於紫蕾，卻志群，沈春修

(宜春學院 生命科學與資源環(huán)境學院，江西省作物生長發(fā)育調控重點實驗室，江西宜春 336000)

各種各樣的環(huán)境脅迫都會嚴重影響作物的生長及其產量，在這些非生物脅迫條件中，由低溫脅迫引起的冷害又是影響各種作物分布和生產的最重要脅迫類型之一，在低溫脅迫條件下，植物的基因表達、生物膜脂質組成、光合效率都將發(fā)生變化，另外植物細胞中還會產生一些對細胞有毒害作用的小分子和自由基[1-4]。水稻是一種喜陽植物，對寒冷天氣尤為敏感，特別是在苗期，水稻苗期遭受低溫冷害后經常引起秧苗失綠、發(fā)僵以及分蘗數減少，嚴重時甚至引起水稻幼苗全株枯萎乃至死亡[5-6]。所以如何提高水稻抗寒性已經成為全國水稻科研工作者非常關注的一個問題，而提高水稻抗寒能力最有效的方法就是挖掘和利用水稻自身耐寒基因。

水稻的抗寒性屬于多基因控制的數量性狀，多個抗寒基因的協同作用才能提高其抗寒性，所以向水稻細胞內導入單個功能性蛋白基因，往往難以達到提高其抗寒性目的?？购δ苄缘鞍谆虻膯幼由铣：邢嗤霓D錄因子調控元件，一個轉錄因子的超表達往往會激活多個抗寒功能性蛋白基因的表達，從而提高水稻的抗寒性[7-8]。因此，轉錄因子在未來水稻的抗寒育種中有著廣闊的應用前景，從目前已克隆的水稻轉錄因子類耐冷基因的供體來源來看，這些基因大多來自粳稻，鮮有來源于野生稻資源的報道。野生稻未經過人工馴化，長年需要在惡劣的自然條件下經歷越冬，所以攜帶了許多優(yōu)良的耐冷基因，野生稻中的這些優(yōu)良耐冷基因是培育耐冷栽培稻新品種的珍貴資源，東鄉(xiāng)野生稻是目前已發(fā)現的耐冷性極強的野生稻資源之一，該水稻自發(fā)現至今30多年以來，其超強的耐冷性引起了廣大水稻科研工作者的廣泛關注。

筆者前期通過對正常生長條件和冷脅迫條件(4 ℃處理3 d)下的4個水稻材料(包括東鄉(xiāng)野生稻，茶陵野生稻，東鄉(xiāng)野生稻與‘93-11’雜交后的F2越冬混合群體3個冷耐材料，以及冷敏感材料93-11)苗期的轉錄組測序數據(RNA sequence，RNA-seq)進行比較分析，鑒定到了冷處理后在冷敏感材料中無差異表達而在3個冷耐材料中出現差異表達的318個水稻耐冷相關基因(數據公布于http://link.springer.com/article/10.1007/s12374-014-0183-1)[9]。這些在不同耐冷野生稻中都表現出差異表達的基因，不僅驗證了其表達水平的可靠性，還表明這些基因在耐冷野生稻中的功能可能是保守的。它們可能在冷脅迫過程中起重要作用。

本研究正是基于以上前期研究成果，結合基因蛋白功能和基因本體(Gene Ontology，GO)注釋信息，從轉錄組比較分析鑒定到的318個水稻耐冷相關基因中篩選出可能與冷耐調控直接相關的上調表達MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog, MYB)轉錄因子基因LOC_Os01g62410(并將東鄉(xiāng)野生稻中的該基因位點暫定名LOC_Os01g62410-DX)，以東鄉(xiāng)野生稻作為實驗材料，運用實時熒光定量PCR(quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR)技術分析該基因位點的在低溫處理條件下的表達量差異，并通過RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)方法從東鄉(xiāng)野生稻中克隆該基因位點的全長cDNA(complementary DNA，cDNA)，構建過表達載體，然后借助農桿菌介導轉化方法導入到水稻受體品種臺北309(TP309)中，獲得轉基因植株，本試驗為后續(xù)研究東鄉(xiāng)野生稻中LOC_Os01g62410-DX基因在低溫脅迫條件下的功能奠定材料基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試水稻 供試耐冷水稻材料東鄉(xiāng)野生稻，轉基因受體水稻材料TP309，均由江西省作物生長發(fā)育調控重點實驗室保存并提供。

1.1.2 供試載體 T載體pEASY-Blunt Zero Cloning Kit購自北京TransGen Biotech公司，植物表達載體pCAMBIA1301M是由江西省作物生長發(fā)育調控重點實驗室改造并提供(圖1)。

