宋 宇,王 鵬,韋月平

(遼東學(xué)院,遼寧丹東 118003)

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，它們在有機物分解轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分循環(huán)、土壤結(jié)構(gòu)變化和地球化學(xué)循環(huán)方面起著非常重要的作用[1-2]。微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性是微生物生態(tài)學(xué)中的重點研究內(nèi)容。研究顯示土壤微生物群落結(jié)構(gòu)易受到土壤類型、田間管理方式和土壤理化性質(zhì)指標等多方面影響[3-4]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究最初采用的是傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法,只能培養(yǎng)土壤中約0.3%的微生物[5]。變形梯度凝膠電泳和基因芯片等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展也難以更好地深入研究環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性[6]。廣泛使用的Miseq平臺Illumina第二代高通量測序技術(shù)因具有成本低、測序通量高、靈敏度高、定量準確等特點為土壤多樣性的研究提供了重要支撐[7-9]。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通過使用化肥農(nóng)藥來減少病蟲害和增加糧食產(chǎn)量。但研究發(fā)現(xiàn)長期使用化肥農(nóng)藥會造成土壤肥力下降、環(huán)境污染和藥物殘留等一系列問題[10-11]。21世紀以來，人們通過在稻田中引入養(yǎng)殖生物進行稻田復(fù)合種養(yǎng)取得了良好的效果，既改善了農(nóng)田生態(tài)環(huán)境又滿足了人們對綠色安全稻米的需求，因此應(yīng)用范圍不斷擴大。當前對稻田養(yǎng)殖模式的研究主要集中在土壤理化指標、病蟲草害的控制、水稻增產(chǎn)及溫室氣體排放等方面[12-14]，對稻田養(yǎng)殖系統(tǒng)中土壤微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)研究較少。

稻田在引入相應(yīng)的養(yǎng)殖生物后可以有效地改善土壤養(yǎng)分、減少病蟲害并能促進稻田增產(chǎn)。在稻田和小龍蝦共作生態(tài)系統(tǒng)中，水稻為小龍蝦提供庇護場所、適當?shù)乃疁?、氧氣及食物，小龍蝦通過取食稻田中的蟲子和雜草減輕稻田的蟲、草害，減少了除草劑和殺蟲劑等農(nóng)藥的使用[15]。在稻田養(yǎng)蟹生態(tài)系統(tǒng)中，由于河蟹的存在，河蟹的爬行、覓食和其他活動翻動土壤，增加土壤的透氣性，促進土壤的理化性質(zhì)發(fā)生非常顯著的變化進而促進水稻的生長，促使養(yǎng)蟹稻田增產(chǎn)增效[16]；稻田放養(yǎng)一定密度的河蟹可以有效控制絲狀藻類的生長，達到生物防治絲狀藻類的目的[17]。然而目前國內(nèi)針對稻蝦、稻蟹共生系統(tǒng)中養(yǎng)殖生物對稻田微生物影響的研究較少。本研究擬采用高通量測序技術(shù)對河蟹共作稻田、龍蝦共作稻田和稻田單作3種模式下表層土壤細菌群落的多樣性特征進行分析。探討不同種養(yǎng)模式的水稻表層土壤微生物在不同分類水平上的優(yōu)勢類群及其相對豐度，土壤細菌與土壤理化指標的關(guān)系，為稻田復(fù)合種養(yǎng)工藝的改進和合理利用稻田土壤資源提供有利依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗田位于丹東東港市北井子鎮(zhèn)蓋家壩農(nóng)場,供試稻田分別為河蟹共作稻田(SDHXZ)、龍蝦共作稻田(SDLXZ)和單作稻田(SDKBZ)3種模式，前兩個是在稻田中施入生物有機肥的同時引入河蟹和龍蝦，單作稻田則只施加生物有機肥。

1.2 土壤樣品采集和處理

在水稻結(jié)穗期分別在3種模式的稻田上隨機選取5個點，采集0～5 cm土層土壤后將5點采集的土樣混合為1個樣品，每個樣品重復(fù)3次，樣品編號分別為SDKBZ1、SDKBZ2、SDKBZ3、SDHXZ1、SDHXZ2、SDHXZ3、SDLXZ1、SDLXZ2、SDLXZ3，鮮土去除雜質(zhì)后混勻裝入50 mL離心管中，在-80 ℃冷凍保存，用于微生物多樣性分析。

1.3 土壤理化指標的測定

按“1.2”中的方法，取土樣進行土壤理化指標的測定。

土壤pH采用pH儀測定，根據(jù)參考文獻[18]方法，氨氮和硝氮測定采用氯化鉀浸提-分光光度法；速效磷測定采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀測定采用氯化鈣浸提-火焰光度計法；有機質(zhì)測定采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法。

