付 慧,陸一夫,胡小鍵,張 續(xù),楊艷偉,朱 英

(中國疾病預防控制中心環(huán)境與健康相關產(chǎn)品安全所, 北京 100021)

多環(huán)芳烴(PAHs)來源于各種礦物燃料(如煤、石油、天然氣等)及有機物的熱解或不完全燃燒,在空氣、水、土壤等各種環(huán)境介質(zhì)中廣泛存在[1]。尤其是現(xiàn)代工業(yè)的興起,飛機、汽車等各種機動車輛日益增加及其他人為排放,導致PAHs的污染日益嚴重。人們在日常生活中,通過呼吸、飲食、飲水,甚至皮膚接觸均會不同程度地暴露于PAHs[2-5]。研究表明,PAHs暴露可損害動物中樞神經(jīng),破壞淋巴細胞微核率,肝臟功能和DNA修復能力,是具有“三致”毒性的化學物質(zhì)。此外,PAHs還具有內(nèi)分泌干擾效應,可影響生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)功能,并導致遺傳損害[1]。PAHs被認為是數(shù)量最多、分布最廣、與人類關系最密切、對人體健康威脅最大的環(huán)境致癌物之一,多環(huán)芳烴的人群暴露問題已逐漸成為日益重視的課題。

進入體內(nèi)的PAHs在肝臟中分兩步轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)單羥基多環(huán)芳烴(OH-PAHs),隨后經(jīng)尿液或糞便排出體外[6]。由于PAHs在體內(nèi)代謝期較短,且尿液最易獲得和保存,人體尿液中OH-PAHs的分析被用作評估人類接觸PAHs最常用的方法。聯(lián)合多個PAHs代謝物作為生物標志物,能更全面評估人體PAHs暴露水平。因此,建立快速靈敏、準確穩(wěn)定的同時測定尿液中多種OH-PAHs的方法對于PAHs的暴露評價具有重要意義。

目前,測定尿中OH-PAHs常用的方法有氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[7-10]、高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)[11-13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[14-17]。國內(nèi)研究者測定尿中OH-PAHs多采用LC-MS/MS,國外研究者多采用GC-MS/MS。本實驗室前期也利用LC-MS/MS建立了尿中12種OH-PAHs的測定方法,但基質(zhì)效應會影響測定結(jié)果的準確性。采用氣相色譜作為分離系統(tǒng),雖較液相色譜多了衍生化步驟,但其具有較低的基質(zhì)效應和穩(wěn)定的色譜保留時間,適合復雜基質(zhì)的超痕量分析。串聯(lián)質(zhì)譜雖具有較好的選擇性和靈敏度,但其分辨率不夠高,對相對分子質(zhì)量較高的離子有質(zhì)量歧視效應[18];高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜具有高質(zhì)量分辨率和高質(zhì)量精度(質(zhì)量偏差通常≤10-6),能為復雜樣品基質(zhì)中痕量物質(zhì)的精準檢測提供有力的技術保障[19,20]。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Autospec Premier高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜儀(EI源,美國Waters Micromass公司), 7890A氣相色譜儀(美國Agilent公司), T-214電子天平(精度0.1 mg,美國Denver公司), LW-20水浴搖床(美國LabTech公司), EFCG11848氮吹儀(美國Organomation公司), GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠), 600C離心機(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)。

正戊烷(GC級,德國Merck公司),甲苯(HPLC級,美國Tedia公司),十二烷(純度99%,比利時Acros公司),抗壞血酸(德國CNW公司),N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA,純度≥98.5%,美國Sigma-Aldrich公司),β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶混合酶(β-葡萄糖苷酸酶30 U/mL、硫酸芳酯酶60 U/mL)、超純水(德國Merck公司),標準參考物質(zhì)SRM3672(美國NIST標準物質(zhì))。

1.2 標準溶液配制

準確稱取一定量的1-OHN標準品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度約為2 mg/mL的單標儲備液。各取一定體積的1-OHN單標儲備液和7種化合物的混合標準溶液,用甲苯溶解并定容至10 mL,配制成1-OHN質(zhì)量濃度為5.0 mg/L、其他各組分質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的混合標準中間液。用甲苯逐級稀釋配制得混合標準使用液。

稱取一定量的內(nèi)標標準品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度約為2 mg/mL的單標儲備液。量取一定體積的8種單標儲備液，混合,用甲苯配制成各組分質(zhì)量濃度均為5 mg/L的混合標準中間液;用甲苯逐級稀釋得到質(zhì)量濃度為200 μg/L的混合內(nèi)標使用液。

回收標準溶液(RSS):用甲苯稀釋13C-PCB105壬烷溶液至質(zhì)量濃度為100 ng/mL,用棕色瓶分裝,于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗方法

