付 慧,陸一夫,胡小鍵,張 續(xù),楊艷偉,朱 英

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所, 北京 100021)

多環(huán)芳烴(PAHs)來(lái)源于各種礦物燃料(如煤、石油、天然氣等)及有機(jī)物的熱解或不完全燃燒,在空氣、水、土壤等各種環(huán)境介質(zhì)中廣泛存在[1]。尤其是現(xiàn)代工業(yè)的興起,飛機(jī)、汽車等各種機(jī)動(dòng)車輛日益增加及其他人為排放,導(dǎo)致PAHs的污染日益嚴(yán)重。人們?cè)谌粘Ｉ钪?通過(guò)呼吸、飲食、飲水,甚至皮膚接觸均會(huì)不同程度地暴露于PAHs[2-5]。研究表明,PAHs暴露可損害動(dòng)物中樞神經(jīng),破壞淋巴細(xì)胞微核率,肝臟功能和DNA修復(fù)能力,是具有“三致”毒性的化學(xué)物質(zhì)。此外,PAHs還具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng),可影響生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)功能,并導(dǎo)致遺傳損害[1]。PAHs被認(rèn)為是數(shù)量最多、分布最廣、與人類關(guān)系最密切、對(duì)人體健康威脅最大的環(huán)境致癌物之一,多環(huán)芳烴的人群暴露問題已逐漸成為日益重視的課題。

進(jìn)入體內(nèi)的PAHs在肝臟中分兩步轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)單羥基多環(huán)芳烴(OH-PAHs),隨后經(jīng)尿液或糞便排出體外[6]。由于PAHs在體內(nèi)代謝期較短,且尿液最易獲得和保存,人體尿液中OH-PAHs的分析被用作評(píng)估人類接觸PAHs最常用的方法。聯(lián)合多個(gè)PAHs代謝物作為生物標(biāo)志物,能更全面評(píng)估人體PAHs暴露水平。因此,建立快速靈敏、準(zhǔn)確穩(wěn)定的同時(shí)測(cè)定尿液中多種OH-PAHs的方法對(duì)于PAHs的暴露評(píng)價(jià)具有重要意義。

目前,測(cè)定尿中OH-PAHs常用的方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[7-10]、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)[11-13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[14-17]。國(guó)內(nèi)研究者測(cè)定尿中OH-PAHs多采用LC-MS/MS,國(guó)外研究者多采用GC-MS/MS。本實(shí)驗(yàn)室前期也利用LC-MS/MS建立了尿中12種OH-PAHs的測(cè)定方法,但基質(zhì)效應(yīng)會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用氣相色譜作為分離系統(tǒng),雖較液相色譜多了衍生化步驟,但其具有較低的基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定的色譜保留時(shí)間,適合復(fù)雜基質(zhì)的超痕量分析。串聯(lián)質(zhì)譜雖具有較好的選擇性和靈敏度,但其分辨率不夠高,對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量較高的離子有質(zhì)量歧視效應(yīng)[18];高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜具有高質(zhì)量分辨率和高質(zhì)量精度(質(zhì)量偏差通?！?0-6),能為復(fù)雜樣品基質(zhì)中痕量物質(zhì)的精準(zhǔn)檢測(cè)提供有力的技術(shù)保障[19,20]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Autospec Premier高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜儀(EI源,美國(guó)Waters Micromass公司), 7890A氣相色譜儀(美國(guó)Agilent公司), T-214電子天平(精度0.1 mg,美國(guó)Denver公司), LW-20水浴搖床(美國(guó)LabTech公司), EFCG11848氮吹儀(美國(guó)Organomation公司), GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠), 600C離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)。

正戊烷(GC級(jí),德國(guó)Merck公司),甲苯(HPLC級(jí),美國(guó)Tedia公司),十二烷(純度99%,比利時(shí)Acros公司),抗壞血酸(德國(guó)CNW公司),N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA,純度≥98.5%,美國(guó)Sigma-Aldrich公司),β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶混合酶(β-葡萄糖苷酸酶30 U/mL、硫酸芳酯酶60 U/mL)、超純水(德國(guó)Merck公司),標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)SRM3672(美國(guó)NIST標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取一定量的1-OHN標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度約為2 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液。各取一定體積的1-OHN單標(biāo)儲(chǔ)備液和7種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲苯溶解并定容至10 mL,配制成1-OHN質(zhì)量濃度為5.0 mg/L、其他各組分質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。用甲苯逐級(jí)稀釋配制得混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

稱取一定量的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度約為2 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液。量取一定體積的8種單標(biāo)儲(chǔ)備液，混合,用甲苯配制成各組分質(zhì)量濃度均為5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液;用甲苯逐級(jí)稀釋得到質(zhì)量濃度為200 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)使用液。

回收標(biāo)準(zhǔn)溶液(RSS):用甲苯稀釋13C-PCB105壬烷溶液至質(zhì)量濃度為100 ng/mL,用棕色瓶分裝,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理

