王警建 馮海波 羅春海

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，雖然具有高度可治愈性，但是仍有約10%的甲狀腺癌患者患有進(jìn)行性疾病，另外還有約5%患有放射性碘難治性癌癥[1]。因此尋找新的生物標(biāo)志物及其作用機(jī)制對于甲狀腺癌的診斷、預(yù)防及治療仍舊極其重要。之前的研究認(rèn)為軸突導(dǎo)向分子主要調(diào)控發(fā)育中腦神經(jīng)元的生長和定位，但是近期的研究報(bào)道其在癌癥的發(fā)生發(fā)展中也起重要的調(diào)控作用[2-3]。Slits(Slit1-3)是具有代表性的軸突導(dǎo)向分子，可調(diào)控Roundabout(Robo)跨膜受體(Robo1-4)[2]，研究表明，在上皮惡性腫瘤中常?？蓹z測到Slits表達(dá)的改變，而Slits中研究稍多的成員是Slit2。Slit2在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎癌和宮頸癌中表達(dá)缺失，且Slit2可抑制胰腺癌、乳腺癌、胃癌和肺癌的轉(zhuǎn)移[4-5]。但是，迄今為止，Slit-Robo信號在甲狀腺癌中的表達(dá)和功能尚未明確闡明。對甲狀腺乳頭狀癌(PTC)高頻發(fā)生家族的一項(xiàng)全基因組連鎖分析鑒定出Slit-Robo Rho GTP酶活化蛋白1(SRGAP1)基因可成為PTC易感性的候選因子，并提出了Slit-Robo信號傳導(dǎo)在PTC作用[6]。另一項(xiàng)研究表明，miR-218-2及其宿主基因Slit3在甲狀腺癌中下調(diào)，并且它們對甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖起協(xié)同抑制作用[7]。本研究評估Slit2在甲狀腺癌患者癌組織及癌旁組織中表達(dá)及其與甲狀腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，并從體外研究Slit2對甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機(jī)制，探討Slit2在甲狀腺癌生物特性中的重要性。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本采集

選取2016年1月至2019年1月西安市第九醫(yī)院收治的經(jīng)外科手術(shù)的PTC患者50例，其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌21例。所有患者均經(jīng)西安市第九醫(yī)院影像科及病理科檢測確診。取術(shù)中甲狀腺癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織，所有標(biāo)本獲取前患者均未接受放療、化療，將獲取的組織立即放入液氮速凍，并儲存于-80 ℃直至實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞系BHT101購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液，以后每2 d換1次液，5～7 d傳代1次。取3～5代生長良好的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 Slit2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

經(jīng)PCR擴(kuò)增人Slit2 cDNA的全長為4950 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并割膠回收，之后將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pCMV6-Entry真核載體(北京OriGene公司)中構(gòu)建Slit2/pCMV6-Entry重組質(zhì)粒。將BHT101細(xì)胞以每孔3×105個(gè)/ml的密度種植于6孔板，依照脂質(zhì)體2000(上海碧云天公司)的說明書將Slit2/pCMV6-Entry重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHT101細(xì)胞中，同時(shí)以載體pCMV6-Entry轉(zhuǎn)染為對照，轉(zhuǎn)染24 h后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.4 細(xì)胞增殖活性分析

采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活性，試劑盒購自上海碧云天公司。將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞以每孔1×103個(gè)/ml、100 μl的密度接種于96孔板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別于接種后0、1、2、3、5、7 d每孔加入10 μl CCK-8溶液，孵育1 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度(OD)。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞侵襲：將100 μl matrigel膠(用無血清培養(yǎng)基稀釋)預(yù)鋪于transwell小室濾膜上表面，孵育1 h備用。將轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞重懸于無血清的培養(yǎng)基中，并以5×105個(gè)/ml、100 μl接種于transwell小室，然后將小室中放入含10%胎牛血清培養(yǎng)基的24孔板中，各組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，孵育48 h后，用棉簽小心移去上室內(nèi)的細(xì)胞及matrigel膠，用0.1%結(jié)晶紫染小室濾膜10 min，在光鏡下觀察細(xì)胞。隨機(jī)選取10個(gè)100倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取均值表示細(xì)胞侵襲能力。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，但不鋪matrigel膠。