圖1 植物雙元過表達載體pCAMBIA1301MFig.1 Plant binary over-expression vector pCAMBIA1301M

1.2 試驗方法

1.2.1 提取RNA 采集鮮嫩水稻葉片組織于液氮中研磨成粉末，按照FOREGENE公司Plant Total RNA Isolation Kit試劑盒說明進行提取。

1.2.2 引物設計和獲得cDNA 所有引物均使用primer premier 5.0軟件進行設計，包括qRT-PCR試驗用內參引物Tubulin-F和 Tubulin-R，目的基因熒光定量擴增引物DL-62410-F和DL-62410-R；目的基因全長cDNA擴增引物62410-F和62410-R；T載體陽性克隆PCR鑒定引物M13-F和M13-R(表1)。引物序列委托上海Sangon Biotech公司合成，cDNA反轉錄合成按照TransGen Biotech公司TransScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明進行。

表1 引物及序列Table 1 Primers

1.2.3 實時熒光定量PCR 首先使用DL-62410-F和DL-62410-R為引物，以常溫培養(yǎng)條件下的東鄉(xiāng)野生稻葉片的cDNA為模板進行PCR，探索擴增特異性最好的退火溫度，再按照TIANGEN公司Super Real PerMix Plus(SYBR Green)試劑盒說明進行預混，于StepOne PlusTM熒光定量PCR儀中進行實時熒光定量PCR擴增，后通過ΔΔCt值的方法對初始數據進行分析，評估基因表達水平。將種子萌發(fā)后的東鄉(xiāng)野生稻在實驗室條件下(25 ℃左右)培養(yǎng)至4～5周，然后用于冷處理(于4 ℃冷藏柜中進行)，以冷處理前采集的水稻葉片樣本為對照組，4 ℃環(huán)境下冷處理24 h、48 h、72 h采集的水稻葉片樣本為試驗組。在研究過程中，以微管蛋白(Tublin)基因作為內參，設置3次生物學重復和3次技術重復。

1.2.4 T載體克隆 使用62410-F 和62410-R引物，利用RT-PCR技術擴增東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os01g62410-DX全長cDNA，連接反應按照TransGen Biotech公司pEASY-Blunt Zero Cloning Kit試劑盒說明并稍作改進后進行，反應體系5 μL： PCR Product 4.5 μL，pEASY-Blunt Zero Cloning Vector 0.5 μL，于PCR儀中22 ℃反應2 h。隨后按照Trans1-T1 Phage Chemically Competent Cell 說明書進行熱激操作。

1.2.5LOC_Os01g62410-DX基因生物信息學分析 利用NCBI中的Blast功能對LOC_Os01g62410-DX基因序列與數據庫中的日本晴對應位點序列進行比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；使用Prot-Param預測目的基因編碼蛋白質的理化性質(http://web.expasy.org/protparam/)；使用DNAMAN軟件進行氨基酸序列的多重比對分析和系統進化樹的繪制；使用功能結構域在線分析軟件SMART進行保守結構域的預測。

1.2.6 農桿菌介導的遺傳轉化及轉基因植株GUS染色 以粳稻品種TP309作為轉基因受體，利用其成熟胚誘導愈傷組織，按照農桿菌介導轉化植物細胞的方法將重組質粒導入受體細胞直至最終獲得轉基因植株，轉基因過程中各培養(yǎng)階段培養(yǎng)基配制方法及具體操作參照李丁[10]報道的方法進行，轉基因幼苗葉片GUS染色具體實驗操作過程參照沈春修等[11]報道的方法進行，GUS染色液的配制參照李莉等[12]介紹的方法進行。