將冰凍尿樣置于室溫,移取2 mL尿樣,置于12 mL玻璃離心管中,分別加入1 mL醋酸鈉溶液(1 mol/L, pH=5.5)、20 μL抗壞血酸溶液(250 mg/mL)、50 μLβ-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶和20 μL 200 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)使用液,混勻,于37 ℃水浴條件下避光水解約17 h,得水解液。

水解液中加入2 mL去離子水和5 mL甲苯-戊烷(1∶4, v/v)萃取劑,振搖30次,以3 600 r/min離心8 min,收集上層有機(jī)相;加入5 mL萃取劑,重復(fù)萃取,合并兩次萃取液。萃取液中加入1 mL 1 mol/L硝酸銀溶液,振搖30次,以3 600 r/min離心8 min,將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至氮吹試管中,加入20 μL十二烷,于40 ℃、5 Pa氮吹20 min,使戊烷揮發(fā);升溫至70 ℃,使甲苯揮發(fā)至近干。向氮吹試管中加入20 μL甲苯復(fù)溶,轉(zhuǎn)移至已加入20 μL RSS和100 μL衍生化試劑MSTFA的棕色進(jìn)樣小瓶中,混勻,于60 ℃烘箱中衍生50 min,待測(cè)。

1.3.2色譜條件

色譜柱:DB-5MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣(使用填充玻璃棉的超惰性內(nèi)襯管,最大限度減少柱污染);進(jìn)樣口溫度:270 ℃;傳輸管溫度:270 ℃;升溫程序:初始溫度95 ℃,保持2 min,以15 ℃/min升溫至160 ℃,再以5 ℃/min升溫至205 ℃,保持6 min,然后以10 ℃/min升溫至225 ℃,再以29 ℃/min升溫至310 ℃,保持6 min;載氣:高純氦氣,恒定流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量:1.0 μL。

1.3.3質(zhì)譜條件

離子源:EI源;離子源溫度:260 ℃;單離子接收檢測(cè)(voltage SIR);電子能量:35 eV;捕集電流:650 μA;光電倍增電壓:350 V;分辨率:10 000。8種OH-PAHs及其同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.4 質(zhì)量控制

羥基多環(huán)芳烴屬于光敏性物質(zhì),實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)使用防紫外線的熒光燈,以減少其陽(yáng)光暴露。每批樣品檢測(cè)應(yīng)附帶質(zhì)控樣品、空白樣品,以保證方法的準(zhǔn)確性并及時(shí)監(jiān)控空白污染。隨機(jī)抽取未知樣品總數(shù)的10%進(jìn)行重復(fù)測(cè)定,以保證方法的精密度,重復(fù)測(cè)定樣品的相對(duì)偏差不應(yīng)超過(guò)30%。目標(biāo)物相對(duì)于內(nèi)標(biāo)的相對(duì)保留時(shí)間比不能偏離校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的0.15%以上,每批樣品RSS的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于10%。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)通過(guò)梯度升溫程序,使不同組分得到了較好分離,且峰形尖銳、對(duì)稱。在自動(dòng)取樣器取樣前、后增設(shè)多次洗針程序,以消除連續(xù)取樣過(guò)程引起的目標(biāo)物殘留。8種OH-PAHs和8種相應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的色譜圖見圖1。

2.2 酶及其用量的選擇

根據(jù)前期經(jīng)驗(yàn)[14]及文獻(xiàn)報(bào)道[21,22],比較了單一β-葡萄糖苷酸酶、β-葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶混合酶、固體β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶混合酶、液體β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶混合酶共4類酶對(duì)SRM3672質(zhì)控樣品的酶解效果。結(jié)果表明,使用固體和液體β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶混合酶的測(cè)定結(jié)果較理想。其中,固體酶在使用時(shí)需要超聲溶解,容易出現(xiàn)溶解不充分的現(xiàn)象,而液體酶使用方便。故本研究最終選用液體β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶混合酶進(jìn)行酶解。

表 1 8種OH-PAHs及其同位素內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)

圖 1 8種OH-PAHs及其同位素內(nèi)標(biāo)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the eight OH-PAHs and their isotope internal standardsMSTFA: N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide.

在2 mL實(shí)際尿樣中加入不同體積的液體混合酶,通過(guò)考察目標(biāo)物的響應(yīng)值,確定酶的最佳使用量。最終確定2 mL尿樣中需加入50 μL液體混合酶。

2.3 衍生化試劑用量的選擇

衍生化是高分辨氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜分析OH-PAHs的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。實(shí)驗(yàn)在高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入不同體積的衍生化試劑MSTFA,通過(guò)考察目標(biāo)物的響應(yīng)值,確定MSTFA的合理使用量(見圖2)。在20 μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1-OHN 4 mg/L,其他組分0.8 mg/L)中,分別加入10、20、40、80、100和120 μL的MSTFA,隨著MSTFA用量的增加,目標(biāo)物的響應(yīng)值逐漸增大,當(dāng)用量達(dá)到100 μL時(shí),響應(yīng)趨于穩(wěn)定,且色譜圖中出現(xiàn)MSTFA的色譜峰(保留時(shí)間9.55 min,m/z223.141 0),說(shuō)明MSTFA過(guò)量,反應(yīng)完全。最終確定MSTFA的加入量為100 μL。

圖 2 不同衍生化試劑用量對(duì)目標(biāo)化合物響應(yīng)值的影響Fig. 2 Effect of different amount of derivatization reagents on the response values of the target compounds

表 2 8種OH-PAHs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

y: peak area ratio of quantitative ion of the analyte to IS;x: mass concentration ratio of the analyte to IS.

