宋朋杰，武小虎，張世棟，王東升，楊 潔，李亞娟，邵 丹，沈文祥，蔣 威，嚴(yán)作廷

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院臨床獸醫(yī)學(xué)研究中心，蘭州 730050；2. 廣西大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，南寧 530000)

外感風(fēng)熱從中獸醫(yī)的角度辨證為：風(fēng)熱之邪侵襲肺衛(wèi)，受六淫之邪侵?jǐn)_致衛(wèi)表不和，陰陽失衡，臨床癥狀表現(xiàn)為咽喉腫痛、身熱口渴、糞干便秘等[1]。獸醫(yī)上常用于清熱消炎的化學(xué)藥物有氨基比林、水楊酸、阿司匹林、布洛芬等，但是隨著抗生素和化學(xué)藥物在獸醫(yī)臨床上的大量使用，耐藥性、化學(xué)藥物殘留等弊端日漸突出。中藥具有提高動(dòng)物免疫力、低耐藥、環(huán)保等特點(diǎn)，在禽的疾病預(yù)防和治療方面越來越受歡迎。魚腥草芩藍(lán)口服液是由魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹和金銀花炮制后制成，魚腥草性寒，味苦辛，具有清熱抗炎、辛涼解表、消腫療瘡的功效[2-3]，黃芩能清熱燥濕、解毒瀉火[4]，板藍(lán)根、連翹和金銀花都具有解毒涼血，消腫利咽的功效[5]。近年來，中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在人類疾病研究方面十分火熱，尤其對(duì)糖尿病、癌癥、心腦血管疾病的研究更為廣泛。但是在獸醫(yī)領(lǐng)域的研究還很少見。本研究利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)從整體上認(rèn)識(shí)動(dòng)物疾病，通過基因調(diào)控、蛋白互作、代謝網(wǎng)絡(luò)、信號(hào)傳導(dǎo)等不同層次的分析來探究魚腥草芩藍(lán)口服液對(duì)禽病預(yù)防和治療的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 魚腥草芩藍(lán)口服液活性化合物的篩選以及活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

在TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中檢索魚腥草芩藍(lán)口服液全方(魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、金銀花、連翹)5味藥所有化學(xué)成分，設(shè)置成藥相似性(DL)≥0.18，口服生物利用度(OB)≥50%，篩選出活性較好的化合物，并檢索每個(gè)化合物所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建魚腥草芩藍(lán)口服液化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 魚腥草芩藍(lán)口服液-禽蛋白互作圖構(gòu)建

通過TCMSP檢索魚腥草芩藍(lán)口服液有效化合物成分在禽體內(nèi)作用的靶點(diǎn)蛋白，將靶點(diǎn)蛋白上傳至在線軟件String(https://string-db.org/)，將物種選擇為禽，分值設(shè)置為大于0.7，構(gòu)建成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步了解魚腥草芩藍(lán)口服液中有效成分在禽體內(nèi)的作用機(jī)制。

1.3 魚腥草芩藍(lán)口服液-禽靶基因富集分析及KEGG信號(hào)通路圖的構(gòu)建

通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為基因名，將魚腥草芩藍(lán)口服液靶點(diǎn)蛋白基因上傳至在線軟件DAVID 6.7，物種選擇為禽。通過GO富集分析和KEEG通路分析解析PPI網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)蛋白在基因功能和信號(hào)通路中的作用，從而進(jìn)一步了解魚腥草芩藍(lán)口服液的清熱抗炎機(jī)制。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效化合物篩選結(jié)果

