顏 偉 王雅琦 李江龍 陳潭琇

卵巢癌屬于惡性腫瘤之一，在婦科腫瘤中致死率名列第1位，5年生存率<25%，由于早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，患者經(jīng)診斷大部分處于晚期或者已發(fā)生轉(zhuǎn)移[1-2]。目前，對(duì)于卵巢癌患者，術(shù)后輔以化療是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，影響化療敏感性基因已受學(xué)者們的廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的系統(tǒng)性放療在臨床上也有一定的價(jià)值，然而探討影響放療敏感性基因的研究較少[1,3]。因此，尋找導(dǎo)致放療耐受的基因并探索其分子機(jī)制顯得尤為迫切。泛素化特異性蛋白酶39(USP39)是去泛素化家族成員之一，多項(xiàng)研究顯示USP39在多種類型的腫瘤組織中表達(dá)異常升高，并且可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。另外，有報(bào)道顯示USP39敲降后可逆轉(zhuǎn)化療耐受。本研究擬對(duì)卵巢癌細(xì)胞ES2進(jìn)行USP39敲降后再進(jìn)行X線照射，通過檢測(cè)凋亡水平及凋亡和DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)情況，探討USP39的表達(dá)水平對(duì)卵巢癌細(xì)胞放療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

山羊抗兔/小鼠的單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白定量試劑盒及化學(xué)發(fā)光液購自美國(guó)Thermofisher公司；USP39單克隆抗體購自美國(guó)Abcam公司，Caspase3和PARP單克隆抗體購自Cell Signaling公司，β-actin單克隆抗體購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國(guó)Invitrogen公司；ES2及HEK293T細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 USP39-shRNA的合成 USP39-shRNA序列及對(duì)照序列shGFP均由上海生物工程股份有限公司合成，分別命名為shUSP39#1、shUSP39#2、shGFP。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)ES2細(xì)胞，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待HEK293T細(xì)胞達(dá)到70%～80%滿后，將合成的shGFP、shUSP39#1和shUSP39#2按照脂質(zhì)體試劑說明操作經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，48 h后，收集培養(yǎng)上清病毒液，800 g離心10 min，用0.45 μm濾器過濾，-80 ℃保存。將過濾后的病毒上清以1∶3的體積比加入ES2細(xì)胞培養(yǎng)上清中，另外加入5 mg/ml的polybrene，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分別命名為shGFP組、shUSP39#1組、shGFP#2組。

1.2.3 Western Blot 收集經(jīng)或者不經(jīng)6 Gy X線照射10 min的ES2 shGFP、ES2 shUSP39#1和ES2 shGFP#2細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液 (1% Triton X-100；10 mM Tris-HCl，pH 7.4；150 mM NaCl；0.25% 去氧膽酸鈉；5 mM EDTA，pH 7.4) 于冰上裂解20～30 min后，12 000 rpm離心15 min，收集蛋白上清，用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜，室溫二抗孵育1 h，最后曝光成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。若P<0.05，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 USP39敲降后對(duì)ES2細(xì)胞凋亡的影響

本研究利用APC標(biāo)記的Annexin V和PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了USP39敲降對(duì)ES2細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組相比，USP39 敲降組細(xì)胞凋亡明顯增加，細(xì)胞經(jīng)6 Gy X線照射后，細(xì)胞凋亡明顯增加，且USP39 敲降組更為明顯，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖1)。

圖1 USP39敲降誘導(dǎo)ES2細(xì)胞凋亡

2.2 USP39敲降后對(duì)ES2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的影響

Western Blot結(jié)果顯示，shUSP39#1和shUSP39#2均有效抑制了ES2細(xì)胞USP39的表達(dá)。shGFP對(duì)照組細(xì)胞shUSP39干擾ES2細(xì)胞均不接受或者接受6 Gy X線照射，結(jié)果顯示，與未經(jīng)X線照射組比較，shUSP39干擾組在經(jīng)X線照射后凋亡相關(guān)蛋白cleaved-PARP和cleaved-Caspase3表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H2A.X表達(dá)明顯升高，且shUSP39#1組的效果優(yōu)于shUS39P#2(P<0.05)。見圖2。

圖2 USP39敲降調(diào)控細(xì)胞凋亡及DNA損傷相關(guān)蛋白

3 討論

隨著中國(guó)社會(huì)的老齡化發(fā)展，卵巢癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，且發(fā)病趨于年輕化。卵巢癌早期無明顯臨床癥狀，70%在發(fā)現(xiàn)時(shí)處于晚期，晚期卵巢癌的生存率低于30%[4]。放療是用于極晚期、局部復(fù)發(fā)性或難治性卵巢癌的姑息性或局部性治療的手段之一，大多數(shù)卵巢對(duì)放療具有放射抗拒性[5]。有研究表明誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或DNA損傷是腫瘤放射治療的主要機(jī)制之一，影響腫瘤放療敏感性的因素諸多，其中某些基因的異常表達(dá)被認(rèn)為影響腫瘤放射敏感性，目前國(guó)外研究較多，但尚未定論[6]。鄭琳?qǐng)?bào)道RbAp48的表達(dá)水平影響宮頸癌細(xì)胞的放射敏感性，對(duì)RbAp48進(jìn)行敲降，SiHa、Caski和HeLa細(xì)胞的凋亡比例明顯高于對(duì)照組，其中以SiHa細(xì)胞最為明顯[7]。

本研究利用慢病毒介導(dǎo)的USP39基因沉默，結(jié)果顯示USP39表達(dá)下調(diào)促進(jìn)ES2細(xì)胞凋亡，ES2細(xì)胞經(jīng)6Gy照射后，與未經(jīng)照射組相比，USP39敲降組凋亡相關(guān)蛋白cleaved-PARP和cleaved-Caspase3表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H2A.X表達(dá)水平升高，提示ES2細(xì)胞經(jīng)USP39敲降后放射敏感性提高，證實(shí)USP39與放射敏感性有關(guān)。USP39基因可能在放療過程中，啟動(dòng)諸多相關(guān)功能通路，從而發(fā)揮改變放療敏感性的作用。

綜上所述，USP39的表達(dá)可能與卵巢癌放射敏感性相關(guān)，USP39基因沉默能增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的放射敏感性，這將為探尋卵巢癌放射抗拒性的機(jī)制提供新的理論依據(jù)。USP39表達(dá)水平可能對(duì)于預(yù)測(cè)卵巢癌放療敏感性有所幫助，有望成為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)，對(duì)防治卵巢癌，延長(zhǎng)患者生命，提高患者生存質(zhì)量等具有極為重要的意義。