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍和檢出限

以甲苯為溶劑,配制質(zhì)量濃度分別為0.83、4.17、8.33、41.7、83.3、417和833 μg/L(1-OHN的質(zhì)量濃度為上述質(zhì)量濃度的5倍),內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為33.3 μg/L的系列單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液(折算到人尿中的質(zhì)量濃度分別為0.008、0.042、0.083、0.417、0.833、4.17和8.33 μg/L, 1-OHN的濃度為其的5倍)。各取20 μL上述單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液,轉(zhuǎn)移至已加入20 μL RSS和100 μL MSTFA的棕色進(jìn)樣小瓶中,混勻,于60 ℃烘箱中衍生50 min后測(cè)定。對(duì)目標(biāo)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)離子峰的峰面積之比(y)和目標(biāo)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度之比(x)進(jìn)行線性回歸分析,繪制校準(zhǔn)曲線,得到8種目標(biāo)化合物的線性方程和相關(guān)系數(shù)(r)。結(jié)果顯示,8種OH-PAHs的線性關(guān)系良好,r均>0.99(見表2)。參照美國(guó)環(huán)保署(US EPA)檢出限測(cè)定程序文件第2版[23],分別采用兩種方法(第一種考慮方法空白,計(jì)算6個(gè)月內(nèi)運(yùn)行的方法空白平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差;第二種考慮儀器靈敏度,計(jì)算3倍信噪比)考察檢出限,并取其高值作為方法的檢出限,再以3.3倍檢出限作為定量限。

考慮到樣品經(jīng)前處理后濃縮100倍,本方法對(duì)人尿中8種OH-PAHs的方法檢出限為0.006～0.042 μg/L,定量限為0.020～0.140 μg/L,結(jié)果見表2。

2.4.2加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

以實(shí)際尿樣進(jìn)行高、中、低3個(gè)水平的8種OH-PAHs的加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)水平分別為0.125、1.25和6.25 μg/L,每個(gè)水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn),計(jì)算加標(biāo)回收率。8種OH-PAHs的平均回收率為81.4%～127.0%。在同一天及不同天對(duì)實(shí)際尿液樣品進(jìn)行分析測(cè)定(n=6),以確定方法的日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果表明,8種OH-PAHs的日內(nèi)和日間精密度分別為2.7%～6.9%和5.1%～10.9%(見表3)。

2.4.3準(zhǔn)確性驗(yàn)證

通過(guò)美國(guó)NIST標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)SRM3672進(jìn)一步評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確性。用該方法對(duì)SRM3672進(jìn)行檢測(cè),并與其認(rèn)證的6種物質(zhì)的濃度進(jìn)行比較。OH-PAHs的認(rèn)證濃度來(lái)自SRM3672的分析證書,并將分析證書中的含量(μg/kg)通過(guò)尿密度(1.019 g/mL)轉(zhuǎn)換成質(zhì)量濃度(μg/L)。如表4所示,該方法對(duì)OH-PAHs的檢測(cè)結(jié)果與經(jīng)過(guò)認(rèn)證的濃度一致,且包含不同數(shù)量級(jí),進(jìn)一步證明了該方法的準(zhǔn)確性。

表 3 8種OH-PAHs在尿樣中的加標(biāo)回收率和日內(nèi)、日間精密度(n=6)

表 4 SRM3672平均測(cè)定含量與認(rèn)證含量(n=6)

NIST: National Institute of Standards and Technology.

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)某地區(qū)330份實(shí)際人群尿樣進(jìn)行檢測(cè),以了解該地區(qū)人群PAHs暴露水平。受試者被告知研究目的并簽署知情同意書。結(jié)果顯示,1-OHN、2-OHF、3-OHF、1-OHP、2-OHP和1-OHPyr的檢出率為100%, 3-OHC和6-OHC未檢出。1-OHN的檢出范圍為0.237～12.4 μg/L，2-OHF為0.021～4.0 μg/L，3-OHF為0.010～1.4 μg/L，1-OHP為0.025～4.6 μg/L，2-OHP為0.020～0.85 μg/L和1-OHPyr為0.010～1.4 μg/L。

3 結(jié)論

本文建立了液液萃取-高分辨氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜測(cè)定人體尿樣中8種OH-PAHs的分析方法。本方法前處理成本低,選擇性好,靈敏度高,結(jié)果可靠,對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較低的PAHs代謝物的分析有明顯優(yōu)勢(shì),在人群生物監(jiān)測(cè)工作中有很好的應(yīng)用價(jià)值。