1.6 免疫共沉淀

采用RIPA裂解液從轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞中提取總蛋白，經(jīng)3 000 r/min離心30 min后，取上清液，將一部分上清液用于Western Blot分析。給制備的上清中加入2 μg的抗E-cadherin抗體，另取50 μl蛋白裂解液作為陽性對照(input)，4 ℃結(jié)合過夜。將Protein G Agrose(上海翊圣生物科技有限公司)經(jīng)5 000 r/min離心1 min后，棄上清，用細(xì)胞裂解液重懸，加入至結(jié)合過夜的混合液中，室溫反應(yīng)30 min，離心后加入上樣緩沖液，進(jìn)行蛋白印跡檢測，此時(shí)一抗為抗E-鈣黏蛋白抗體和β-連環(huán)蛋白抗體，一抗均購自上海碧云天公司。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用Trizol試劑提取總RNA，采用BeyoRTTMⅡ cDNA第一鏈合成試劑盒合成第一鏈cDNA，用BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，試劑盒均購自上海碧云天公司。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，引物序列為：Slit2：上游5'-TCCGTTGTTCAGGTACAGAAGAT-3'，下游5'-CGACACTTTTCAGGGCAAGC-3'。 Rac1：上游5'-TACGCCCCCTATCCTATCCG-3'，下游5'-AGAGCAAGTGTCTGCACCTC-3'。內(nèi)參GAPDH：上游5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，下游5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。采用2-Ct計(jì)算目的基因的表達(dá)。

1.8 Western Blot

將免疫共沉淀制備的上清液，用BCA試劑盒定量后，加入上樣緩沖液中，用8%SDS-PAGE凝膠分離，轉(zhuǎn)膜，用5%胎牛血清封閉45 min，加入一抗，包括：Slit2，4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，加入二抗(1∶8 000，上海碧云天公司)，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗3次，用電化學(xué)發(fā)光試劑ECL暗室發(fā)光，采用美國Bio-Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)及Quantity One 4.6.2軟件對條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。一抗：Slit2(1∶200，上海酶聯(lián)生物)、Rac1(1∶800，德國Merck公司)、p(Ser71)-Rac1(1∶500，德國Merck公司)、內(nèi)參GAPDH(1∶5000，上海碧云天)。

1.9 Rac1活性分析

采用美國Cytoskeleton公司的Rac1 G-LISA活性分析試劑盒分析Rac1的活性。主要步驟為：將轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞裂解物以每孔50 μl加入Rac1-GTP親和板，400 rpm、4 ℃搖床震蕩孵育30 min，洗2次。每孔快速加入200 l抗原呈遞緩沖液，孵育2 min，洗3次。加入50 μl Rac1抗體(1∶50)，400 rpm、室溫?fù)u床震蕩孵育45 min，洗3次。加入50 μl辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶100)，400 rpm、室溫?fù)u床震蕩孵育45 min，洗3次。加入50 μl HRP檢測試劑，5 min內(nèi)采用熒光酶標(biāo)儀在490 nm處檢測熒光強(qiáng)度。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Slit2在甲狀腺癌患者中的表達(dá)

如表1所示，Slit2 mRNA在甲狀腺癌組織中的表達(dá)顯著低于其在癌旁組織中的表達(dá)(P<0.05)。Slit2 mRNA在轉(zhuǎn)移癌患者的甲狀腺癌組織中的表達(dá)顯著低于其在無轉(zhuǎn)移癌患者中的表達(dá)(P<0.05)。

表1 甲狀腺癌患者Slit2 mRNA的表達(dá)

2.2 Slit2對甲狀腺癌細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，與對照組相比，Slit2組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染1 d、2 d、3 d、5 d、7 d時(shí)的細(xì)胞增殖活性顯著降低(P<0.05)。

2.3 Slit2對甲狀腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

如表2所示，與對照組相比，Slit2組細(xì)胞中Slit2 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

Slit2組細(xì)胞中遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05)。

圖1 各組細(xì)胞增殖活性分析

2.4 Slit2對Rho GTP酶Rac1活性的影響

如表3所示，與對照組相比，Slit2組細(xì)胞中Rac1活性、p-Rac1、Rac1 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

2.5 Slit2對β-連環(huán)蛋白/E-鈣黏蛋白復(fù)合體的影響

如表4所示，與對照組相比，Slit2組細(xì)胞中E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白的相互結(jié)合作用顯著增加，對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

之前許多研究已經(jīng)將Slit-Robo信號傳導(dǎo)通路與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化和進(jìn)展的調(diào)節(jié)聯(lián)系起來。然而，最近的證據(jù)表明，Slit-Robo信號傳導(dǎo)的作用并不簡單，它們可直接作為癌基因或腫瘤抑制因子起作用，而且與細(xì)胞類型或癌癥階段有密切關(guān)系[2]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Slit2在甲狀腺癌中起腫瘤抑制劑的作用。過去的研究顯示在其他惡性腫瘤中常?？蓹z測到Slit2基因沉默或啟動(dòng)子高甲基化而下調(diào)[4-5,8]，而隨著甲狀腺癌的研究進(jìn)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Slit2在PTC患者癌組織中的表達(dá)顯著下降，并與PTC的侵襲性特征相關(guān)[9]。這與我們的研究結(jié)果一致，Slit2 mRNA在甲狀腺癌組織中的表達(dá)顯著低于其在癌旁組織中的表達(dá)，在轉(zhuǎn)移癌患者的甲狀腺癌組織中的表達(dá)顯著低于其在無轉(zhuǎn)移癌患者中的表達(dá)。這些研究及結(jié)果證實(shí)，Slit2在PTC中發(fā)揮抑制作用，且可能抑制癌癥的轉(zhuǎn)移。