利用TCMSP從魚腥草芩藍(lán)口服液已知的748種化合物中篩選出符合條件的化合物43種。將閾值設(shè)為OB≥50%、DL≥0.18，從魚腥草50種化合物中共篩選出7種，從黃芩143種化合物中篩選出7種，從板藍(lán)根169種化合物中篩選出13種，從金銀花236種化合物中篩選出6種，從連翹150種化合物中篩選出10種。除去相同化合物以及沒有作用靶點(diǎn)的化合物，根據(jù)化合物和靶點(diǎn)作用的關(guān)系最終篩選出24種化合物(表1)。除去相同靶點(diǎn)，24種化合物所作用的靶點(diǎn)有79個(gè)(表2)。用所篩選的化合物及其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)構(gòu)建靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。結(jié)果共發(fā)現(xiàn)108個(gè)節(jié)點(diǎn)，352條邊，其中每個(gè)節(jié)點(diǎn)相連線路的條數(shù)表示節(jié)點(diǎn)的度。其中前列腺素合酶G/H、熱休克蛋白HSP90、蛋白激酶A催化亞單位(PKA)mRNA、鈣調(diào)蛋白、二肽基肽酶、鈉通道蛋白5亞基等度相對(duì)較大。從化合物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析可見前列腺素合酶、熱休克蛋白等有效成分可以與網(wǎng)絡(luò)圖中的多個(gè)靶點(diǎn)相互作用，表明在清熱和抗炎方面起到關(guān)鍵作用。

表1 魚腥草芩藍(lán)口服液部分活性化合物Table 1 Partially active compounds of Yuxingcao Qinlan Oral Liquid

表2 魚腥草芩藍(lán)口服液活性化合物作用的靶點(diǎn)Table 2 Targets of active compounds in Yuxingcao Qinlan Oral Liquid

圖中數(shù)所代表的化合物同表 2 The number is the same table 2

2.2 魚腥草芩藍(lán)口服液清熱抗炎關(guān)鍵蛋白網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

為了更好地分析魚腥草芩藍(lán)口服液中化合物作用靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用，利用String軟件構(gòu)建魚腥草芩藍(lán)口服液成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)所有蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行評(píng)分，篩選出評(píng)分值大于0.7的高置信蛋白關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。共篩選出39個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)和32條蛋白間的作用關(guān)系，其中HSP90AA1、ESR1、ESR2、NCOA1、NCOA2蛋白出現(xiàn)頻率較高，說明其在禽清熱抗炎過程中起關(guān)鍵作用。熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)在機(jī)體處于高熱等惡劣環(huán)境中時(shí)會(huì)大量表達(dá)從而維持機(jī)體的正常體溫[6]，已有研究表明，細(xì)胞表面蛋白HSP90AA1是一種與禽流感病毒結(jié)合的受體，在禽早期感染中通過HSP90AA1-AKT-MTOR途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[7]。ESR1蛋白和ESR2蛋白是雌激素受體[8]，NCOA1蛋白和NCOA2蛋白屬于類固醇激素受體超家族[9]，在人醫(yī)臨床上，雌激素被廣泛用于治療更年期潮熱，魚腥草芩藍(lán)口服液清熱抗炎機(jī)制可能是通過作用于中樞神經(jīng)元的雌激素膜受體，增加體溫調(diào)節(jié)中樞的其他神經(jīng)元對(duì)體溫進(jìn)行調(diào)節(jié)[10]。通過PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因富集分析發(fā)現(xiàn)，魚腥草芩藍(lán)口服液通過調(diào)節(jié)血管直徑、血液循環(huán)、化學(xué)突觸傳遞、細(xì)胞增殖、信號(hào)受體活動(dòng)、神經(jīng)遞質(zhì)受體活動(dòng)、雌激素受體活動(dòng)、突觸后膜傳遞、細(xì)胞連接、受體復(fù)合物等途徑達(dá)到對(duì)禽的清熱抗炎 作用。

圖2 魚腥草芩藍(lán)口服液成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network of Yuxingcao Qinlan Oral Liquid related birds targets