2 結果與分析

2.1 LOC_Os01g62410基因位點不同冷處理時間相對表達量分析

基于前期通過RNA-seq技術獲得的轉錄組測序數據[9]，分析發(fā)現1個MYB轉錄因子基因位點LOC_Os01g62410冷脅迫處理后在東鄉(xiāng)野生稻、茶陵野生稻和OOP(東鄉(xiāng)野生稻與‘93-11’雜交后的F2越冬混合群體)都同時出現了明顯的表達水平提高(表2)。為了進一步驗證LOC_Os01g62410基因位點冷處理后在東鄉(xiāng)野生稻苗期葉片中的表達量情況，本研究以4～5周葉齡的耐冷東鄉(xiāng)野生稻和冷敏感秈稻品種93-11苗期葉片作為試驗材料，通過實時熒光定量PCR對2個水稻材料中的LOC_Os01g62410基因位點冷脅迫處理條件下的表達模式進行了分析，結果如圖2所示，在正常生長條件下(25 ℃)的東鄉(xiāng)野生稻中LOC_Os01g62410-DX表達量相對較低，冷處理24 h后表達量出現上調，約為處理前的31.8倍，冷處理48 h后該基因的表達量較冷處理24 h時有所下調，但仍比處理前表達水平高，約為處理前的8.2倍，冷處理72 h后表達量重新上調，約為處理前的25.5倍。表明LOC_Os01g62410-DX在冷處理3 d的過程中表達量呈上調-下調-上調的趨勢。而在秈稻93-11中，LOC_Os01g62410基因位點冷脅迫處理前后的表達量無顯著差異。

表2 LOC-Os01g62410基因冷處理后在耐冷水稻中的表達情況Table 2 Expression of LOC-Os01g62410 gene in cold-tolerant rice after cold treatment

注：Ratio.處理后基因表達量與處理前基因表達量的比值；OOP.東鄉(xiāng)野生稻與93-11雜交后的F2越冬混合群體。

Note:Ratio.The ratio of gene expression before and after cold treatment;OOP.The F2population derived from the cross of Dongxiang wild rice and 93-11.

2.2 LOC_Os01g62410-DX全長cDNA擴增及過表達載體構建

通過RT-PCR方法擴增LOC_Os01g62410-DX的全長cDNA，將其與pEASY-Blunt Zero Cloning T 載體相連，導入大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單菌落搖菌，使用M13F和M13R引物進行菌液PCR鑒定陽性克隆，結果如圖3所示，挑取的菌落克隆擴增出約1 500 bp大小的片段，與預期的目的片段大小相符。然后，選擇正確的陽性克隆，用KpnⅠ和SalⅠ內切酶對質粒進行雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳后回收，與同樣經KpnⅠ和SalⅠ內切酶剪切后的過表達載體pCAMBIA1301M(圖1)進行連接，限制性內切酶KpnⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定重組質粒1301M-62410-DX，結果如圖4所示，獲得1個陽性克隆，在電泳圖譜中顯示為 2條帶，大小約 14 kb 的大片段為 pCAMBIA1301M載體，大小約 1 500 bp 的小片段為目的基因LOC_Os01g62410-DX的全長cDNA。

柱形圖上方不同字母代表不同處理時間段差異顯著(P< 0.05) Different letter donate significant difference(P<0.05) between different stress treats;DX.東鄉(xiāng)野生稻 Dongxiang wild rice;93-11.水稻品系93-11 Rice line 93-11

圖2LOC_Os01g62410基因位點冷脅迫下表達分析
Fig.2 Expression analysis ofLOC_Os01g62410gene locus under cold stress

2.3 LOC_Os01g62410-DX全長cDNA測序及生物信息學分析

選擇酶切鑒定正確的陽性克隆送樣測序，測序結果表明，LOC_Os01g62410-DX全長 cDNA共1 500 bp，共編碼499個氨基酸。使用Prot-Param進行該基因編碼蛋白質的理化性質預測，表明蛋白質分子質量為55.04 ku，理論等電點(pI)為7.62。在NCBI網站中與測序水稻品種日本晴對應位點的DNA序列Blast比對分析發(fā)現，東鄉(xiāng)野生稻LOC_Os01g62410-DX基因全長cDNA與日本晴相比僅有一個堿基有所差異(第 1 085位脫氧核糖核苷酸堿基不同，日本晴中為G，而東鄉(xiāng)野生稻中為T)，而此差異也導致對應位置氨基酸的改變(第362位氨基酸不同，日本晴中為R，對應cDNA鏈堿基為CGG，而東鄉(xiāng)野生稻中為L，對應cDNA鏈堿基為CTG)。使用在線分析軟件SMART對LOC_Os01g62410-DX基因翻譯后的氨基酸序列的保守域進行分析，結果表明，LOC_Os01g62410-DX蛋白的N端均有2個高度保守功能區(qū)SANT (SWI3, ADA2, N-CoR and TFIIIB DNA-binding domains，SANT)(圖5)，分別位于30～79位和80～130位氨基酸，該保守區(qū)是MYB轉錄因子家族典型的R2R3型結構域，因此LOC_Os01g62410-DX基因屬于R2R3型MYB轉錄因子基因。進一步使用DNAMAN軟件將LOC_Os01g62410-DX編碼的氨基酸序列與國家水稻數據中心(www.ricedata.com)統計的已克隆的水稻其他R2R3型MYB轉錄因子的氨基酸序列進行多重比對，發(fā)現LOC_Os01g62410-DX編碼蛋白與OsJAMyb[13]、OsMYB2[14]、OsMYB2P-1[15]、Osmyb4P[16]和OsMYB103L[17]的編碼蛋白之間存在29.41%的氨基酸序列一致性(圖6)。

