracellular and intracellular glycerol production

3 討 論

本研究主要探索酵母麥角固醇與其耐鹽性之間的關(guān)系，構(gòu)建了2 個(gè)工程菌株Bs-1（敲除菌株）和Bs-2（過(guò)表達(dá)菌株）。測(cè)定菌株的固醇種類和含量，發(fā)現(xiàn)Bs-2和BY4741的固醇種類和含量相近，Bs-1不能合成麥角固醇，卻合成了新固醇5,6-二氫麥角固醇。前期研究普遍認(rèn)為麥角固醇合成最后幾步反應(yīng)為圖1所示的線性過(guò)程[22]，近年來(lái)也有證據(jù)表明其中某些反應(yīng)可能不是嚴(yán)格線性進(jìn)行的[5,23]。因此，構(gòu)建的ERG3缺失突變株Bs-1通常會(huì)被認(rèn)為積累上位固醇或其“上游”產(chǎn)物糞固醇，并阻斷“下游”酶ERG5和ERG4的功能[24]。但實(shí)際結(jié)果卻是ERG3的敲除并沒有影響酶ERG5和ERG4的活性，最后生成并積累了新的產(chǎn)物5,6-二氫麥角固醇。這可能是因?yàn)橄嚓P(guān)酶的底物特異性相對(duì)較弱，導(dǎo)致麥角固醇最后幾步合成具有了很高的靈活性。

對(duì)3 個(gè)菌株（BY4741、Bs-1、Bs-2）的耐鹽性進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)Bs-1的耐鹽性明顯變差。研究表明細(xì)胞膜中固醇的比例、種類、結(jié)構(gòu)都會(huì)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性[25]，敲除菌株Bs-1細(xì)胞膜中固醇種類發(fā)生了變化，導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性的改變，影響菌株對(duì)鹽脅迫的耐受性。

酵母鹽脅迫適應(yīng)性與細(xì)胞代謝過(guò)程密切關(guān)聯(lián)，其中氧化還原平衡是關(guān)鍵因素之一。在鹽脅迫條件下，胞外滲透壓的升高會(huì)引起S. cerevisiae胞質(zhì)中NADH含量增加，乙醇減少，乙醛增加，導(dǎo)致酵母通過(guò)HOG途徑提高甘油生成量[26-27]。測(cè)定BY4741和Bs-1菌株在YPD和60 g/L NaCl-YPD中的生理性狀，發(fā)現(xiàn)60 g/L的NaCl對(duì)BY4741和Bs-1的生長(zhǎng)都造成了影響，但Bs-1受到的脅迫影響最大。在YPD培養(yǎng)基中，BY4741的生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于Bs-1，菌體干質(zhì)量濃度、乙醇產(chǎn)量都比Bs-1高，糖耗數(shù)率也較快。BY4741在60 g/L NaCl-YPD中的生長(zhǎng)狀態(tài)與Bs-1在YPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)相似。Bs-1在60 g/L NaCl-YPD中的生長(zhǎng)嚴(yán)重受到脅迫，生物量、乙醇產(chǎn)量都較低。鹽脅迫條件下，BY4741和Bs-1乙酸含量無(wú)明顯變化。進(jìn)一步測(cè)定BY4741和Bs-1在YPD和60 g/L NaCl-YPD中指數(shù)期和穩(wěn)定期胞內(nèi)外比甘油產(chǎn)率，發(fā)現(xiàn)在YPD中，BY4741和Bs-1產(chǎn)生的比甘油產(chǎn)率不高，大部分甘油被外排到培養(yǎng)基中，甘油保留能力差。在鹽脅迫下，Bs-1在指數(shù)期和穩(wěn)定期都比BY4741產(chǎn)生更多的甘油，并將大部分甘油排出胞外，導(dǎo)致BY4741的胞內(nèi)比甘油產(chǎn)率高于Bs-1，這可能是BY4741比Bs-1更耐鹽的原因。甘油的保留能幫助細(xì)胞在面對(duì)鹽脅迫時(shí)阻止胞內(nèi)水分外流，但甘油是一種脂溶性物質(zhì)，它有透過(guò)脂膜的趨勢(shì)，能通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散穿過(guò)生物膜，所以保留甘油是一種生物調(diào)節(jié)過(guò)程。細(xì)胞膜的流動(dòng)性是影響甘油保留的重要因素之一，而構(gòu)成細(xì)胞膜組成成分和比例又決定了膜的流動(dòng)性[28]，ERG3基因的敲除使細(xì)胞膜的主要固醇種類由麥角固醇轉(zhuǎn)變?yōu)?,6-二氫麥角固醇，這種改變?cè)黾恿四さ牧鲃?dòng)性，使甘油通透性增強(qiáng)，Bs-1雖在鹽脅迫條件下合成了大量的甘油，但胞外甘油量比野生菌株BY4741多。此外，通過(guò)特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸甘油進(jìn)入細(xì)胞是甘油保留另外一種途徑。主要分為兩種形式：低親和性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（協(xié)助運(yùn)輸）和高親和性質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（主動(dòng)運(yùn)輸），但它們的活性常會(huì)被高濃度鹽抑制[29-30]。因此，菌株Bs-1在鹽脅迫條件下雖然產(chǎn)生了大量甘油，但對(duì)甘油的保留能力減弱，導(dǎo)致細(xì)胞耐鹽能力降低。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建釀酒酵母麥角固醇C-5去飽和酶ERG3的基因缺失突變株、耐鹽性平板驗(yàn)證、固醇分析、生理特性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變株的鹽脅迫抗性減弱，不能合成麥角固醇，而合成了5,6-二氫麥角固醇，且鹽脅迫條件下甘油合成總量增加，胞內(nèi)甘油含量降低，乙醇合成減少，乙酸合成增多，滯后期延長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)減弱。綜上所述，ERG3的敲除導(dǎo)致菌株質(zhì)膜的固醇組成改變，影響包括甘油保留在內(nèi)的一系列菌株表型特征，致使菌株鹽脅迫抗性減弱。由此可見，C-5去飽和酶ERG3與酵母細(xì)胞膜固醇組分和菌株耐鹽性息息相關(guān)，證明了固醇在酵母細(xì)胞應(yīng)對(duì)鹽脅迫環(huán)境中所起的重要作用，并為工程化固醇組分提高工業(yè)酵母菌株魯棒性提供了理論支持。