1.3.1樣品前處理

將冰凍尿樣置于室溫,移取2 mL尿樣,置于12 mL玻璃離心管中,分別加入1 mL醋酸鈉溶液(1 mol/L, pH=5.5)、20 μL抗壞血酸溶液(250 mg/mL)、50 μLβ-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶和20 μL 200 μg/L的混合內(nèi)標使用液,混勻,于37 ℃水浴條件下避光水解約17 h,得水解液。

水解液中加入2 mL去離子水和5 mL甲苯-戊烷(1∶4, v/v)萃取劑,振搖30次,以3 600 r/min離心8 min,收集上層有機相;加入5 mL萃取劑,重復萃取,合并兩次萃取液。萃取液中加入1 mL 1 mol/L硝酸銀溶液,振搖30次,以3 600 r/min離心8 min,將上層有機相轉(zhuǎn)移至氮吹試管中,加入20 μL十二烷,于40 ℃、5 Pa氮吹20 min,使戊烷揮發(fā);升溫至70 ℃,使甲苯揮發(fā)至近干。向氮吹試管中加入20 μL甲苯復溶,轉(zhuǎn)移至已加入20 μL RSS和100 μL衍生化試劑MSTFA的棕色進樣小瓶中,混勻,于60 ℃烘箱中衍生50 min,待測。

1.3.2色譜條件

色譜柱:DB-5MS氣相色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣方式:不分流進樣(使用填充玻璃棉的超惰性內(nèi)襯管,最大限度減少柱污染);進樣口溫度:270 ℃;傳輸管溫度:270 ℃;升溫程序:初始溫度95 ℃,保持2 min,以15 ℃/min升溫至160 ℃,再以5 ℃/min升溫至205 ℃,保持6 min,然后以10 ℃/min升溫至225 ℃,再以29 ℃/min升溫至310 ℃,保持6 min;載氣:高純氦氣,恒定流量1.0 mL/min;進樣量:1.0 μL。

1.3.3質(zhì)譜條件

離子源:EI源;離子源溫度:260 ℃;單離子接收檢測(voltage SIR);電子能量:35 eV;捕集電流:650 μA;光電倍增電壓:350 V;分辨率:10 000。8種OH-PAHs及其同位素內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.4 質(zhì)量控制

羥基多環(huán)芳烴屬于光敏性物質(zhì),實驗區(qū)域應使用防紫外線的熒光燈,以減少其陽光暴露。每批樣品檢測應附帶質(zhì)控樣品、空白樣品,以保證方法的準確性并及時監(jiān)控空白污染。隨機抽取未知樣品總數(shù)的10%進行重復測定,以保證方法的精密度,重復測定樣品的相對偏差不應超過30%。目標物相對于內(nèi)標的相對保留時間比不能偏離校準標準的0.15%以上,每批樣品RSS的相對標準偏差不大于10%。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

實驗通過梯度升溫程序,使不同組分得到了較好分離,且峰形尖銳、對稱。在自動取樣器取樣前、后增設多次洗針程序,以消除連續(xù)取樣過程引起的目標物殘留。8種OH-PAHs和8種相應同位素內(nèi)標的色譜圖見圖1。

2.2 酶及其用量的選擇

根據(jù)前期經(jīng)驗[14]及文獻報道[21,22],比較了單一β-葡萄糖苷酸酶、β-葡萄糖苷酸酶/硫酸酯酶混合酶、固體β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶混合酶、液體β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶混合酶共4類酶對SRM3672質(zhì)控樣品的酶解效果。結(jié)果表明,使用固體和液體β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶混合酶的測定結(jié)果較理想。其中,固體酶在使用時需要超聲溶解,容易出現(xiàn)溶解不充分的現(xiàn)象,而液體酶使用方便。故本研究最終選用液體β-葡萄糖苷酸酶/硫酸芳酯酶混合酶進行酶解。

表 1 8種OH-PAHs及其同位素內(nèi)標的保留時間和質(zhì)譜參數(shù)

圖 1 8種OH-PAHs及其同位素內(nèi)標的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the eight OH-PAHs and their isotope internal standardsMSTFA: N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide.

在2 mL實際尿樣中加入不同體積的液體混合酶,通過考察目標物的響應值,確定酶的最佳使用量。最終確定2 mL尿樣中需加入50 μL液體混合酶。

2.3 衍生化試劑用量的選擇

衍生化是高分辨氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜分析OH-PAHs的一個重要環(huán)節(jié)。實驗在高濃度標準溶液中加入不同體積的衍生化試劑MSTFA,通過考察目標物的響應值,確定MSTFA的合理使用量(見圖2)。在20 μL混合標準溶液(1-OHN 4 mg/L,其他組分0.8 mg/L)中,分別加入10、20、40、80、100和120 μL的MSTFA,隨著MSTFA用量的增加,目標物的響應值逐漸增大,當用量達到100 μL時,響應趨于穩(wěn)定,且色譜圖中出現(xiàn)MSTFA的色譜峰(保留時間9.55 min,m/z223.141 0),說明MSTFA過量,反應完全。最終確定MSTFA的加入量為100 μL。

圖 2 不同衍生化試劑用量對目標化合物響應值的影響Fig. 2 Effect of different amount of derivatization reagents on the response values of the target compounds

表 2 8種OH-PAHs的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限和定量限

y: peak area ratio of quantitative ion of the analyte to IS;x: mass concentration ratio of the analyte to IS.