M.DL2000 bp; 1.LOC_Os01g62410-DX菌液PCR Bacterial liquid PCR ofLOC_Os01g62410-DX

圖3 T載體LOC_Os01g62410-DX菌液PCR鑒定
Fig.3 Bacterial liquid PCR detection ofLOC_Os01g62410-DX

M.Trans 15K Marker; 1.1301M-62410-DX陽性克隆 Positive clones of 1301M-62410-DX

圖4 重組質粒1301M-62410-DX酶切鑒定
Fig.4 Digestion detection of recombinant plsmid 1301M-62410-DX

圖5 LOC_Os01g62410-DX蛋白結構域的預測Fig.5 Prediction of protein domains of LOC_Os01g62410-DX gene

圖6 LOC_Os01g62410-DX與水稻其他R2R3型MYB基因氨基酸序列比對Fig.6 Alignment of amino acid sequence of LOC_Os01g62410-DX and other R2R3 type MYB gene in rice

2.4 LOC_Os01g62410-DX基因系統進化分析

為了預測LOC_Os01g62410-DX基因的功能，將從東鄉(xiāng)野生稻中克隆得到的LOC_Os01g62410-DX基因與與國家水稻數據中心(www.ricedata.com)統計的具有已知功能的19個水稻 MYB 轉錄因子基因的氨基酸序列一起利用DNAMAN軟件進行系統發(fā)育分析(圖7)，結果顯示東鄉(xiāng)野生稻中LOC_Os01g62410-DX基因與水稻Osmyb3[18]和Osmyb4[19-20]編碼的蛋白位于相鄰分支上，親緣關系最近，與水稻MYB 家族成員OsMYBc[21],MYBS3[22]和CTMYb1[23]的親緣關系最遠。

2.5 遺傳轉化及轉基因植株葉片GUS 組織化學染色鑒定

將攜帶LOC_Os01g62410-DX基因的農桿菌克隆1301M-62410-DX侵染受體水稻品種TP309的愈傷組織，共培養(yǎng)3 d，隨后接入含有50 mg/L濃度潮霉素的篩選培養(yǎng)基中，經兩輪篩選約35 d時長培養(yǎng)后將新長出的抗性愈傷接入同樣含50 mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基進行30 d左右的見光分化培養(yǎng)，而后經歷生根壯苗，GUS 組織化學染色鑒定，最后，重組質粒1301M-62410-DX轉化后共獲得了37 株陽性轉化苗(圖8)。圖 9 所示為部分轉基因幼苗的GUS染色結果，取4～5周齡的轉基因植株和野生型水稻葉片組織同時進行GUS染色，5株轉基因植株葉片均可被不同程度的染上藍色，尤其是在剪刀剪切過的切口處和葉尖部分都被染上了較深的藍色，而野生型水稻TP309的葉片則沒有任何部位被染上藍色，表明測試轉基因植株皆為成功導入了目的基因的陽性轉基因植株。

圖7 LOC_Os01g62410-DX與水稻MYB家族其他基因氨基酸序列的系統進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of the amino acid sequence of LOC_Os01g62410-DXand other MYB family genes in rice

A.愈傷組織培養(yǎng) Callus culture；B. 1301M-62410-DX農桿菌克隆與愈傷組織共培養(yǎng) Co-culture of 1301M-62410-DX agrobacterium clone and callus；C.抗性愈傷組織篩選培養(yǎng) The resistant callus culture；D.抗性愈傷組織分化培養(yǎng) Resistant callus redifferentiation；E.轉基因植株生根煉苗 Rooting and strong seedling culture of transgenic plants

圖8 過表達質粒1301M-62410-DX遺傳轉化實物圖
Fig.8 The map of overexpression plasmid 1301M-62410-DX genetic transformation process