2.3 魚腥草芩藍(lán)口服液-禽靶基因富集分析及KEGG信號(hào)通路圖的構(gòu)建

為了更好地了解魚腥草芩藍(lán)口服液的清熱抗炎機(jī)制，將PPI網(wǎng)絡(luò)圖中蛋白質(zhì)的編碼基因上傳至在線軟件DAVID，進(jìn)行GO富集分析和KEEG通路分析，最后得到與生物過程相關(guān)的GO條目64個(gè)(FDR<0.05)，分別為：DNA依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控(Regulation of transcription,DNA-dependent)、RNA代謝調(diào)控(Regulation of RNA metabolic process)、G蛋白偶聯(lián)受體蛋白信號(hào)通路(G-protein coupled receptor protein signaling pathway)、受體配體間相互作用(Uroactive ligand-receptor interaction)等，與分子功能相關(guān)的GO條目17個(gè)(FDR<0.024)，分別為：腺嘌呤核苷酸結(jié)合(Adenyl nucleotide binding)、嘌呤核苷酸結(jié)合(Purine nucleoside binding)、核苷結(jié)合(Nucleoside binding)等，與細(xì)胞成分相關(guān)的GO條目4個(gè)(FDR<0.41)分別為：細(xì)胞質(zhì)膜(Plasma membrane)、細(xì)胞碎片(Cell fraction)等(圖3)?；驍?shù)量排名靠前的富集分析通路有：細(xì)胞表面受體連接信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Cell surface receptor linked signal transduction)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Regulation of transcription)、RNA代謝過程調(diào)控(Regulation of RNA metabolic process)等。KEGG分析得到5條信號(hào)調(diào)控通路，分別為血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路(圖4)、禽孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路(圖5)、禽神經(jīng)細(xì)胞膜配體-受體相互作用通路、鈣信號(hào)通路和NOD樣受體信號(hào)通路。如圖4所示，在血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGFR)與血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)結(jié)合后激活胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、磷酸脂酶C-γ (PLC-γ)、局部粘著斑激酶(FAK)和樁蛋白(PAXILLIN)。PLC-γ使蛋白激酶(PKC)、絲/蘇氨酸蛋白激酶(Raf-1)、分裂原活化抑制劑(MEK)磷酸化，最終產(chǎn)生前列環(huán)素(PGI2)，PGI2既能舒張血管也能抑制血栓的形成，PGI2可能調(diào)控禽體內(nèi)的清熱過程。PI3K-AKt在很多細(xì)胞活動(dòng)中都起到關(guān)鍵性的作用，Akt級(jí)聯(lián)反應(yīng)可以被許多機(jī)制激活[11]。PI3K直接結(jié)合G蛋白βγ二聚體而激活，PI3K的活化很大程度上參與到靠近其質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的底物，例如：成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管位蛋白I(Ang1)，PI3K活化后通過三磷酸肌醇(PIP3)激活A(yù)kt-PKB通路，調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞[12]，促進(jìn)淋巴管和血管的生成來達(dá)到清熱抗炎的目的。KEEG分析禽孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路(圖5)，類胰島素一號(hào)增長因子(IGF-1)和胰島素(Insulin)與胰島素樣生長因子1受體(IGF1R)結(jié)合激活PI3K ，蛋白激酶(PKA)的表達(dá)受到抑制，Mos、MEK1、MAPK、Rsk1/2磷酸抑制Myt1的表達(dá)，促使生發(fā)泡破裂(GVBD)。生發(fā)泡破裂是卵細(xì)胞發(fā)育過程中的一步，它標(biāo)志著卵細(xì)胞的成熟。IGF-1是一種多肽，具有降血糖、舒張血管、促細(xì)胞分化等功能[13]，IGF-1可能調(diào)控禽體內(nèi)的清熱抗炎過程。

圖3 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)GO富集分析生物過程及其對(duì)應(yīng)的基因數(shù)Fig.3 The count of genes and biological process

圖4 KEEG分析禽血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)通路Fig.4 Avian vascular endothelial growth factor signaling pathway

圖5 KEEG分析禽孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路Fig.5 Avian progesterone-mediated oocyte maturation pathway