2.4 方法學考察

2.4.1線性范圍和檢出限

以甲苯為溶劑,配制質(zhì)量濃度分別為0.83、4.17、8.33、41.7、83.3、417和833 μg/L(1-OHN的質(zhì)量濃度為上述質(zhì)量濃度的5倍),內(nèi)標質(zhì)量濃度為33.3 μg/L的系列單標標準溶液(折算到人尿中的質(zhì)量濃度分別為0.008、0.042、0.083、0.417、0.833、4.17和8.33 μg/L, 1-OHN的濃度為其的5倍)。各取20 μL上述單標標準溶液,轉(zhuǎn)移至已加入20 μL RSS和100 μL MSTFA的棕色進樣小瓶中,混勻,于60 ℃烘箱中衍生50 min后測定。對目標物與相應內(nèi)標離子峰的峰面積之比(y)和目標物與相應內(nèi)標質(zhì)量濃度之比(x)進行線性回歸分析,繪制校準曲線,得到8種目標化合物的線性方程和相關系數(shù)(r)。結(jié)果顯示,8種OH-PAHs的線性關系良好,r均>0.99(見表2)。參照美國環(huán)保署(US EPA)檢出限測定程序文件第2版[23],分別采用兩種方法(第一種考慮方法空白,計算6個月內(nèi)運行的方法空白平均值加3倍標準偏差;第二種考慮儀器靈敏度,計算3倍信噪比)考察檢出限,并取其高值作為方法的檢出限,再以3.3倍檢出限作為定量限。

考慮到樣品經(jīng)前處理后濃縮100倍,本方法對人尿中8種OH-PAHs的方法檢出限為0.006～0.042 μg/L,定量限為0.020～0.140 μg/L,結(jié)果見表2。

2.4.2加標回收率和相對標準偏差

以實際尿樣進行高、中、低3個水平的8種OH-PAHs的加標回收試驗,加標水平分別為0.125、1.25和6.25 μg/L,每個水平進行6次平行試驗,計算加標回收率。8種OH-PAHs的平均回收率為81.4%～127.0%。在同一天及不同天對實際尿液樣品進行分析測定(n=6),以確定方法的日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果表明,8種OH-PAHs的日內(nèi)和日間精密度分別為2.7%～6.9%和5.1%～10.9%(見表3)。

2.4.3準確性驗證

通過美國NIST標準參考物質(zhì)SRM3672進一步評價該方法的準確性。用該方法對SRM3672進行檢測,并與其認證的6種物質(zhì)的濃度進行比較。OH-PAHs的認證濃度來自SRM3672的分析證書,并將分析證書中的含量(μg/kg)通過尿密度(1.019 g/mL)轉(zhuǎn)換成質(zhì)量濃度(μg/L)。如表4所示,該方法對OH-PAHs的檢測結(jié)果與經(jīng)過認證的濃度一致,且包含不同數(shù)量級,進一步證明了該方法的準確性。

表 3 8種OH-PAHs在尿樣中的加標回收率和日內(nèi)、日間精密度(n=6)

表 4 SRM3672平均測定含量與認證含量(n=6)

NIST: National Institute of Standards and Technology.

2.5 實際樣品測定

對某地區(qū)330份實際人群尿樣進行檢測,以了解該地區(qū)人群PAHs暴露水平。受試者被告知研究目的并簽署知情同意書。結(jié)果顯示,1-OHN、2-OHF、3-OHF、1-OHP、2-OHP和1-OHPyr的檢出率為100%, 3-OHC和6-OHC未檢出。1-OHN的檢出范圍為0.237～12.4 μg/L，2-OHF為0.021～4.0 μg/L，3-OHF為0.010～1.4 μg/L，1-OHP為0.025～4.6 μg/L，2-OHP為0.020～0.85 μg/L和1-OHPyr為0.010～1.4 μg/L。

3 結(jié)論

本文建立了液液萃取-高分辨氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質(zhì)譜測定人體尿樣中8種OH-PAHs的分析方法。本方法前處理成本低,選擇性好,靈敏度高,結(jié)果可靠,對于相對分子質(zhì)量較低的PAHs代謝物的分析有明顯優(yōu)勢,在人群生物監(jiān)測工作中有很好的應用價值。