A.野生型TP309 Wild type rice variety TP309; B,C,D,E,F.轉基因植株 Transgenic plants

圖9 轉基因植株葉片GUS 活性檢測
Fig.9 GUS activity detection of transgenic plants

3 討 論

在公共數據庫Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml) 中進行位點查詢可知，LOC_Os01g62410是一個MYB轉錄因子。MYB是植物中最大的一類轉錄因子家族，該轉錄因子家族因編碼蛋白的N端所包含的DNA結合結構域(MYB結構域)的重復數目不同而被分為三類：R1-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB[24]，植物中最主要的 MYB轉錄因子是具有2個不完全重復(R2，R3)的R2R3-MYB類型。此外，植物中也發(fā)現了具有3個重復的MYB蛋白類型，以及僅僅包含有1個MYB域的MYB蛋白類型。MYB轉錄因子在不同植物的基因組中都有大量的分布，且廣泛參與植物的次生代謝調節(jié)、細胞形態(tài)發(fā)生過程、信號傳導以及生物和非生物脅迫反應應答等生命活動，近年來，MYB轉錄因子參與逆境反應應答越來越引起科學家們的關注，甘藍型油菜BnMYB1基因對高鹽、低溫、干旱和水楊酸等逆境脅迫都有不同響應[25]；蝴蝶蘭中有152個MYB家族基因與病毒脅迫響應有關[26]；在水稻中，超量表達MYB轉錄因子OsMYB55[27]和OsMYB91[28]分別增強了水稻對高溫和鹽脅迫的耐性等研究發(fā)現也都被相繼報道。

植物基因表達受環(huán)境條件的影響時常會有不同程度的上調或下調，這種現象在植物轉錄因子基因中尤為常見[29]。轉錄組分析數據表明LOC_Os01g62410基因位點的表達量在冷脅迫處理(4 ℃處理3 d)后在耐冷水稻材料東鄉(xiāng)野生稻中出現上調，而在冷敏感水稻‘93-11’中沒有出現明顯的表達量變化，推測LOC_Os01g62410-DX基因或許并不是東鄉(xiāng)野生稻在冷脅迫條件下的一種敏感基因，而是與東鄉(xiāng)野生稻在寒冷逆境條件下的強耐冷性表現有關的耐冷相關基因。本研究進一步通過qRT-PCR技術研究發(fā)現東鄉(xiāng)野生稻中MYB轉錄因子LOC_Os01g62410-DX在冷脅迫處理3 d的時間內表達量出現不同程度的上調。尤其以冷處理24 h內該基因上調最多，等到冷處理時長達48 h時，該基因的表達量相比冷處理24 h時有明顯的降低，但依然比冷處理前要高，當冷處理時長達72 h時，相比冷處理48 h，該基因的表達量又有顯著的提升。在遭遇逆境環(huán)境脅迫時，轉錄因子往往較逆境脅迫相關的結構基因先感知到脅迫信號指令調控，當轉錄因子的表達量達到一定水平后，轉錄因子再與結構基因的啟動子區(qū)域進行結合調控其下游的結構基因的表達以抵御逆境環(huán)境。所以推測在脅迫條件處理后，當轉錄因子自身所調控的結構基因的表達被啟動后，植物細胞可能有一段暫緩的時間不需要去高表達轉錄因子。這也可能是本研究中MYB轉錄因子LOC_Os01g62410-DX在冷脅迫處理24 h基因表達量上調最高，而當冷處理時長達48 h卻出現明顯下降的原因。

另外，本研究將東鄉(xiāng)野生稻中克隆到的MYB轉錄因子LOC_Os01g62410-DX與水稻中已克隆的其他R2R3型MYB轉錄因子的氨基酸序列進行了多重比對，發(fā)現它們的N端雖然都包含有2個高度保守結構域SANT，然而它們編碼蛋白的全部氨基酸序列之間的一致性卻只有29.41%，說明水稻中的R2R3型MYB轉錄因子的序列存在較大的差異，可能存在多個進化分支。目前，水稻中尚未有關于LOC_Os01g62410基因位點功能鑒定的相關報道。通過將東鄉(xiāng)野生稻中克隆到的MYB轉錄因子LOC_Os01g62410-DX與水稻中已報道過的的所有MYB轉錄因子進行系統進化分析，發(fā)現LOC_Os01g62410-DX基因與水稻MYB 轉錄因子Osmyb3和Osmyb4基因具有最近的親緣關系，已有報道表明過量表達水稻Osmyb4基因可以明顯增強擬南芥轉基因植株的耐寒能力，且在Osmyb4的過量表達轉基因擬南芥植株中，一些位于冷脅迫應答通路中的基因的表達也發(fā)生了改變[19-20]，表明Osmyb4在植物耐冷性調控過程中扮演了一個總開關的作用。這暗示LOC_Os01g62410-DX基因在水稻冷脅迫逆境過程中也可能起重要作用。