3 討 論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)針對(duì)中藥多成分多靶點(diǎn)提供新的用藥方向，從分子層面揭示中藥的作用機(jī)制。在中醫(yī)上，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測中藥在特定疾病上的作用機(jī)制已很常見，黃啟和等[14]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分子對(duì)接技術(shù)篩選出延胡索中抗心肌缺血的季銨堿類化合物黃連堿、巴馬汀、去氫紫堇鱗莖堿、藥根堿等以及黃酮類化合物槲皮素，陳凱等[15]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了新型抗高血壓心肌纖維化的中藥復(fù)方。但是在中獸醫(yī)臨床上利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測中藥在動(dòng)物體內(nèi)的相關(guān)作用機(jī)制還很少見。白東東等[16]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測白頭翁湯可能通過腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素受體信號(hào)通路、類固醇結(jié)合、神經(jīng)配體-受體相互作用來治療豬腹瀉。董朕等[17]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析推測歸芪益母湯可能通過細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶反應(yīng)等生物過程來調(diào)控牛胎衣不下、產(chǎn)后氣血兩虛癥。魚腥草芩藍(lán)口服液組方中主要通過黃芩黃酮Ⅱ、依靛藍(lán)酮、連翹醇等來發(fā)揮作用，已有研究顯示，黃芩黃酮Ⅱ具有廣泛的清熱燥濕、瀉火解毒功效[18]，依靛藍(lán)酮能清除次黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧化物[19-20]，抑制嗜中性粒細(xì)胞和血小板釋放有害物質(zhì)，提高機(jī)體免疫力[21]，還具有抗病毒清熱抗炎的功效[22]，連翹醇能抗炎清熱[23-24]，抑制TE-13細(xì)胞的增殖、降低線粒體膜電位[25]，通過JAK/STAT和ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[26]。綜上所述，魚腥草芩藍(lán)口服液通過多種化合物的多種靶點(diǎn)多通路共同實(shí)現(xiàn)清熱抗炎的作用，且多種化合物均具有抗病毒抗癌的作用，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析對(duì)其以后的藥理作用研究提供新的方向。

基于魚腥草芩藍(lán)口服液的清熱抗炎作用，本研究通過對(duì)魚腥草芩藍(lán)口服液有效活性成分的篩選、有效成分-靶點(diǎn)分析、基因富集分析、KEEG通路分析，解析其在禽體內(nèi)的清熱抗炎機(jī)制，共篩選出24種有效成分，有效成分作用的靶點(diǎn)79個(gè)，85個(gè)GO條目，5條KEEG通路，繪制出有效成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)、成分靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。不同的成分對(duì)應(yīng)不同的靶點(diǎn)，發(fā)揮不同的藥效，通過可視化網(wǎng)絡(luò)從整體上揭示復(fù)方中重要活性成分在治療疾病過程中可能存在的作用機(jī)制。

中獸醫(yī)從整體考慮，辨證論治，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從魚腥草芩藍(lán)口服液的所有有效成分出發(fā)，整體分析中藥在動(dòng)物體內(nèi)的作用，為中藥復(fù)方復(fù)雜多樣的有效成分提供新的預(yù)測方法，這種分析方式與中藥整體辨證論治的思想相吻合。本研究初步揭示了魚腥草芩藍(lán)口服液清熱抗炎的潛在活性成分及其可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入探討魚腥草芩藍(lán)口服液中有效成分的清熱抗炎機(jī)制奠定基礎(chǔ)。其具體作用機(jī)制還需通過細(xì)胞水平、動(dòng)物試驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)室分子檢測等多種技術(shù)手段進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建魚腥草芩藍(lán)口服液對(duì)禽類清熱抗炎的化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)模型，分析發(fā)現(xiàn)魚腥草芩藍(lán)口服液可能通過卵母細(xì)胞成熟、禽神經(jīng)細(xì)胞膜配體-受體信號(hào)調(diào)節(jié)、血管內(nèi)皮生長因子信號(hào)調(diào)節(jié)等機(jī)制來調(diào)控禽體溫和炎癥反應(yīng)。