侯宇峰 蒲亞嵐 張鳳娟 蔣紹軍

帕金森是老年人群的常見的以紋狀體多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)減少以及中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性為主要特征的神經(jīng)元退行性疾病，嚴(yán)重?fù)p害身體健康并降低生活質(zhì)量[1]。目前尚且沒有有效地治療方法阻止或修復(fù)帕金森引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。關(guān)于帕金森的致病機(jī)理，有諸多研究表明其與基因突變、蛋白水解應(yīng)激、氧化應(yīng)激、免疫學(xué)異常、線粒體功能障礙、泛素蛋白酶體系統(tǒng)功能障、細(xì)胞凋亡礙等諸多機(jī)制有關(guān)，最終通過多種級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡、變性和壞死[2]。其中，氧化應(yīng)激引起的線粒體功能異常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的蛋白質(zhì)折疊異常等因素都可稱為帕金森分發(fā)病誘因[3]。當(dāng)前的研究熱點(diǎn)集中于降低神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷，抑制神經(jīng)元凋亡。Paralemmin-3(PALM3)屬于Paralemmin蛋白家族，于1992年首次在非洲爪蛙中被發(fā)現(xiàn)[4]，并發(fā)現(xiàn)其可參與膜蛋白的運(yùn)輸、參與信號(hào)傳導(dǎo)[5]。Chen等[6，7]研究在急性肺損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，敲低PALM3能夠顯著提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，從而顯著抑制細(xì)胞凋亡。這些表明PALM3在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激刺激中起著關(guān)鍵作用。為研究PALM3在保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)處理的SH-SY5Y細(xì)胞制造帕金森神經(jīng)損傷模型，通過敲低PALM3，觀察比較6-OHDA對細(xì)胞的損傷作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SH-SY5Y細(xì)胞(購自國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái))鋪板于含有10%胎牛血清(Gibco，10099141)的D-MEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基(Gibco，12400-024)，置于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。用0.25%胰酶(Gibco，25300054)消化細(xì)胞，3 d傳代一次。將細(xì)胞分為4組，不做任何處理的細(xì)胞組為對照組；用100 μmol/L 6-OHDA處理的細(xì)胞組為模型組；轉(zhuǎn)染control siRNA的細(xì)胞組為siRNA-control組以及轉(zhuǎn)染干擾PALM3的細(xì)胞組為siRNA-PALM3組。

1.2 RNA干擾 搜索PALM3在NCBI上的序列(NM_001367327.1，1104-1126，TTCCATAGAAGGGGAAGATGTGC)，利用在線工具siDirect version 2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)設(shè)計(jì)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成小干擾RNA(Small interfering RNA；siRNA):5’-ACAUCUUCCCCUUCUAUGGAA-3’及5’-UGUAGAAGGGGAAGAUACCUU-3’。同時(shí)合成陰性對照siRNA：5’-UAUGGAAUUCCCCUUCACAUC-3’及5’-ACCUUGAAGGGGAAGAUUGUA-3’。將陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染至siRNA-control組細(xì)胞，干擾PALM3的siRNA轉(zhuǎn)染至siRNA-PALM3組細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，RT-PCR和Western blot方法檢測4組細(xì)胞中的PALM3的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 RT-PCR檢測 收集上述4組細(xì)胞樣品，提取RNA后，使用全式金公司的TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix(AT401-01)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。根據(jù)GeneBank中PALM3的序列(NM_001367327.1)并借助primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物(F：5’-AAAGTTGAGGGACATTTGAGG-3’；R：5’-AGCAGTGGCTGGCATTCG-3’)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將上述cDNA作為模板，按照PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃，5 min；95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，1 min；30個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸凝膠電泳后置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(SYSTEM GelDoc XR+，1708195) 中成像。使用Image J分析軟件進(jìn)行灰度值分析，檢測PALM3的轉(zhuǎn)錄水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot檢測 收集上述4組細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳：濃縮膠恒壓80 V， 20 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部。使用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印槽(Trans-Blot SD，170-3940)在恒壓15 V，30 min條件下轉(zhuǎn)印至PVDV膜(生工，F(xiàn)019532-0010)。取下PVDF膜放入封閉液(TBST，5%脫脂奶粉，pH值7.4)中室溫孵育2 h；使用abcam公司生產(chǎn)的PALM3一抗稀釋液(ab189996，1∶5 000)室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；使用全式金公司生產(chǎn)的HRP標(biāo)記的二抗羊抗兔IgG 稀釋液(HS101-01，1∶10 000)室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；最后根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光液(上海天能)使用說明，將PVDF膜置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測 用Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Sigma，APOAF-20TST)檢測各組細(xì)胞凋亡情況。同時(shí)購買abcam公司的一抗及相應(yīng)二抗，用Western blot方法檢測各組細(xì)胞內(nèi)p53(abcam，ab26)、Bcl-2(abcam，ab692)、Bax(abcam，ab77566)以及活化的caspase-3(abcam，ab13585)、caspase-9(abcam，ab69514)等蛋白的表達(dá)水平。

1.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

1.6.1 ROS檢測：收集上述4組細(xì)胞，使用Abcam公司的DCFDA Cellular Ros Detection Assay Kit (Abcam ab113851)并按照其說明書操作，檢測4組細(xì)胞內(nèi)的ROS含量。