為進(jìn)一步研究Slit2在PTC中的作用機(jī)制，我們通過給人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞系BHT101轉(zhuǎn)染Slit2/pCMV6-Entry重組質(zhì)粒，在體外研究Slit2對PTC增殖、遷移、侵襲的影響，并探討影響機(jī)制，結(jié)果表明，Slit2過表達(dá)抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)Slit2在甲狀腺癌中作為腫瘤抑制因子的作用，而Slit2可能成為抑制侵襲性進(jìn)行性甲狀腺癌轉(zhuǎn)移的新治療劑。同時(shí)Shi等也得到類似的結(jié)果，經(jīng)短發(fā)夾沉默的Slit2可顯著增加甲狀腺癌細(xì)胞的存活率[9]。但是在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中如何上調(diào)Slit2目前尚不清楚。我們的假設(shè)是，PTC中Slit2表達(dá)的降低可能是一個(gè)補(bǔ)償機(jī)制，對其他致癌因素導(dǎo)致的信號通路失調(diào)的一種補(bǔ)償機(jī)制，但還需要進(jìn)一步的功能分析來描述Slit2-Robo信號在甲狀腺癌的腫瘤發(fā)生中的作用，以及調(diào)控Slit2-Robo信號傳導(dǎo)活性的機(jī)制。

表2 各組細(xì)胞遷移和侵襲分析

表3 各組Rac1活性及表達(dá)對比

表4 各組β-連環(huán)蛋白和E-cadherin蛋白相互作用的對比

目前Slit2在甲狀腺癌增殖、遷移和侵襲中的作用機(jī)制還甚少報(bào)道。Shi等的研究顯示，下調(diào)的Slit2可通過促進(jìn)低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而增加甲狀腺癌細(xì)胞的有氧糖酵解(Warburg效應(yīng))過程，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖[9]。但也有許多研究表明，Slit-Robo信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可促進(jìn)β-連環(huán)蛋白在膜上定位，從而抑制其在細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄功能[8,10]。E-鈣黏蛋白是一種單次跨膜糖蛋白，主要介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間黏附，胞外區(qū)包含的組氨酸-丙氨酸-纈氨酸序列是E-鈣黏蛋白發(fā)揮黏附功能所必需的，胞內(nèi)區(qū)非常保守，可與連環(huán)蛋白(α-、β-、γ-)相結(jié)合參與連接細(xì)胞骨架[11]。但β-連環(huán)蛋白除了參與E-鈣黏蛋白與細(xì)胞骨架的連接外，還可轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，增加Wnt介導(dǎo)的TCF/LEF-1的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖[12]。本研究通過免疫共沉淀的方法檢測到Slit2可顯著增加E-鈣黏蛋白和β-連環(huán)蛋白的結(jié)合，因此我們推斷Slit2可能通過增加β-連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，與跨膜糖蛋白E-鈣黏蛋白結(jié)合，進(jìn)而降低β-連環(huán)蛋白在核內(nèi)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，最終抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖。

此外，許多研究表明Slit-Robo信號通過調(diào)節(jié)Rho GTP酶影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[2]。Rho GTP酶是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架及脊椎動(dòng)物細(xì)胞形態(tài)異質(zhì)性的調(diào)節(jié)器，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。目前研究最多的Rho GTP酶主要包括Cdc42、Rac1和RhoA。Rac1活化可導(dǎo)致細(xì)胞外周肌動(dòng)蛋白絲網(wǎng)的組裝，從而產(chǎn)生扁平足和膜皺褶。而Cdc42活化則可誘發(fā)富含肌動(dòng)蛋白的膜表面突起，稱為絲狀偽足[13]。因此，Rac1和Cdc42的活化對于細(xì)胞遷移和侵襲等細(xì)胞運(yùn)動(dòng)具有促進(jìn)作用。本研究顯示，Slit2可顯著抑制Rac1活性、p-Rac1、Rac1 mRNA和蛋白的表達(dá)，提示Slit2對細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的抑制作用，與Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。但本研究也存在許多不足之處，比如甲狀腺癌患者的樣本量較少，對β-連環(huán)蛋白在膜定位的檢測缺少免疫熒光分析，對Slit2抑制Rho GTP酶介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)只檢測Rac1一個(gè)分子。這些還需要更加詳細(xì)深入的研究。

總之，Slit2抑制甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展，并通過增加膜β-連環(huán)蛋白/E-鈣黏蛋白的結(jié)合抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖，通過抑制Rho GTP酶Rac1抑制甲狀腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。本文揭示了Slit2/Robo信號傳導(dǎo)作為甲狀腺癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物和/或候選治療靶標(biāo)的重要性。