1.4 土壤微生物總DNA提取

利用E.Z.N.A.SoilDNA試劑盒(OmegaBio-tek,Norcross,GA,U.S.)從 9 個土壤樣本中提取基因組DNA，對16S rRNA基因的V3-V4區(qū)進行PCR擴增，每個樣本 重復(fù)3次。通用引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGGAGCA-3′)和806R(5′-GGACTCHVGGGTWTCTAA T-3′)。

1.5 PCR擴增與高通量測序

PCR擴增程序為:95 ℃預(yù)變性120 s；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，持續(xù)25個循環(huán)周期；最后72 ℃延伸5 min。PCR結(jié)束后，對PCR產(chǎn)物進行檢測回收，再借助QuantiFluor-ST熒光定量系統(tǒng)對回收的DNA進行精準定量。最后按照測序要求，利用Illumina PE300平臺對相應(yīng)比例混合后的DNA進行上機測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Statistics 10.0進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-Sanger 云平臺完成Alpha多樣性的Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)和Simpson指數(shù)的分析及Beta多樣性分析，冗余分析(RDA)環(huán)境因子關(guān)聯(lián)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種模式下稻田土壤理化指標的變化

由表1可知，不同模式下稻田土壤理化性質(zhì)變化較大。與水稻單作組比較，河蟹共作稻田和龍蝦共作稻田的pH均下降且差異顯著，河蟹稻田的氨氮、硝氮、速效磷和有機質(zhì)質(zhì)量分數(shù)均顯著提高，速效鉀質(zhì)量分數(shù)降低但差異不顯著，龍蝦稻田的氨氮值提升最為顯著，但其他值和前兩者比都明顯降低。

2.2 樣品測序結(jié)果

由表2可知，SDKBZ、SDHXZ和SDLXZ的9個樣品土壤細菌V3-V4區(qū)測序獲得的平均序列數(shù)分別為45 282.00、48 451.00和52 820.33。經(jīng)過去除相應(yīng)的引物、模糊的堿基和帶有嵌合體的序列后，最終得到的平均有效序列數(shù)分別為 28 895.67、 26 782.67和30 306.00，平均片段長度為438 bp。通過聚類操作，對97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析，9個樣品共產(chǎn)生2 898個OTU，平均OTU數(shù)分別為1 837、1 884和 1 972。可將細菌類群分為46門、112綱、210目、370科、664屬、1 227種。覆蓋度都達到99%，說明各樣品的取樣均達到一定深度，能反映各樣品土壤細菌群落的真實情況。

表1 3種模式下稻田土壤理化性質(zhì)Table 1 Physiochemical properties of rice field soil in three cultivation patterns

注:不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters mean that there are significant differences between treatments(P<0.05).

2.3 細菌群落多樣性

2.3.1 Alpha多樣性 Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，常用的度量標準有Chao 1、Shannon、 Ace、Simpson指數(shù)等。Chao 1指數(shù)和Ace指數(shù)都是用來計算菌群豐度的指數(shù)，二者值越高，代表菌群的豐度值越大，菌群的物種總數(shù)越多。Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)是計算菌群多樣性的指數(shù)，Simpson指數(shù)越低說明群落多樣性越高，Shannon值越大，說明群落多樣性越高。由表3可知，SDHXZ的Ace指數(shù)、Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)均高于SDLXZ和SDKBZ，而Simpson指數(shù)則是低于SDLXZ和SDKBZ，這說明河蟹的引入提高了土壤微生物群落的豐富度和多樣性。

表2 3種模式下稻田表層土壤高通量測序結(jié)果Table 2 Result of high throughput sequencing of surface soils in three cultivation patterns

表3 3種模式下稻田土壤細菌群落多樣性指數(shù)Table 3 Bacterial diversity index of rice field soil in three cultivation patterns

2.3.2 Beta多樣性 圖1是對3種模式下稻田土壤中OTU的組成進行主成分分析。由圖1可以看出，SDKBZ的3個樣品聚在一起具有很好的重復(fù)性。兩種共作稻田與單作稻田的距離較遠，說明龍蝦和河蟹引入后稻田土壤OTU組成差異較大，細菌群落結(jié)構(gòu)也有較大差異。

圖1 3種模式下稻田土壤主成分分析Fig.1 Principle component analysis of rice field in three cultivation patterns