1.6.2 LDH檢測：收集4組細(xì)胞培養(yǎng)液，使用碧云天生物技術(shù)公司的乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒(C0016) 并按照其說明書操作，檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH含量。

1.6.3 GSH檢測：收集4組細(xì)胞，使用碧云天生物技術(shù)公司的GSH和GSSG檢測試劑盒(S0053) 并按照其說明書操作，檢測各組細(xì)胞中的GSH含量。

2 結(jié)果

2.1 PALM3蛋白表達(dá)檢測 RT-PCR結(jié)果顯示，PALM3在對照組、模型組和siRNA-control組的細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異(P>0.05)；PALM3在siRNA-PALM3組的轉(zhuǎn)錄水平較其他3組顯著降低(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，PALM3在對照組、模型組和siRNA-control組的細(xì)胞中的表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)；PALM3在siRNA-PALM3組的表達(dá)水平較其他3組顯著降低(P<0.05)。以上結(jié)果表明siRNA-PALM3組中細(xì)胞中PALM3敲低成功，該組細(xì)胞內(nèi)PALM3的表達(dá)被抑制。見圖1、2，表1、2。

圖1 PALM3在各組細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平

表1 PALM3在各組細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-control組比較，△P<0.05

圖2 PALM3在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平

表2 PALM3在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-control組比較，△P<0.05

2.2 PALM3敲低對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組、siRNA-control組及siRNA-PALM3組內(nèi)細(xì)胞凋亡數(shù)顯著增加(P<0.05)，表明6-OHDA成功誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。與模型組相比，siRNA-PALM3組細(xì)胞凋亡數(shù)顯著降低(P<0.05)，表明敲低PALM3，可顯著抑制6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。見圖3，表3。

圖3 PALM3敲低對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

表3 PALM3敲低對SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-control組比較，△P<0.05

2.3 PALM3敲低對凋亡信號(hào)蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，其他3組的p53和Bcl-2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，siRNA-PALM3組細(xì)胞的p53和Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。Bax，活化的Caspase-3及Caspase-9在模型組、siRNA-control組和siRNA-PALM3組的表達(dá)量較對照組顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，siRNA-PALM3組細(xì)胞中的上述3種蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4，表4。

圖4 PALM3敲低對凋亡信號(hào)蛋白表達(dá)的影響

表4 PALM3敲低對凋亡信號(hào)蛋白表達(dá)的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-control組比較，△P<0.05

2.4 PALM3敲低對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 相比對照組，其他組細(xì)胞內(nèi)ROS及細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH含量均顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，siRNA-PALM3組細(xì)胞的p53和Bcl-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。相比對照組，其他組細(xì)胞內(nèi)GSH含量均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，siRNA-PALM3組細(xì)胞的p53和Bcl-2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 PALM3敲低對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與siRNA-control組比較，△P<0.05

3 討論

帕金森是一種較常見的與年齡有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，以黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元的選擇性缺失為特征，并引起身體震顛、僵硬和行動(dòng)遲緩[1，8]。雖然具體的致病原因尚不清楚，但是有研究表明，氧化應(yīng)激、線粒體功能紊亂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及蛋白錯(cuò)誤折疊都與該病密切相關(guān)[9-11]。提高神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化能力，保護(hù)其免受氧化應(yīng)激而凋亡是研究熱點(diǎn)之一。

6-OHDA是多巴胺的羥基化類似物，常被用作制作多巴胺能神經(jīng)元變性模型[12]，它能夠誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的ROS依賴性細(xì)胞凋亡[13，14]。本實(shí)驗(yàn)中，SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)100 μmol/L的6-OHDA處理后，出現(xiàn)較高的凋亡率，表明成功制造出帕金森性神經(jīng)損傷模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做好了基礎(chǔ)。

真核細(xì)胞主要的凋亡傳導(dǎo)通路有：死亡因子及其受體介導(dǎo)的外部傳導(dǎo)途徑、線粒體凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和B粒酶凋亡途徑[15]。熱點(diǎn)涉及p53蛋白、caspase蛋白家族和Bcl-2蛋白家族。6-OHDA可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生p53依賴性凋亡[14]，在細(xì)胞凋亡過程中，caspase-3和caspase-9被活化[16，17]，并可以裂解Bcl-2，Bax含量升高[18]。

PALM3在膜蛋白的運(yùn)輸或者靶向等方面有重要作用，并參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。陳旭昕等[19]的研究表明，干擾PALM3表達(dá)，可緩解LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)。PALM3在保護(hù)細(xì)胞降低凋亡方面有重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾技術(shù)，敲低了SH-SY5Y 細(xì)胞中PALM3的表達(dá)，經(jīng)6-OHDA處理后，細(xì)胞凋亡數(shù)量、ROS含量、LDH、p53、Bcl-2、Bax以及活化的caspase-3、caspase-9較模型組顯著減少；而細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低PALM3后，SH-SY5Y 細(xì)胞降低了對6-OHDA誘導(dǎo)的應(yīng)激，減少了凋亡。

綜上所述，干擾SH-SY5Y細(xì)胞中PALM3表達(dá)，可顯著減輕6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，可能是由于PALM3表達(dá)的減少，抑制了p53表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡的caspase通路從而減輕了細(xì)胞損傷。