2.4 優(yōu)勢菌門分析

由門水平的細菌分類(圖2)可知，相對豐度較高的分別為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和藍藻菌門(Cyanobacteria)。變形菌門為所有樣品中相對豐度最高的門。在SDHXZ、SDLXZ和SDKBZ中分別達到36.73%、41.82%和 33.42%。這與羅衡等[19]的研究結(jié)果相近，但較之前的研究[20-22]則更高。其次為擬桿菌門，其相對豐度在3組樣品中分別達到15.63%、14.3%和 12.12%。對樣品中優(yōu)勢菌門的相對豐度進行對比可以看出各類菌群在不同樣品中的相對豐度存在一定差異，引入河蟹和龍蝦后，稻田表層土壤的變形菌門、擬桿菌門、單糖菌門(Saccharibacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度都得到提升。河蟹稻田的綠彎菌門相對豐度得到提升為13.64%，而龍蝦稻田則減少為9.42%，龍蝦稻田的放線菌門的相對豐度為11.8%，較稻田單作組(8.23%)顯著升高，而河蟹稻田的則減少為 6.87%。河蟹和龍蝦稻田的酸桿菌門、藍藻菌門、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)則低于稻田單作組。

2.5 優(yōu)勢菌屬分析

由屬分類水平上的細菌分類(圖3)可知，平均豐度低于0.01%的物種將被合并為圖中的others。共有21個屬因在分類學(xué)數(shù)據(jù)庫分類學(xué)譜系的中間等級，沒有科學(xué)名稱，所以用norank作為標記。藍藻屬(norank_cCyarbacteria)為土壤平均相對豐度最高的屬，其在SDKBZ中為 6.31%，SDHXZ中為3.24%,SDLXZ中為 5.25%。研究證實藍藻是稻田生態(tài)系統(tǒng)中的一種主要微生物類群，可參與全球生物圈碳、氮等物質(zhì)循環(huán)[23]。優(yōu)勢屬中硫曲菌屬(Sulfuricurvum)屬于能自養(yǎng)的兼性硫氧化菌，它能以氧氣或硝酸鹽作為電子受體而氧化硫化物[24]。硫曲菌屬的相對豐度則在SDHXZ和SDLXZ中高于SDKBZ,其平均豐度分別為2.0%、3.5%和0.8%,SDLXZ和SDKBZ差異顯著。單糖菌屬(norank_p_Saccharibacteria)在SDHXZ和SDLXZ中的相對豐度也高于SDKBZ但差異不顯著。而擬桿菌VadinHA17屬(norank_c_Bacteroidetes_VadinHA 17)則在SDHXZ中相對豐度最高為4.74%，與SDKBZ(1.85%)差異顯著,SDLXZ的相對豐度為 2.06%，雖高于SDKBZ但差別不大。優(yōu)勢屬分析可以看出，稻田由于河蟹、龍蝦的引入菌屬結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化。

相對豐度低于0.01%的物種歸于“其他”組內(nèi)，圖3同 Sequences whose relative abundance was lower than 0.01% were assigned as “others”，the same with fig.3

圖2 3種模式下稻田土壤微生物在門水平上的豐度變化
Fig.2 Changes in relative abundance of microorganisms at phyla level of rice field of three cultivation patterns

圖3 3種模式下稻田土壤微生物在屬水平上的豐度變化Fig.3 Changes in relative abundance of microorganisms at genera level of rice field soil in three cultivation patterns

2.6 主要菌屬與土壤理化因子的關(guān)系

為了解主要菌屬與土壤環(huán)境因子的變化關(guān)系，應(yīng)用冗余分析對6類主要菌屬與土壤理化因子進行分析，結(jié)果表明，前2個排序軸的特征值分別為0.351和0.164。pH(-0.801 4)、OM (0.167 0)、NN(0.243 6)和AP(0.672 8)主要貢獻于第一排序軸，AK(0.999)和ON(-0.998 9)主要貢獻于第二排序軸，兩軸中菌屬與環(huán)境因子的累計百分比為51.53%(圖4)。結(jié)果顯示土壤中氨態(tài)氮的含量是主要菌屬的第一影響因子。其余依次為AK(速效鉀)、OM(有機質(zhì))、pH(酸堿度)、NN(硝態(tài)氮)、AP(速效磷)。圖中藍藻屬(norank_c_Cyanobacteria)與pH和AN呈正相關(guān),與OM、NN和AP呈負相關(guān)。硫曲菌屬(Sulfuricurvum)與AN呈正相關(guān),與PH、AK、OM、NN呈負相關(guān)。norank_o_SC-1-84與PH、AK、OM呈正相關(guān)而與AP和AN呈負相關(guān)。厭氧繩菌屬(norank_f_Anaerolineareae)與AP、AK、OM和NN呈正相關(guān)擬桿菌屬VadinHA17(norank_c_Bacteroidetes_VadinHA17)則與AP、AK、OM、NN呈正相關(guān)。單糖菌屬(norank_p_Saccharibacteria)則與pH、AN呈負相關(guān)。

AN.氨態(tài)氮 Ammoniacal nitrogen;NN.硝態(tài)氮 Nitrate nitrogen；AK.速效鉀 Available potassium；AP.速效磷 Available phosphorus；OM.有機質(zhì) Organic matter；1.藍藻菌屬norank_c_Cyanobacteria;2.厭氧繩菌屬norank_f_Anaerdineareae;3.單糖菌屬norank_p_Saccharibacteria;4.擬桿菌VadinHA17屬norank_c_Bacteroideters_VadinHA17;5.未知名屬norank_o_SC_1-84;6.硫曲菌屬Sulfuricurvum

圖4 土壤理化性質(zhì)與微生物群落(屬水平) 的冗余分析
Fig.4 Redundancy analysis to explore relationship between microorganism community(genus) and physiochemical characteristics of rice field soil in three cultivation patterns

3 討 論

稻田土壤微生物是稻田土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，有研究發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物可通過攝食排泄等活動有效地改善土壤的透氣性和土壤細菌的營養(yǎng)條件，進而提高了土壤微生物的多樣性和活性[25-26]。本研究表明，由于河蟹和龍蝦的糞便及排泄作用,使得共作稻田中的pH、氨氮、硝氮、速效磷和有機質(zhì)的含量都發(fā)生一定變化，養(yǎng)分的增加為土壤微生物的生長提供了充足的營養(yǎng)，此外，河蟹和龍蝦的活動改變了稻田表層土壤的氧氣條件，這些都對河蟹和龍蝦與稻田的共生系統(tǒng)土壤微生物組成產(chǎn)生影響。

本研究采用高通量測序技術(shù)分析不同稻田共作模式對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。從檢測結(jié)果來看，各樣本共檢測到細菌類群46門、112綱、210目、370科、664屬、1 227種。在門的分類水平上變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、放線菌門和酸桿菌門為5個優(yōu)勢菌門。各樣品均以變形菌門為最優(yōu)勢菌門。兩種共作稻田的變形菌門相對豐度均優(yōu)于稻田單作模式。研究證實，營養(yǎng)豐富的環(huán)境適合該菌門的快速生長[27]。說明隨河蟹、龍蝦的排泄物的排放，土壤養(yǎng)分更充足。變形菌大多為革蘭氏陰性菌，其中許多細菌負責(zé)固氮，可增加土壤中的氮素營養(yǎng)，促進植物的生長。在主要優(yōu)勢屬中，平均相對豐度最高的屬是藍藻屬，它能進行光合作用并能固氮，在土壤肥力的維持和改良方面發(fā)揮重要作用[28]。研究表明稻田的C/N和pH是影響藍藻豐度的主要因子[23]。在本研究的稻蝦和稻蟹共生系統(tǒng)中，由于它們的糞便、殘餌和排泄作用，使得稻田中土壤的氮含量增加，在為微生物生長提供充足養(yǎng)料的同時，也會造成 C/N下降，因此造成兩種共作稻田的藍藻屬的平均相對豐度低于單作稻田。因為本研究的環(huán)境因子未有C/N，所以從冗余分析圖中可以看出藍藻屬的平均相對豐度主要受限于pH。在主要的優(yōu)勢菌屬中，比較3種模式下的表層土壤微生物，具有顯著差異的有兩類，分別是硫曲菌屬和擬桿菌VadinHA17屬。硫曲菌屬屬于一種硫氧化菌，通過氧化單質(zhì)硫或還原性硫化物產(chǎn)生能量或者參與光合作用[29]。硫曲菌屬平均相對豐度則在SDHXZ和SDLXZ中均高于SDKBZ，這表明河蟹和龍蝦的引入使稻田土壤富集了具有高效硫氧化功能的菌群，有效地促進了兩種共作稻田種養(yǎng)過程中的硫循環(huán)。在SDLXZ中豐度更大因而和SDKBZ差異顯著。從冗余分析圖中可以看出硫曲菌屬與氨氮值呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌VadinHA17具有降解糖類及一種分布廣泛的難降解的有毒有機物多環(huán)芳烴的能力[30]，其平均相對豐度在SDHXZ和SDLXZ中均高于SDKBZ，其中SDHXZ與SDKBZ差異顯著。說明河蟹和龍蝦的引入能促進稻田中該菌屬的生長，更能促進碳循環(huán)。

研究證實生物多樣性越高生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)定[31]。本研究結(jié)果顯示，河蟹稻田的Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于稻田單作組。這說明河蟹引入后微生物多樣性和豐富度均隨著土壤理化指標的改善而進一步提升，因而擁有比稻田單作模式更穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)。

4 結(jié) 論

在稻田中施加有機肥的同時引入河蟹和龍蝦會改變土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)，尤其是河蟹的引入會增加稻田土壤細菌群落多樣性，使菌群物種更加豐富，進一步擴大優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬的相對豐度，群落結(jié)構(gòu)和單作稻田有一定差異性，土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，該研究可為稻田復(fù)合種養(yǎng)工藝的改進和合理利用稻田土壤資源提供有利 依據(jù)。